抗CD3单链抗体基因克隆表达及生物活性鉴定.doc

抗CD3单链抗体基因克隆表达及生物活性鉴定 【关键词】 单链抗体 【关键词】 CD3分子； 单链抗体 【Abstract】 The genes encoding antibody heavy and light chain variable regions (VH and VL) were cloned by RTPCR from OKT3 hybridoma cells, which produced antiCD3 moleclonal antibody. The VH and VL genes were fused and become a single chain Fv (scFv). The scFv gene was cloned into pCANTAB5E vector and expressed on bacterial phage surface. By three panning rounds, we have obtained two singlechain antibodys that specific for CD3. The antiCD3 scFv will be a reagent for diagnosis and therapy of immunodisorder 1 实验资料 杂交瘤细胞OKT3来自ATCC.质粒 pCANTAB5E，大肠杆菌TG1和HB2151，内切酶SfiI和NotI, 可变区引物均购自Pharmacia公司.Taq DNA聚合酶，mRNA磁性分离试剂盒购自Promega公司.以分泌抗CD3单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞OKT3为原始材料，采用Promega公司试剂盒，从大约107细胞中分离和纯化mRNA，合成cDNA第一链.通过RTPCR分别扩增出重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因. 为了加强抗体轻、重链可变区（Fv）的稳定性和更好地维持抗体分子内结合抗原区的空间构象，在VH和VL基因之间用一段编码(Gly4Ser)3的DNA序列把二者连接起来, 构成抗体可变区单链融合基因.为了把单链抗体基因插入pCANTAB5E 质粒，我们以单链抗体基因为模板，引入一对含SfiI和 NotI 酶切位点的引物， 再次 PCR 扩增.扩增产物Mr约720，基因大小与预测的单链抗体基因相符合（图1）.把单链抗体基因插入到表达载体pCANTAB5E所含的噬菌体外壳蛋白g3p基因中. 转化大肠杆菌TG1感受态细胞后，在辅助噬菌体M13K07的作用下，单链抗体和外壳蛋白g3p以融合蛋白的形式表达于噬菌体的表面，形成一个抗CD3单链抗体文库.以外周血单核细胞为抗原，用ELISA方法鉴定噬菌体抗体的免疫活性.首先用细胞分离液分离外周血T细胞，然后包被在经多聚赖氨酸处理过的96孔酶联板上.分别与重组噬菌体抗体温育1 h,用PBS淋洗3次后，加入HRP标记的抗M13噬菌体抗体温育1 h, 再用PBS淋洗3次，加入底物进行颜色反应.用酶标仪在490nm处检测每孔的吸收值.挑选阳性克隆，感染大肠杆菌，获得培养上清，再进行免疫活性鉴定.经过三轮亲合感染扩增的免疫筛选过程，使CD3重组噬菌体抗体得到富极. 随机挑选12个重组噬菌体抗体克隆进行ELISA检测.从中选出免疫活性最强的两株阳性克隆.把这两株阳性克隆的基因转入大肠杆菌HB2151，经IPTG 诱导培养后，可在上清中收集可容性单链抗体.ELISA进一步证明该抗体能够特异识别外周血单核细胞和淋巴母细胞性白血病细胞，而不结合黑色素瘤细胞和人宫颈癌细胞(图2).说明单链抗体保留了原单克隆抗体的抗原特异性. 1:1 kb标准分子量；2:抗体VL基因PCR扩增产物；3：重组质粒经XbaI和BamHI双酶切，鉴定VL基因；4：抗体VH基因PCR扩增产物；5：重组质粒经Xho和Hind双酶切，鉴定VH基因. 图1 琼脂糖凝胶分析PCR产物和重组载体酶切产物鉴定（略） 可溶性单链抗体结合外周血单核细胞（PBC）和淋巴母细胞性白血病细胞（MOLT4），但不结合黑色素瘤细胞（A375）和人宫颈癌细胞（Hela）. 图2 ELISA检测单链抗体免疫活性（略） 2 讨论 单链抗体被认为是具有抗原结合能力的最小功能单位1.它在某些应用方面比完整抗体具有更多的优越性，如免疫原性较小，组织渗透性好, 在组织和血液中的清除率快，容易与其他功能分子重组，形成多功能抗体2-4.另外，单链抗体能够在原核系统中高效表达，有利于大批量生产.CD3分子是T淋巴细胞膜上特有的重要信号分子之一 5，6.抗CD3单链抗体与其他功能分子结合所形成的双功能抗体在免疫调节和肿瘤治疗方面以显示出良好的应用前景7，8.我们构建了抗CD3单链抗体基因，利用噬菌体展示技术表达单链抗体，通过免疫筛选，获得CD3特异基因工程抗体.该抗体为双功能抗体和重组免疫毒素的研制打下了基础. 【参考文献】 Kuroki M, Arakawa F, Khare PD, Kuroki M, Liao S, Matsumoto H, Abe H, Imakiire T.Specific targeting strategies of cancer gene therapy using a singlechain variable fragment (scFv) with a high affinity for CEAJ. Anticancer Res, 2000;20(6A):4067-4071. 2 Takemura S, Asano R, Tsumoto K, Ebara S, Sakurai N, Katayose Y, Kodama H, Yoshida H, Suzuki M, Imai K, Matsuno S, Kudo T, Kumagai I. Construction of a diabody (small recombinant bispecific antibody) using a refolding systemJ. Protein Eng, 2000 ;13(8):583-588. 3 Weetall M, Digan ME, Hugo R, Mathew S, Hopf C, TartRisher N, Zhang J, Shi V, Fu F, HammondMcKibben D, West S, Brack R, Brinkmann V, Bergman R, Neville D Jr, Lake P.Tcell depletion and graft survival induced by antihuman CD3 immunotoxins in human CD3 epsilon transgenic miceJ.Transplantation, 2002;73(10):1658-1666. 4 Hexham JM, Dudas D, Hugo R, Thompson J, King V, Dowling C, Neville DM Jr, Digan ME, Lake P. Influence of relative binding affinity on efficacy in a panel of antiCD3 scFv immunotoxinsJ.Mol Immunol, 2001;38(5):397-408. 5 Hombach A, Wieczarkowiecz A, Marquardt T, Heuser C, Usai L, Pohl C, Seliger B, Abken H. Tumorspecific T cell activation by recombinant immunoreceptors: CD3 zeta signaling and CD28 costimulation are simultaneously required for efficient IL2 secretion and can be integrated into one combined CD28/CD3 zeta signaling receptor moleculeJ.J Immunol, 2001;167(11):6123-6131. 6 张文霁,韩泉洪，惠延年，马吉献. 增生性玻璃体视网膜病变组织中的T淋巴细胞与HLADR抗原J.第四军医大学学报,2001；22(10)：916-918. 7 Wuest T, Moosmayer D, Pfizenmaier K.Construction of a bispecific single chain antibody for recrui