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氯胺酮诱导大鼠丘脑基因表达谱的改变 作者：马加海，徐礼鲜，王惠霞，张惠，周丽华【关键词】 氯胺酮；,基因芯片；,基因表达谱；,丘脑；,大鼠Alteration of gene expression profile in rat thalamus induced by ketamine【Abstract】 AIM: To have more insight into the alteration of gene expression profile in rat thalamus anesthetized with ketamine using gene chip. METHODS: Four SD rats were randomly divided into 2 groups: control group administered intraperitoneally with 0.9% saline, and ketamine group with 100 mg/kg ketamine. One hour later, thalamus was dissected and the total RNA was isolated. cDNA was amplified through reverse transcription reaction. Biotinlabeled cRNA was synthesized using cDNA as template. After purification and fragmentation, the cDNA was hybridized with rat neurobiology U34 gene chips. Chips were scanned and genes were analyzed using Microarray Suite Version 5.0 software. Differentially expressed genes were classified according to their biological function. RESULTS: Among the total 1323 probes detected, 237 genes showed differential expression in ketamine group. The expression level of 132 genes increased and 105 genes decreased, and 59 genes among them had the expression level alteration over 2 times. The differentially expressed genes were mainly classified into ion channels, signal transduction, transcription factors and cytokines. CONCLUSION: Ketamine can induce the significant alteration of gene expression profile of thalamus in rats.【Keywords】 ketamine; gene chip; gene expression profile; thalamus【摘要】 目的: 用基因芯片研究氯胺酮麻醉大鼠丘脑基因表达谱的变化. 方法: SD大鼠4只，分为对照组(n=2)和氯胺酮组(n=2). 两组大鼠分别腹腔注射生理盐水或100 mg/kg氯胺酮. 1 h后，取丘脑，抽提RNA，以RNA为模板逆转录合成cDNA，以cDNA为模板转录生物素标记的cRNA，cRNA经提纯、片断化后与大鼠神经生物学表达芯片U34杂交. 杂交后的芯片用扫描仪检测信号，收集图像，用Microarray Suite Version 5.0软件分析差异表达基因并对其进行功能分析. 结果: 1323条待测基因中，氯胺酮麻醉后237条基因差异表达，上调表达132条，下调表达105条，其中差异表达超过两倍的为59条. 差异性表达的基因功能可分为NMDA受体、离子通道、信号转导、转录因子、细胞因子等. 结论: 氯胺酮麻醉可以引起大鼠丘脑基因的差异表达.【关键词】 氯胺酮；基因芯片；基因表达谱；丘脑；大鼠0引言氯胺酮具有催眠、镇痛作用，在麻醉药中一直享有独特的地位，但其中枢作用机制仍然不明确. 丘脑是外周伤害性信息传递和整合的主要中枢部位之一. 目前认为氯胺酮主要作用部位在弥散的丘脑新皮质系统，使通过非特异性网状结构和丘脑的传入冲动产生功能性阻滞1. 基因芯片技术集计算机科学、分子生物学、统计学、激光技术等多学科于一体，具有高通量、并行性和快速准确的优点，已应用于药物作用靶位和机理的研究2. 本研究运用基因芯片研究氯胺酮麻醉大鼠丘脑基因表达谱的变化，旨在进一步探讨氯胺酮的中枢神经系统作用机制.1材料和方法1.1材料成年健康雌性SD大鼠4只, 体质量195223 g，由第四军医大学实验动物中心提供. 实验前将大鼠放置在安静、避强光的环境中饲养48 h以上, 随机分为对照组和氯胺酮组，每组2只. 氯胺酮组大鼠腹腔注射100 mg/kg氯胺酮，对照组大鼠腹腔注射同等体积的生理盐水. RNAlater, RNeasy（Qiagen公司）；测试芯片Test3，芯片U34，G2500AGeneArray Scanner，Microarray Suite Version 5.0软件（Affymetrix公司）；TRIzol Reagent试剂盒（Invitrogen公司）.1.2方法1.2.1取材腹腔注射1 h后，大鼠断颈处死，取全脑组织，置于冰上，切取丘脑，切成0.30.5 cm小块，置于盛有RNAlater的冻存管中，-20保存.1.2.2RNA抽提，探针制备和芯片杂交用TRIzol Reagent试剂盒抽提丘脑组织总RNA；以RNA为模板，合成单链及双链cDNA；再以双链cDNA为模板，体外转录合成生物素标记的cRNA；cRNA用RNeasy试剂盒纯化后，进行片段化处理，而后与测试芯片Test3预杂交进行质控；符合要求后分别与两张大鼠神经生物学表达芯片U34杂交；洗脱处理后染色，以G2500AGeneArray Scanner扫描检测信号，收集图像.1.2.3芯片数据分析两组基因的差异性表达用两张芯片上对应探针之间的荧光信号强度比值的对数（signal log ratio，SLR）表示，SLR表示氯胺酮组较对照组某基因表达上调或下调倍数的以2为底的对数值.2结果对照组大鼠活动自如，氯胺酮组大鼠注射氯胺酮后，翻正反射消失，至取材时仍未恢复. 在本实验条件下，氯胺酮组和对照组分别有647条,692条基因表达，分别占芯片上探针总数（1323）的48.9%和52.3%. 与对照组相比，氯胺酮麻醉后237条基因差异表达，其中上调表达132条，占总探针数的9.9%，上调等于或超过两倍的为43条；表达下调的基因为105条，占总探针数的8.0%; 等于或超过两倍（SLR2）的为16条(表1). 按基因的主要功能，这些差异性表达的基因可分为NMDA受体等离子通道基因、信号转导相关基因、神经元相关基因、转录相关基因、细胞因子基因、凋亡相关基因等.3讨论基因芯片又称DNA微探针阵列(DNA microarray)，是在固体基片表面上集成已知序列的基因探针(cDNA或寡核苷酸)，被测生物细胞或组织中大量标记的核酸序列与上述探针阵列进行杂交，通过检测杂交探针的位置，实现基因信息的快速检测. 该技术已应用于药物前体筛选、药效和毒性评价、药物代谢的研究，尤其是药物作用靶位的确定和作用机制的研究3. Chong4用该技术研究注射氟哌利多28 d后大鼠纹状体的基因表达谱，发现待研究的1176条基因中，包括谷氨酸受体,钠通道,RasGTP酶等的14条基因的表达有显著性差异. Loguinov5 用芯片研究吗啡作用机制，发现大鼠腹腔单次注射10 mg/kg吗啡后30，120 min，纹状体和脊髓中某些基因具有显著性表达差异，通过对基因表达数据的聚类和功能分析，确认了介导吗啡作用的38条已知基因和16条未知基因，认为基因芯片对研究药物中枢神经系统的神经转导通路具有重要意义.表1氯胺酮诱导大鼠丘脑表达变化的基因（略）目前，全麻药在中枢神经系统的确切部位和作用机制仍不清楚6. 丘脑作为感觉传入通路中重要的中继站，在感觉传入、痛觉调控及意识维持上有相当重要的作用7. 脑功能成像和我们前期研究结果表明，丘脑是麻醉药发挥作用的主要靶位1,8. Affymetrix基因芯片采用了原位光刻合成技术和PMMM探针技术，是目前公认的最先进、最可靠的基因芯片平台9. 本研究采用的大鼠神经生物学表达芯片U34涵盖多种与神经生物学研究领域相关的基因序列，含有1323条探针组合，每条探针组合代表一个已知基因或一个表达序列标签. 对差异性表达的基因进行生物学功能分析可发现，基因主要涉及NMDA受体等离子通道、信号转导、转录因子、细胞因子、凋亡等. 氯胺酮的主要作用机制是对中枢NMDA受体的非竞争性阻滞10. 本研究中发现，氯胺酮可诱导NOS,谷氨酸受体等NMDA受体基因差异表达. 研究认为，氯胺酮还可作用于乙酰胆碱,5羟色胺和阿片等G蛋白耦联受体，同时还可抑制单胺类神经递质的再摄取，可逆性地抑制电压门控性Ca2+, Na+通道11-13. 研究证实，氯胺酮可诱导cfos mRNA和蛋白在脑内表达14，本研究证实了这一点. 我们认为，以G蛋白为核心的信号转导中的每个步骤都可能是全麻药的作用部位.许多报道证实氯胺酮对炎性反应中的炎性因子TNF，ILl,6均有抑制作用，同时又能增加抗炎因子的表达，从而对感染或非感染时炎性反应造成的组织器官的损害有保护作用，显示了氯胺酮麻醉镇痛作用以外的新用途15. 本研究发现，氯胺酮麻醉后，胰岛素样生长因子（X17960,X16703）,白介素1,15（M98820,U69272）,凋亡相关基因（D83697）,肿瘤坏死基因（E02468）和功能不明确的基因（D14988,D12524,AI045501,AI228113）差异表达，这些基因是否介导了氯胺酮的新用途及其在麻醉中的作用有待进一步研究. 本研究发现氯胺酮麻醉可引起大鼠丘脑众多基因差异表达，验证了文献报道的氯胺酮可能的作用位点并发现了一些新的作用位点，若能得到氯胺酮多个剂量和不同作用时间基因表达谱，对数据进行聚类等分析，可深入了解氯胺酮作用的靶分子和神经通路.【参考文献】1Langsjo JW, Maksimow A, Salmi E, et al. Sketamine anesthesia increases cerebral blood flow in excess of the metabolic needs in humansJ. Anesthesiology,2005,103(2):258-268.2Griffin RS. 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