淤血肠神经组织MAP2、CAD和S100表达及意义.doc

淤血肠神经组织MAP2、CAD和S100表达及意义【摘要】 目的 建立兔肠淤血模型,观察微管相关蛋白(MAP2)、S100蛋白(S100)与组织蛋白酶D(CAD)在肠淤血模型肠神经组织中的表达,探讨其在肠淤血发生、发展中的作用。方法 利用夹闭门静脉的方法制作肠淤血动物模型,应用免疫组织化学的方法观察正常组、对照组、实验组中小肠壁肠神经组织中MAP2、S100、CAD的表达情况。结果 实验组MAP2、S100的表达高于正常组及对照组；CAD的表达低于正常组及对照组,差别有统计学意义(t=2.2565.542,P<0.05、0.01)。结论 肠淤血状态导致的肠缺血、低氧以及代谢产物和毒素的堆积，可导致肠道神经元数量减少；肠淤血造成的缺血、低氧状态也激发了神经纤维的再生。 【关键词】 肠淤血 微管相关蛋白质类 S100蛋白质类 组织蛋白酶D 兔 ABSTRACT Objective To study the expression of MAP2,S100 and CAD in nerve tissue of a congestive intestine model and discuss their impact on its development. Methods The model was made by clamping the portal vein, the expression of MAP2,S100 and CAD in nerve tissue of smallintestine wall in the model, normal control and experimental group was detected by immunohistochemistry technique. Results In the experimental, the expression of MAP2 and S100 was significantly higher than that of the control and normal groups, while CAD was lower than that of the two groups (t=2.256-5.542;P<0.05,0.01).Conclusion Intestinal congestion results in ischemia of intestine, hypoxia, and accumulation of metabolic product and toxin, leading to decrease of amount of neuron and,on the other hand, intestinal congestion stimulates regeneration of neve fibers. KEY WORDS Congestion of intestine; Microtubuleassociated proteins; S100 proteins; Cathepsin D; Rabbits 胃肠运动主要受两方面因素的调节:一是神经系统，二是体液因素1。胃肠道运动功能（如小肠的分节运动以及蠕动）主要受局部的肠神经系统调节，而对中枢神经系统具有相对独立性。肠神经系统的缺乏或功能异常，则导致胃肠道功能紊乱2。有证据显示，在肠道感染状态下，肠神经元可表现为神经元数目和神经元内化学递质的改变、神经元兴奋性的增加等3。而肠淤血是众多肠道疾病共有的病理学改变，可造成肠道运动功能、肠道微循环、肠黏膜屏障等方面的损害4。本实验应用免疫组织化学的方法，观察肠神经组织中微管相关蛋白（MAP2）、组织蛋白酶D（CAD）和S100蛋白（S100）表达的变化，以期阐明肠淤血状态下肠神经元的改变，为临床相关疾病的诊断、治疗提供依据。 1 材料和方法 1.1 实验材料 健康纯种新西兰大白兔30只，随机分为实验组、对照组及正常组，每组10只。采用100 g/L水合氯醛（0.3 mL/100 g体质量）腹腔注射麻醉。依次切开皮肤、皮下、腹膜，暴露门静脉，以显微手术用无损伤动脉夹夹闭门静脉入肝处。无菌生理盐水纱布覆盖切口，旁照灯照射保暖。1 h后松开动脉夹恢复血流，依次关闭切口。对照组进行同样操作但不夹闭门静脉。正常组不作任何处理。12 h后处死动物，取距胃幽门部15 cm处小肠组织1 cm1 cm。 1.2 免疫组化染色 标本经40 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，切片厚度为4 m。行MAP2、CAD、S100 免疫组化染色。鼠抗兔微管蛋白抗体、鼠抗兔CAD抗体、鼠抗兔S100抗体、羊抗兔二抗免疫组化试剂盒及DAB 显色剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。观察正常组、对照组及实验组肠壁中神经节细胞、神经胶质细胞及神经纤维的染色结果。 1.3 统计学处理 用SamplPCI图像分析系统进行半定量分析，对所得数据进行t检验。 2 结果 2.1 MAP2免疫组化染色 各组中均可见阳性细胞，但正常组阳性细胞染色相对较浅；对照组和正常组差别不大；实验组可见大量染色阳性细胞。用SamplPCI图像分析系统对免疫阳性细胞进行半定量分析，正常组平均吸光度值为0.0690.027，对照组为0.0750.064，实验组为0.1580.043，实验组平均吸光度值高于对照组和正常组，差异均有显著性(t=3.404、5.542,P<0.01)。 2.2 S100免疫组化染色 在正常组中可见到在阳性染色的神经丛中有一种特征性形态，表现为深染的神经丛中有细胞状“空白区”。正常组、对照组染色阳性细胞的差别不大。但在实验组中这种现象很少见到，而表现为密集S100阳性染色的神经丛中鲜有“空白区”出现。用SamplPCI图像分析系统对免疫阳性细胞进行半定量分析，正常组平均吸光度值为0.1170.043，对照组为0.1210.043，实验组为0.1580.029，实验组S100表达明显增强，与正常组和对照组比较差异均有显著性(t=2.500、2.256,P<0.05)。 2.3 CAD免疫组化染色 三组肠壁肌间与黏膜下层神经丛中均可见CAD阳性染色的细胞，肌间神经丛内神经节细胞着色强于黏膜下神经丛。实验组中的阳性细胞数要少于正常组和对照组；而正常组和对照组之间差别不大。用SamplPCI图像分析系统对免疫阳性细胞进行半定量分析，正常组平均吸光度值为0.0960.030，对照组为0.0940.030，实验组为0.0600.035，实验组平均吸光度值低于对照组和正常组，差异均有显著性(t=2.332、2.469,P<0.05)。 3 讨论 3.1 肠神经系统对胃肠功能的作用 胃肠道壁内神经系统是具有调节控制胃肠道功能的独立整合系统。它在结构和功能上不同于交感和副交感神经系统，而与中枢神经系统相类似，但仍属于自主神经系统的一个组成部分。肠神经系统内的神经元是多种多样的，具体可分为运动神经元、分泌神经元、感受神经元、中间神经元等；肠神经系统的神经元还可以合成多种脑肠肽，在胃肠功能的调节上发挥着不同的作用8。目前已有多项实验证明，肠神经系统神经元的数量异常或功能改变是肠疾病中胃肠功能改变的主要病理机制。如食管失弛缓症，是由于病人下食管括约肌含血管活性肠肽（VIP）神经元显著减少或缺乏所致，其血中VIP浓度也较低9；先天性巨结肠病人结肠和直肠病变是由于肠VIP神经元的缺乏所致。 3.2 MAP2、S100和CAD检测的意义 本实验用MAP2、S100、CAD对肠神经进行免疫组化染色，结果显示，实验组MAP2、S100表达高于正常组及对照组，CAD的表达要低于正常组及实验组，而正常组和实验组三者的表达均无明显差别。 微管相关蛋白是构成神经细胞骨架的重要蛋白，参与形成细胞内的丝网状结构，维持细胞形态，是组成神经元骨架的重要组成成分和原始神经上皮中所表达的最早的神经元标志物之一，是神经细胞的重要标记物，被广泛应用于神经生物学研究5。微管相关蛋白主要应用于中枢神经系统及周围神经系统病变的研究中，关于其在肠道神经系统病变中的表达的文献还不多，但作者认为肠神经系统虽被称为独立于中枢神经，但其基本组成并没有改变，微管相关蛋白作为神经细胞骨架的重要蛋白在肠神经细胞中也应有表达。本实验中实验组MAP2表达较正常组及对照组明显增强，证实微管相关蛋白的表达在肠神经系统与中枢神经类似，微管相关蛋白不仅在神经细胞中表达，在神经纤维及神经胶质细胞中也有表达，肠淤血时缺血低氧的状态可刺激肠道神经纤维再生，是可能导致MAP2反应性表达增强的原因。 S100是一组可溶性、低分子质量、高酸性蛋白，属神经胶质细胞特异性蛋白，亦可存在于神经纤维中6。S100有对神经丛中神经纤维和胶质细胞表达为阳性染色，但在神经元中不表达的特性。研究肠神经系统的形态特征及结构特征发现，S100有良好的表达功能。陈卫坚等10就曾报道先天性巨结肠狭窄段S100表达明显增强，S100的异常表达被证实是肠神经系统发育异常的主要病理改变之一。本实验证实肠淤血时S100表达也明显增强，表明S100的异常表达可能也是肠淤血时肠道神经系统的重要病理改变之一，另根据其S100对神经节细胞阴性表达，对神经纤维及神经胶质细胞阳性表达的特性，S100 在实验组中表达的异常升高可能与肠淤血所造成的缺血低氧的状态刺激了肠道神经纤维的再生有关。 CAD是一种天冬氨酸酶，属于溶酶体酸性蛋白酶家族，其在细胞内蛋白质的分解代谢中起着关键作用，可催化许多神经肽的降解，如P物质、生长抑素、B脂蛋白和血管紧张素原。由于CAD在人类脑组织神经元、体内神经节细胞中含量丰富，故可作为肠壁神经节细胞的标记7。本实验结果与其他学者研究结果一致，即在肠壁中，CAD的免疫反应性仅局限于神经节细胞，神经纤维和神经胶质细胞均无阳性染色。本实验CAD在实验组中的表达减少可能与肠淤血导致肠缺血、低氧以及代谢产物和毒素的堆积致使肠道神经元数量减少有关；这也与陈卫坚等10、傅聿铭等11针对先天性巨结肠中CAD表达的研究相一致， 证实神经节细胞数量减少是肠道疾病中肠神经系统的主要病变之一。 【参考文献】 1刘凯,齐清会. 胃肠肽受体及受体后信号传导与胃肠动力J. 世界华人消化杂志, 2002,10(12):14451449. 2吴琍, 陈雨历. 肠神经发育不良症J. 齐鲁医学杂志, 2002,17(1)：8789. 3王利华,方秀才,潘国宗,等. 肠道感染与应激对实验兔肠运动功能的影响J. 胃肠病学和肝病学杂志, 2004,13(4):354357. 4江学良,潘伯荣,马景云,等. 世纪之交的消化学回顾与展望J. 世界华人消化杂志, 2000,8(10):11611176. 5BURDEN S J. Wnts as retrograde signals for axon and growth cone differentiationJ. Cell, 2000,100(5):495497. 6吴琍,董茜,杨传民,等. SY及S100蛋白对肠神经发育不良症诊断的价值J. 齐鲁医学杂志, 2001,16(4)：281282. 7张莹,于永发. CAD在缺血神经元损伤中的作用J. 国外医学:脑血管疾病分册, 2003,11(3)：217219. 8DE GIORGIO R, GUERRINI S, BARBARA G, et al. New insights into human enter