诱导型一氧化氮合酶在翼状胬肉中的表达及其意义.doc

诱导型一氧化氮合酶在翼状胬肉中的表达及其意义 作者：颜美荣李正贤刘庚勋周一鸣彭昌福王芳 【摘要】 目的 探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在翼状胬肉中的表达及发病过程中的作用。方法 采用免疫组化Elivision法检测20例翼状胬肉、10例正常结膜中iNOS的表达。结果 20例翼状胬肉中iNOS的阳性表达率为80 %(16/20)，正常结膜中iNOS的阳性表达率为0(0/10)。iNOS阳性表达两组间差异有显著意义，P<0 01。结论 iNOS在翼状胬肉中的高表达，提示iNOS可促进血管形成，可能与翼状胬肉的发生、发展有关。因此，抑制iNOS可望成为治疗翼状胬肉，减少术后复发的新思路。 【关键词】 诱导型一氧化氮合酶；翼状胬肉；血管形成；免疫组织化学 近年来的研究发现, 一氧化氮合酶(NOS)活性的增高与肿瘤血管生成有关1。翼状胬肉的发生发展其发病机制目前仍不十分清楚，翼状胬肉是一组织增生性疾病，以新生的纤维血管组织自球结膜生长侵入角膜为其特点。有细胞异常增殖和凋亡，与肿瘤有相似之处。它的形成、发展和术后复发需要新生血管化参与。翼状胬肉组织中是否存在NOS的高表达，鲜见报道。本研究通过检测翼状胬肉中iNOS的表达水平，探讨iNOS在翼状胬肉发病机制中的作用。1 材料和方法1.1 一般资料选择本院20042005年门诊及住院的20例翼状胬肉患者的手术标本。静止期5例，进行期12例，复发性3例，其中男13例，女7例，年龄3765岁，病程11个月9年；对照组为同期手术的10例正常结膜组织，年龄3562岁，所有病例均无其他角膜、结膜疾患。标本经10%甲醛固定、常规脱水、石蜡包埋。1.2 方法标本经固定后，常规脱水石蜡包埋，作3 m 连续切片，分别进行HE染色和免疫组织化学染色。切片脱蜡至水化，3%过氧化氢孵育10 min ，消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡32 min，微波炉抗原修复（9598 ），自然冷却至室温，加入1：100 NOS单克隆抗体，37 孵育30 min，或4 过夜，用普通小鼠IgG及PBS代替一抗作阴性及空白对照，PBS冲洗32 min，滴加增强剂（A），37 孵育30 min，PBS 冲洗32 min，滴加生物素聚合物（B），37 孵育30 min，PBS 冲洗32 min。二氨基联苯胺显色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜观察照相。1.3 染色结果判断 阳性细胞为呈棕黄色颗粒的阳性反应产物。 每张切片在高倍显微镜下(200倍)随机选择5个视野， 计算每个视野阳性细胞率， 取平均值作为该标本的阳性细胞率。NOS表达结果分为阴性（）：无阳性细胞；弱阳性（+）：阳性细胞率<50%；强阳性（+）：切片中阳性细胞率>50%。1.4 统计学处理结果应用2检验。所有数据在SPSS11.0统计软件上进行，以P<0.05为差异有显著性。2 结果iNOS主要表达于翼状胬肉组织细胞的细胞浆和细胞膜内，少数表达于细胞核，iNOS表达阳性的细胞分布无明显规律，但静止期、进行期和复发性翼状胬肉的阳性细胞分布不同，静止期阳性细胞仅定位于上皮基底部，且呈散在分布，进行期阳性细胞增多，且向表层发展，复发性翼状胬肉阳性细胞明显增多，定位于上皮全层，染色最深。iNOS在翼状胬肉的阳性表达率为80%（16/20）。iNOS在正常结膜细胞内无阳性表达，阳性表达率为0（0/10）。iNOS在翼状胬肉及正常结膜的表达存在显著性差异（P<0.001），详见表1。表1 iNOS在翼状胬肉及正常结膜的表达情况（略）3 讨论一氧化氮（NO）是近年来发现的生物体内重要的细胞内信使分子，分子量极小，但在人体的生理、病理过程中起着重要作用，与多种疾病，特别是肿瘤的发生发展过程密切相关。一氧化氮合酶是催化NO生物合成的关键酶，在正常组织中很少表达，可由炎症、缺氧等刺激因素诱导巨噬细胞、炎性嗜中性粒细胞及肿瘤细胞等产生。目前已知体内有3种NOS，分别为神经型(nNOS)，内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)。nNOS，eNOS属于结构型NOS(constructiveNOS，cNOS)，其活性变化受Ca2+和钙调蛋白调节，又称钙离子依赖型。一般认为，cNOS催化生成的NO主要参与维持血管舒张和神经信息传递等; 而iNOD不受Ca2+和钙调蛋白调节，生理状态下不具备活性，但在各种刺激因素下诱导活化，参与多种病理过程2。近年来人们在对NO与肿瘤生物学行为的研究中发现，NO合成关键NOS与肿瘤的生长有直接关系。即在多种肿瘤细胞中存在活性增高的现象。NO可以促进肿瘤血管生成, 增强肿瘤组织的血液供应, 从而促进肿瘤细胞生长。翼状胬肉并非肿瘤，但具有肿瘤类似的特点，细胞异常增殖和凋亡。肿瘤血管形成是肿瘤生长和侵袭转移等生物学行为的病理基础，翼状胬肉的发生发展需要新生血管化参与，大量的血管形成是翼状胬肉向角膜发展侵袭的必备条件。有研究表明VEGF，FR Ag在翼状胬肉组织中有高表达，与血管形成有关。本研究表明，iNOS在翼状胬肉中有高表达，提示iNOS参与了翼状胬肉的血管形成过程，与翼状胬肉的发生发展有关。具体机制可能是iNOS催化产生的NO促进新生血管形成34；或是iNOS及其催化产生的NO促进血管内皮生长因子形成，活性增高，通过与内皮细胞上的特殊受体作用，直接刺激内皮细胞分化增殖和迁移，促进血管构建及生成，加快基底膜降解，诱导内皮细胞胞膜成窗， 促进内皮细胞移动，即直接参与了血管形成过程；并通过增强血管通透性，促进血浆纤维蛋白外渗形成血管外纤维蛋白基质，为血管生成过程中多种细胞迁移提供一个纤维网架。有研究证明，在角膜肿瘤血管模型研究显示，给兔饮用含有NOS抑制剂N硝基L精氨酸的水后，肿瘤新生血管减少，体积缩小，敲除iNOS基因的小鼠接种B16F1细胞后，成瘤率降低，并伴有VEGF表达降低57。综上所述，iNOS在翼状胬肉组织中高表达，可能与翼状胬肉的发生发展有关，同时也提示选择性NOS抑制剂可以阻断新生血管形成，从而影响翼状胬肉的发生发展，减少术后复发。【参考文献】 1 冯红杰,陈伟良,李劲松,等.诱导型一氧化氮合酶在颌骨肉瘤中的表达及意义J.临床口腔医学杂志,2006,22(4):209-211.2 林 震,陈仕平,叶传忠,等.一氧化氮合酶在膀胱癌中的表达及与肿瘤血管形成的关系J.中华泌尿外科杂志,2003,24(2):99-101.3 Konopka T E, Barker J E, Bamford T L,et al. Nitric oxide synthase II gene disruption: implications for tumor growth and vascular endothelial growth factor productionJ. Cancer Res, 2001,61(7):3182-3187.4 Tsoi V L, Hill K E, Carlson N G,et al. Immunohistochemical evidence of inducible nitric oxide synthase and nitrotyrosine in a case of clinically isolated optic neuritisJ. J Neuroophthalmol, 2006,26(2):87-94.5 Gollo O, Masini E, Morbidelli L,et al. Role of nitric oxide in angiogenesis and tumor progression in head and neck carcerJ. J Natl cancer Inst,1998,90(8 ):587-596.6 Lee D H, Cho H J, Kim J T,et al. Expression of vascular endothelial growth factor and inducible nitric oxide synthase in pterygiaJ. Cornea, 2001,20(7):738-7