基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素.doc

基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的工艺一，背景知识1， 基因工程科技名词定义中文名称：基因工程英文名称：genetic engineering;gene engineering其他名称：重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA technique)定义1：狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因；广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品；将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物；用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。定义2：将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术。 扩充：基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：（1）外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分；（2）适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组；（3）外源基因的导入；（4）外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选；（5）外源基因表达产物的生理功能的核实；（6）转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析；（7）生态与进化安全保障机制的建立；（8）消费安全评价。基本操作步骤（上游技术）提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。如植物的抗病（抗病毒 抗细菌）基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。目前人工合成基因的方法主要有两条。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。如人的血红蛋白基因胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。目的基因与运载体结合基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌，枯草杆菌，土壤农杆菌，酵母菌和动植物细胞等。用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。例如，如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌的繁殖速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。目的基因的检测和表达目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。以上步骤完成后，在全部的受体细胞中，真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。因此，必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。检测的方法有很多种，例如，大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒，并被转入受体细胞后，就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。重组DNA分子进入受体细胞后，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。2， 糖尿病 糖尿病（diabetes）是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征。临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，糖尿病（血糖）一旦控制不好会引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，严重者会造成尿毒症。糖尿病人应常煮紫芝水喝，来控制血糖，预防并发症。3， 胰岛素科技名词定义中文名称：胰岛素英文名称：insulin定义：胰腺朗格汉斯小岛所分泌的蛋白质激素。由A、B链组成，共含51个氨基酸残基。能增强细胞对葡萄糖的摄取利用，对蛋白质及脂质代谢有促进合成的作用。性质英文Insulin显微镜下的胰岛 beta 细胞化学本质蛋白质分子式C257 H383 N65 O77 S6分子量5807.69性状白色或类白色的结晶粉末熔点233（分解）比旋度-648(C=2,0.003mol/L NaOH)溶解性在水、乙醇、氯仿或乙醚中几乎不溶；在矿酸（无机酸）或氢氧化碱溶液中易溶酸碱性两性，等电点pI5.35-5.45结构不同种族动物（人、牛、羊、猪等）的胰岛素功能大体相同，成分稍有差异。图中为人胰岛素化学结构。胰岛素由A、B两个肽链组成。人胰岛素(Insulin Human)A链有11种21个氨基酸，B链有15种30个氨基酸，共26种51个氨基酸组成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键，使A、B两链连接起来。此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。品种按来源不同分类1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。3、生物合成人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。功能胰岛素能促进全身组织对葡萄糖的摄取和利用，并抑制糖原分解和糖原异生，因此，胰岛素有降低血糖的作用。 u 促进肌肉、脂肪组织等处的靶细胞细胞膜载体将血液中的葡萄糖转运入细胞。u 通过共价修饰增强磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高cGMP浓度，从而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降低，加速糖原合成、抑制糖原分解。u 通过激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶而使丙酮酸脱氢酶激活，加速丙酮酸氧化为乙酰辅酶A，加快糖的有氧氧化。u 通过抑制PEP羧激酶的合成以及减少糖异生的原料，抑制糖异生。u 抑制脂肪组织内的激素敏感性脂肪酶，减缓脂肪动员，使组织利用葡萄糖增加。二，基因工程大肠杆菌生产重组人胰岛素的步骤1， 提取目的基因 本工艺的目的基因采用人工合成的方法，以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。具体的操作步骤如下：u 取材：人胰腺细胞u 试剂：DEPC(焦碳酸二乙酯),氯仿，异丙醇，无水乙醇，0.050.1DEPCH2O，75乙醇，TE缓冲液，琼脂糖。 u 提取方法： TRIzol抽提法 （异硫氰酸胍/酚TRNzol总RNA提取试剂）TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用操作步骤详解：（1），获取所有的mRNA。a 样品处理： A：培养细胞：收获细胞 1-510 7 ，移入 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol ，混匀，室温静置 5min 。 B：组织：取 50-100mg 组织（新鲜或 -70 及液氮中保存的组织均可）置 1.5ml 离心管中，加入 1ml Trizol 充分匀浆，室温静置 min 。b 加入 0.2ml 氯仿，振荡 15s ，静置 2min 。 c 4 离心， 12000g 15min ，取上清。 d 加入 0.5ml 异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置 10min 。 e 4 离心， 12000g 10min ，弃上清。 f 加入 1ml 75% 乙醇，轻轻洗涤沉淀。 4 ， 7500g 5min ，弃上清。 g. 晾干，加入适量的 DEPC H 2 O 溶解（ 65 促溶 10-15min ）。 （2），mRNA的分离。方法：分离的总RNA 可利用mRNA3端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。 试剂：1X柱层析加样缓冲液：20mmol/L Tris.Cl, pH7.6; 0.5mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA, pH8.0; 0.1%SDS.灭菌洗脱缓冲液:10mmol/L Tris.Cl, pH7.6; 1mmol/L EDTA, pH8.0; 0.05%SDS.步骤：A. 用1ml 0.1mol/L NaOH悬浮500mg oligo(dT)纤维素. 用1ml 0.1mol/L NaOH悬浮500mg oligo(dT)纤维素.B. 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌喊玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积的灭菌水冲洗柱床。C. 用1X柱层析加样缓冲液冲洗柱床，知道流出液的pH值小于8.0。D. 将提取的总RNA液于65温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2X柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1X柱层析加样溶液。E. 测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入23倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。F. 测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。G. 加入1/10体积的3mol/L NaAC (pH5.2)、2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20放置30分钟。H. 4下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4下12000g离心5分钟。I. 小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。J. 用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70中）。（3），分离目的mRNA。u 将 RNA 进行 1% 琼脂糖凝胶电泳u 9 ml RNA 样品 23 ml 上样液轻轻混匀，u 上样 u 电泳: 120伏，1020分钟 u 注意: 电泳槽的清洁及新的电泳液！u 琼脂糖凝胶要新鲜配制！u 紫外透射仪观察电泳结果（4），逆转录。u 以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱基相互补DNA链，后者称为互补DNAcDNA。u RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。（5），PCR扩增。u 在一微量离心管中依次加入下列试剂： cDNA 4 ml10PCR buffer（含MgCl2） 5 mldNTPs (10mmol/L) 1 ml5引物 (10mmol/L) 1 ml3引物 (10mmol/L) 1 ml去离子水（补足反应体系） 39 ml Taq DNA pol. (2U/ml) 1 ml 轻弹管底混合（用离心机甩一下）PCR仪设定的反应条件： 94C 45 S DNA变性 55 C 45 S DNA复性 72 C 1 min 产物链延伸 25-30个循环后72 C 10min 2,目的基因与运载体结合载体：pBR322工具酶：BamH、T4DNA连接酶。操作步骤详解：首先，用BamH酶来切pBR322以产生这个酶的特异性黏性末端。同时用pBR322酶切割外源D