外周血造血干细胞的检测及冻存技术.doc

外周血造血干细胞的检测及冻存技术作者：斯晓明黄若宇黄颖王九花张亮 【关键词】外周血干细胞 关键词:外周血干细胞;检测;冻存 0引言 化疗是治疗恶性肿瘤的有效方法1，2，自体外周血干细胞移植（APBSCT）治疗实体瘤是技术.利用流式细胞术（FACS）检测采集的自体外周血干细胞（APBSC）中CD34+细胞及其亚群，对准确及时判断干/祖细胞数量有重要意义3，分离液的冻存更是APBSCT中的关键技术.我们通过对临床24例肿瘤患者APBSCT中干细胞的检测及冻存技术的研究，制定标准技术方法，稳定临床治疗效果. 1对象和方法 1.1对象肿瘤患者24例，男13例，女11例;年龄2973（中位49）岁.肿瘤类型:乳腺癌8例，肺癌9例，精原细胞癌2例，睾丸癌1例，喉癌1例，非霍奇金淋巴瘤1例，胰腺癌1例，卵巢癌1例.泰索帝（法国罗那普郎克.安乐公司产品），惠尔血（日本麒麟公司产品）.血细胞分离机为BCT-spectra（美国COBE公司），流式细胞仪为FACSCalibur（美国BD公司）CD34-PE荧光单克隆抗体（美国BD公司）. 1.2方法24例患者一次性静滴泰索帝180200mg，710d白细胞降至1109L-1，皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）惠尔血300g每日1次，连续使用34d，经过动员后，外周血白细胞达到3109L-1、血小板达到50109L-1以上时，进行外周血干细胞的采集（PBSCC），总循环血量800010000mL，采集时间为4h左右，最终采集物为100mL，24例患者都进行2次PBSCC.经血细胞分离机分离的细胞液，直接取样进行检测，采用识别CD34分子类抗原表位581（Beckman-conter，Miami，FL）的单抗进行标记，用溶血法处理细胞液，细胞液与CD34-PE荧光单克隆抗体室温暗处反应20min，细胞裂解液溶解红细胞，应用流式细胞仪检测CD34+细胞占所有白细胞的百分率.在超净台内将分离出的细胞液加入一定比例的200gL-1白蛋白和cp-1（二甲基亚砜+羟乙基淀粉），混匀，分装到冷藏袋内，热合封口.冷藏袋平铺在两块大小相同的有机玻璃板中间，两板间隔1cm，用绷带将其裹紧，使细胞液均匀地夹在两板之间，水平地放置在-80冰箱里，注意保护好袋口的管子. 2结果 24例患者经过2次采集，CD34+细胞总计都在2106kg-1以上.经过预处理后，白细胞降至0.1109L-1血小板最低降至10109L-1，开始回输干细胞，9d后血象开始回升，12d左右白细胞数达到正常值，无1例发生意外. 3讨论 取样未加过cp-1的细胞液进行CD34+细胞的检测，因为cp-1中的羟乙基淀粉在检测时往往会堵塞流式细胞仪的针孔而失败.在缓慢推入cp-1时，将装有干细胞的袋子放入冰水槽中不停摇动，cp-1与细胞液混合过程中，产生热量，会对细胞功能造成损害.细胞液应均匀地分布在冷藏袋内，其体积不能超过容器容纳能力的一半，在冻存/复苏时可使细胞液全面均匀受冻/解冻.经过80机械冰箱的储存，冷藏袋既硬又脆，在拿取过程中要防止碰裂或碰断暴露于有机玻璃板外的冷冻袋口的管子.总之我们的体会是只要注意上述事项，就可顺利完成干细胞移植治疗中的关键步骤而达到治疗目的. 参考文献: 1侯丽宏，孙秉中，乔庆大.Gm-CSF对恶性血液病患者化疗后骨髓造血抑制的治疗作用J.第四军医大学学报，1998;19（5）:584-585. 2陈江浩，王执民，吴道澄.阿霉素脂质体经肝动脉给药治疗大鼠肝肿瘤J.第四军医大学学报，1998;20（1