乳清饮料发酵条件的优化结果与分析

韩 山 师 范 学 院学 生 毕 业 论 文（2010届）题目（中文） 正交设计优化活菌型乳清饮料工艺 （英文） To optimize the technology of viable type whey drink by orthogonal design * 系别: 生物系 专业: 生物科学 班级: 班 姓名: 林锦彬 学号: 指导老师: 李云(讲师) 韩山师范学院教务处制诚 信 声 明我声明，所呈交的毕业论文是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，我承诺，论文中的所有内容均真实、可信。毕业论文作者签名: 签名日期: 年 月 日摘要：活菌型乳清饮料是利用乳清作主要原料，添加乳酸菌发酵到一定程度，以降低乳糖，产生乳酸，最后生成的一种营养丰富的乳清饮料。乳清发酵过程受菌种比例、发酵温度、乳清浓度、接种量四种因子的影响。本实验应用正交设计的方法优化发酵乳清饮料的四个影响因子，结果表明，用乳酸菌发酵乳清饮料的最佳工艺条件为:菌种比例L.b:S.t:L.a=1:2:1，发酵温度为42，接种量为7%，乳清浓度5% 。 关键词： 乳清；正交设计法；益生菌；发酵饮料 Abstract: The viable type whey drink is use whey as the main raw materialadding lactic ,adding lactic acid bacteria fermented to a certain extent, to reduce the lactose, produce lactic acid, and finally generate a nutrient-rich whey drinks. The process of whey fermentation affected by four factors which is strain ratio,fermentationtemperature,whey concentration and inoculum.The experiment to optimize four factors which affect the process of whey fermentation by orthogonal design. The results showed that the best technological conditions of the beverage of whey fermented by lactic acid bacteria was:Strain ratio of L.b: S.t: L.a = 1:2:1, fermentation temperature of 42 , inoculation of 7%, whey concentration of 5%.Key Words: Whey; Orthogonal design; Probiotics; Fermented beverages目录 1 材料和方法 21.1 材料 21.2 菌种 21.3 培养基 21.4 主要试剂 21.5 仪器和设备 31.6 方法 32 结果与分析 62.1 乳清饮料发酵条件的优化结果与分析 62.2 验证实验结果 93 讨论 104 参考文献 115 致谢 12正交设计优化活菌型乳清饮料工艺乳清(whey)是乳经酸凝乳或凝乳酶凝固后剩余的液态部分，是干酪和干酪素生产的副产物，呈黄绿色1。一般每生产1kg干酪可得到9kg乳清，每生产1kg干酪素可得27kg乳清2。据FAO数据统计3，在近五年里，全球干酪产量增长了近150万吨，目前的生产量约1810万吨。而乳清营养则相当于除去酪蛋白的脱脂乳，其营养物质占原料乳的55%，干物质约占6-8%，粗蛋白占1%，粗脂肪占0.3-0.4%，总糖(乳糖约99.8%)占3-5%，还有多种矿物质和水溶性维生素等4，5。乳清的多种营养成分具有重要生理功用，如乳清蛋白是一种高营养优质蛋白质。乳清蛋白中的必需氨基酸非常丰富，其含量等于或大于 FAO/ WHO 提出的对幼儿和成人的推荐值，因此对个体健康具有重要意义。乳清中的糖类几乎都是乳糖，乳糖不仅可为机体提供能量，尚有多种营养与保健功能。另外乳清矿物质处于良好的平衡状态，其中钾和钠的比例为 21，具有完全的营养功效。发酵型乳清饮料9是利用营养价值极丰富的乳清作主要原料，添加乳酸菌发酵到一定程度，乳清中的乳糖经-半乳糖苷酶的作用，转化成高甜度的葡萄糖-半乳糖糖浆，以降低乳糖，产生乳酸，最后生成一种口味纯正、酸甜可口、营养丰富的高档饮料。因此发展研制乳清饮料，既可充分利用乳清资源，又具有比其他利用方式(乳清粉、乳清蛋白粉等)工艺简单，投资设备少，产量大，经济效益高等特点，故是乳清利用的一个重要方向。澳大利亚是将乳清加工成果汁饮料；日本是先用酸性蛋白酶制取透明乳清，然后加入甜味料和着色剂等物质制成充气饮料；美国是先将乳清制成糖浆，再与葡萄汁配制成“葡萄酒”，其风味相当于标准葡萄酒10 。国内对乳清饮料的研究也有报道，内蒙古农牧学院的孙天松等人6研制了澄清发酵饮料，找到了乳清发酵时的pH值、酸度随时间的变化关系；东北农学院的万贤生7作了利用微生物生产乳清饮料的研究；内蒙古农牧学院食品工程系的张和平等人8作了酶法多肽乳清饮料的研究。国外对乳清利用的研究，饮料形式较其他形式相对较少，归纳起来，有以下几种情况：直接调配，即取一部分乳清、一部分果汁或其他原料进行调配而成；制作蛋白澄清饮料，即通过酸化或加热等方法使蛋白质沉淀后再加工成饮料；发酵型乳清饮料。其中第二种形式研究的比较多。正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表。例如作一个三因素三水平的实验，按全面实验要求，需进行33=27种组合的实验，且尚未考虑每一组合的重复数。若按L9(33)正交表安排实验，只需作9次，按L18(37)正交表进行18次实验，显然大大减少了工作量。因而正交实验设计在很多领域的研究中已经得到广泛应用。正交表的符号：Ln(ji)，其中 L代表正交表的符号，n代表正交表的行数(试验次数，试验方案数)，j代表正交表中的数码(因素的水平数)，i代表正交表的列数(试验因素的个数)。通过前面对活菌型乳清饮料进行的单因素研究，我们知道菌种比例、发酵温度、乳清浓度、接种量等因子对活菌型乳清饮料的发酵都有一定的影响；且发酵活菌型乳清饮料的最佳菌种比例为：保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌:干酪乳杆菌:嗜酸乳杆菌=1:2:1:1，最佳发酵温度为38；最佳乳清培养浓度4%；最佳接种量为7%。在此基础上活菌型乳清饮料的理化性质和风味都较好。结合单因素实验结果，本实验应用正交试验设计的方法优化发酵乳清饮料的四种影响因素:接种量、发酵温度、乳清浓度和菌种比例，确定最佳的工艺条件，以更好的满足理论研究和工业生产的需要。1 材料和方法1.1 材料市售脱脂奶粉D90脱盐乳清粉为荷兰进口（乳糖含量82%），酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏为生化试剂，其他试剂为分析纯。1.2 菌种保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus，简写为L.b)、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，简写为S.t）、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus，简写为L.a)、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei，简写为L.c）1.3 培养基脱脂乳培养基：脱脂奶粉100g，蒸馏水1L，自然pH值，用于菌种的保藏活化。MRS液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，硫酸锰 0.25g，硫酸镁0.58g，加蒸馏水至1000 mL。调酸度至pH值为6.2-6.8，压力为0.07 MPa，灭菌20 min备用。MRS固体培养基则另加1.5%的琼脂。乳清培养基：乳清粉，水；按试验所需比例配制1.4 主要试剂标准乳糖糖溶液：取分析纯乳糖置于105烘箱干燥2 h，精确称取20 mg溶解后置于100 mL容量瓶内，用蒸馏水定容至刻度，配成0.2 mg/mL的标准乳糖溶液。邻甲基苯胺试剂：称取硼酸0.65g溶于温热的210 mL冰醋酸中，再加入1.25 g硫脲，充分溶解后加入邻甲基苯胺37.5 mL，用冰醋酸定容至250 mL，贮于棕色瓶内。36中性甲醛：用酚酞指示剂，将甲醛用氢氧化钠中和至刚出现粉红色为止。酚酞指示液：称取0.5g酚酞，用少量乙醇溶解并定容至500 mL 0.02mol/L氢氧化钠标准溶液氢氧化钠标准滴定溶液NaOH=0.1 mo1/L：分析纯75%乙醇1.5 仪器和设备立式万用电炉 上海浦东荣丰科学仪器有限公司Spx-250B-G微电脑光照培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备101A-1型电热鼓风干燥箱 上海市实验仪器总厂HH-2数显恒温水浴锅 潮州凯普生物仪器有限公司PHS-3D pH计 上海精密科学仪器有限公司JY2502电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司LDZX-501LB立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂SW-CJ-16双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司BCD-222E4型冰箱 TCL集团股份有限公司1.6 方法1.6.1 正交实验设计主要影响因素为接种量、发酵温度、菌种比例、乳清浓度,采用4因素3水平的正交表L9(34), 各因素和水平的选取如表1所示。表1 乳清发酵液正交试验因素水平Table1 Whey fermentation factor level orthogonal因素及水平菌种比例（A）发酵温度（B）乳清浓度（C）接种量（D）11:2:1（L.b:S.t:L.c）353%5%21:2:1（L.b:S.t:L.a）384%7%31:2:1:1(L.b:S.t:L.a:L.c)425%9%表2 乳清发酵饮料配比方案正交实验计划表Table2 Whey fermented beverages orthogonal matching program schedule试验号菌种比例（A）发酵温度（B）乳清浓度（C）接种量（D）11:2:1（L.b:S.t:L.c）353%5%21:2:1（L.b:S.t:L.c）384%7%31:2:1（L.b:S.t:L.c）425%9%41:2:1（L.b:S.t:L.a）354%9%51:2:1（L.b:S.t:L.a）385%5%61:2:1（L.b:S.t:L.a）423%7%71:2:1:1(L.b:S.t:L.a:L.c)355%7%8 1:2:1:1(L.b:S.t:L.a:L.c)383%9%91:2:1:1(L.b:S.t:L.a:L.c)424%5%按上述正交实验设计计划表进行发酵试验。1.6.2 理化指标的测定1.6.2.1 pH值测定11用pHS-3D型pH计直接测定发酵后的pH值1.6.2.2 活菌数测定12用稀释平板菌落计数法测定发酵后的活菌数在无菌条件下吸取样品lmL，转移至9mL无菌水中，将加有样品的无菌水摇匀，再从中吸取lmL转移至另一无菌水中(9mL)，此过程依次重复，直至稀释到所需浓度。吸取一定浓度的菌液1mL涂布在平皿上，35培养48小时，计菌落数。样品菌数=菌落数稀释倍数1.6.2.3 酸度（滴定酸度）的测定13吸取5mL已搅拌均匀的试样，置于150 mL锥形瓶中，加40 mL新煮沸放冷至40的水，混匀，然后加人5滴酚酞指示液，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至微红色在0.5min内不消失为终点。消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数乘以20，即为酸度(0T)。连续滴定两次，取平均值。重复性条件下获得的两次独立滴定结果的绝对差值不得超过0.5 mL。1.6.2.4 氨基氮的测定-甲醛滴定法14准确吸取0.5mL样品于100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀后准确移取20.0mL置于200mL烧杯中，加60mL水,开动磁力搅拌器。用0.02mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠的毫升数，可计算总酸含量。加10mL甲醛溶液于烧杯中混匀，再用0.02mol/L氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH=9.2，记下消耗0.02mol/L氢氧化钠标准溶液的毫升数。同时取80mL蒸馏水，先用0.02mol/L氢氧化钠溶液滴定至pH为8.2，再加10.0mL甲醛溶液，用0.02mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH为9.2，做试剂空白试验。结果计算：式中 X 样品中氨基氮的含量（g/100mL） V1测定用样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）V2试剂空白试剂加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）V3样品稀释液取用量（mL）C 氢氧化钠标准溶液的浓度（molL-1）14氮的摩尔质量（gmol-1）1.6.2.5 乳糖测定（邻甲基苯胺法）(1) 乳糖标准曲线的制作取干净试管6支，按表3加入各溶液；将各试管内溶液摇匀，套上试管帽，置于沸水浴中加热10 min；取出，用流水冷却至室温；用分光光度计在波长635nm下比色，读取吸光度，将结果填入表3中； 以吸光度为横坐标，乳糖的毫克数为纵坐标，绘制标准曲线：如图1。表3 乳糖标准曲线的制作Table3 The production of lactose standard curve管号123456乳糖/mg0.00.050.10.20.30.4标准乳糖溶液/mL0.00.250.51.01.52.0蒸馏水/mL2.01.751.51.00.50.0O-TB试剂/mL444444A635图1 乳糖标准曲线图Picture1 Standard curve of lactose(2) 发酵液含糖量的测定稀释：取2mL发酵液，先用蒸馏水定容到6mL，充分摇匀，然后取1mL倒入100mL容量瓶中，用蒸馏水冲洗水解液，合并洗液，并定容至刻度，充分摇匀；显色：吸取稀释后的水解液2mL，置于干净试管中。再加入O-TB试剂，充分摇匀，套上试管帽，置沸水浴加热10min。取出后用流水冷却至室温；比色：以2mL蒸馏水代替水解液作对照管，在635nm波长下测定吸光度；计算：根据样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的葡萄糖毫克数，然后按下列公式算出每100mL发酵液中的含糖量发酵液含糖量（g/100mL）= (AN)/ (V1000) 100式中：A为由吸光度查标准曲线所得的糖毫克数 N为样品稀释倍数 V为测定时所取的样品毫升数1.6.3 感官分析方法根据活菌型乳清饮料的色泽、组织状态、气味、口感进行感官评分15,16，由10名具有一定经验的人员组成评定小组，采用100分制，即感官综合评分=色泽评分+气味评分+口感评分+组织状态评分，取其平均值作为总感官评分。产品感官评分标准具体见表4表4 活菌型乳清饮料感官鉴评标准表Table4 Viable model Sensory evaluation of whey beverage standards list项目评分标准分值色泽（20分）一级：纯乳白色，无其他杂色1520二级：颜色淡黄1014三级：颜色略深 10气味（30分）一级：发酵香气，如牛奶香气，且有酸甜味2530二级：发酵香气，有酸甜味，很淡2024三级：有酸腐味，刺鼻 20口感（30分）一级：口感细腻，爽口，酸甜适中，无异味2530二级：偏甜或偏酸，口感粘稠2024三级：太甜或太酸，口感粘稠 20组织状态（20分）一级：均匀细腻，无沉淀和分层1520二级：上部有少量清液析出1014三级：有明显沉淀和分层 102 结果与分析2.1 乳清饮料发酵条件的优化结果与分析2.1.1 以酸度实验结果进行正交表5不同发酵条件的L9(34)正交试验结果分析表Table5 Different fermentation conditions L9 (34) orthogonal test results of table试验号菌种比例（A）发酵温度（B）乳清浓度（C）接种量（D）酸度0T1111198212221053133310042123102.55223112062312102.5731321058321390.593321115K1101.0101.897.0111.0K2108.3105.2107.5104.2K3103.5105.8108.397.7R7.34.011.313.3表6方差分析Table6 Analysis of variance因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性A83.38923.02619.000*B27.55621.00019.000C239.38928.68719.000*D266.72229.67919.000*误差27.562从表5极差分析结果可以看出：影响因素的显著程度大小为：DCAB，即接种量乳清浓度菌种比例发酵温度，从表6方差分析也可以得出同样的结论，根据酸度正交试验结果，得出的发酵乳清饮料的最佳工艺条件是A2B3C3D1，即菌种比例为L.b:S.t:L.a=1:2:1，发酵温度为42，乳清浓度为5%，接种量为5%。2.1.2 以感官评价实验结果进行正交表7 不同发酵条件的L9(34)正交试验结果分析表Table7 Different fermentation conditions L9 (34) orthogonal test results of table试验号菌种比例（A）发酵温度（B）乳清浓度（C）接种量（D）感观评价111115421222713133365421237352231796231275731327083213599332170K163.365.762.767.7K265.769.761.362.0K366.370.071.365.7R12.34.38.76.3表8 方差分析Table8 Analysis of variance因素偏差平方和自由度F比F临界值显著性A248.22227.11519.000*B34.88921.00019.000C150.22224.30619.000*D62.88921.80319.000*误差34.892图2 正交实验直观分析图Picture2 Orthogonal direct analysis chart从表7、表8和图2可以直观的看出：影响因素的显著程度大小为ACDB，即菌种比例乳清浓度接种量发酵温度。根据感官评价正交试验结果，得出发酵乳清饮料的最佳工艺条件是A2B3C3D2，即菌种比例为L.b:S.t:L.a=1:2:1，发酵温度为42，乳清浓度为5%，接种量为7%。菌种比例对产品感官品质影响最大，S.t和L.b是两种非常有益的乳酸菌，S.t发酵糖产生的L(+)-乳酸酸味不强烈，但发酵能产生较多的香味物质如双乙醛17，L.b发酵糖产生的D(+)-乳酸有较强酸味，同时也能够产生一些香味物质，在试验中L.b与S.t的比例都保持在1:2，S.t的比例较高，使饮料的香味较好，L.b比例较低，为防止酸味不足，加入L.a菌种，因L.a与L.b都是专性同型发酵，能够耐强酸，虽然L.a代谢产酸速率低，但这对发酵饮料的后酸化作用有重要意义，从表7和图2可以直观的看出，菌种比例为L.b:S.t:L.a=1:2:1的感官品质是相对比较高的；加入L.c菌种，虽然L.c也能够耐强酸，但可能因为L.c只能在低酸环境和37以下的温度才能生长良好，而S.t和L.b比较适宜在pH为5.5-6.8和较高温度中生长，所以加入L.c，不利于菌种的共生关系，导致菌种比例为L.b:S.t:L.c=1:2:1的感官品质相对来说不是很好；同时加入L.a菌种和L.c菌种，可能由于种内竞争和种间竞争比较激烈，影响菌种的共生关系，导致菌种比例为L.b:S.t:L.c:L.a=1:2:1:1的感官品质相对来说也不是很好因此我们选择L.b:S.t:L.a=1:2:1的比例为最佳。从表7的极差值可以看出温度对饮料的品质影响不大，在3842这一狭小的范围内培养温度对饮料品质的影响较其它因素而言要弱。根据菌种的生长特性，菌种共生时最适宜的发酵温度为4042。从图2可以看出在42的评分是最高的。虽然在38的评分也比较高，但出现严重乳清析出现象，凝乳质地变差。因此我们选择42的发酵温度为最佳。接种量对产品的组织状态和口感也有很大影响，接种量过低，产酸易受到抑制且不稳定；接种量太大，产酸过快，会给产品的风味和组织状态带来缺陷，从表7中我们可以看出在7%时评分最高，结合先前做的单因素实验结果，我们选择7%的接种量为最佳。乳清的浓度对饮料品质的影响较大，浓度过高，可能造成乳清利用不彻底，浪费资源或者菌种过度繁殖，酸味明显，浓度过低，使种内竞争和种间竞争更加激烈，没有发酵香味。从表7我们可以看出乳清浓度在5%时评分最高，因此我们选择浓度5%为最佳。综合考虑酸度正交分析结果和感官评价正交分析结果，确定乳酸菌发酵乳清饮料的最佳发酵工艺条件为A2B3C3D2，即菌种比例L.b:S.t:L.a=1:2:1，发酵温度为42，接种量为7%，乳清浓度为5%。此组合不在试验设计中，因此需要做验证实验。2.2 验证实验结果验证试验：按上面最佳条件A2B3C3D2，平行试验3次，得滴定酸度为106oT，且具牛奶香气，有酸甜味，气味轻淡，淡黄色，无分层。通过验证实验，发现此试验设计的试验结果酸度高，感官评价也较高。因此，确定较优发酵条件为：菌种比例L.b:S.t:L.a=1:2:1，发酵温度为42，接种量为7%，乳清浓度为5%。3 讨论发酵型乳清饮料是利用营养价值极丰富的乳清作主要原料，添加乳酸菌发酵到一定程度，以降低乳糖，产生乳酸最后生成一种口味纯正、酸甜可口、营养丰富的高档饮料。这样既可充分利用乳清资源，又具有比其他利用方式(乳清粉、乳清蛋白粉等)工艺简单，投资设备少，产量大，经济效益高等特点，故发展研制乳清饮料是乳清利用的一个重要方向。同时，乳清的多种营养成分具有重要生理功用，属天然原料兼营养饮料，故是饮料发展的一个重要方向。在本试验中，乳清饮料的感官评价都不是很好，这可能跟发酵时间把握不当有关，发酵10小时，时间可能过长，随着发酵时间的延长，酸度也随之增加，且发酵时间太长将不利于工厂生产，可以尝试缩短发酵时间，也可通过添加一些调料来改善，使乳清饮料更加可口。参考文献1 张兰威,朱永军. 牛乳清蛋白的性质及其在食品工业中的应用J. 乳品科学与技术,2002,(1):14-17.2 马俪珍,张秀红等. 乳清的营养价值及乳清饮料的研究现状J. 中国乳品工业,1999,27(5):47-50.3 王会斌. 乌克兰干酪制造业概况J. 中国奶牛,2006,(9):59-60.4 江家琴,李克杰. 乳清酿酒的研究J. 中国乳品工业,1992 ,20 (6):243-245.5 张敬荣. 乳清的