胶原在软骨组织工程中的应用.doc

胶原在软骨组织工程中的应用【摘要】 软骨组织工程的出现，为解决软骨修复这个临床难题提供了新的方法。然而寻找一种合适的生物载体材料是目前软骨组织工程的热点。胶原是一种天然支架材料，具有良好的生物相容性、可降解性和生物活性，可作为细胞三维生长支架，并且有维持种子细胞增殖、黏附和分化的能力。本文就胶原及其复合材料在软骨组织工程方面的应用状况与前景作一综述。 【关键词】 胶原; 软骨修复; 组织工程Abstract:Recently, tissue-engineered chondrocyte transplantation has been tried to treat full - thickness cartilage defects. Of the many scaffold materials being investigated, collagen, with good biocompatibility, biodegradable and biological activity, has been shown to have many advantageous features for the proliferation, the attachment and the differentiation. The present article reviews the applications and prospects of collagen in cartilage tissue engineering.Key words：collagen; cartilage repair; tissue engineering软骨组织自我修复能力差，因各种疾病所导致的软骨缺损如何修复成为临床医生面临的一大难题。微小的关节软骨创伤可能会导致进一步的损伤和恶化。传统上软骨修复主要有关节成形术、自体软骨膜或骨膜移植等。但是这些方法都有一定的局限性，且都不能达到长久的修复效果1。最近，组织工程已经成为组织或器官移植外的另一选择，包括种子细胞以及可降解的生物支架材料，并已被证明是一种最有前途的软骨修复方法2。支架材料作为组织工程种子细胞的生长及营养和代谢的运输载体在组织工程方法中至关重要。目前，软骨组织工程支架分为天然和人工合成支架材料。人工合成支架(如PLA、PLGA)尽管被证明有利于细胞的黏附、增值、分化等优点。但也存在一定的局限性，如缺乏细胞识别信号、亲水性差、对细胞的吸附能力差且降解产物如聚乳酸易引起非炎症性反应。天然材料最突出的优点是抗原性低，生物相容性好，具有细胞识别信号，有利于细胞行为。在软骨组织工程中，由于胶原具有以上优点，且是软骨基质的主要成分，在软骨修复中的应用日益受到重视，成为软骨组织工程中最具潜力的支架材料，但也存在一些缺点，如机械强度不足3。本文就胶原在软骨组织工程中的应用作如下综述。1 单纯胶原支架材料在软骨组织工程的应用胶原是软骨组织中的主要结构蛋白，使软骨组织具有其独特的力学性质。而且胶原蛋白也有利于细胞的黏附、增殖和分化，并可降解而为新生组织提供足够的空间，且能刺激软骨细胞分泌新的胶原。在软骨组织工程中，主要应用的是I型和型胶原。Buma等4用I型和II型胶原基质修复兔的全层关节软骨缺损时发现， I型胶原基质更利于软骨下区的细胞进入缺损区，而型胶原基质虽然引导进入缺损区的细胞较少，但侵入的细胞能更快表现出软骨细胞样表型。Nehrer等5发现， I型胶原诱导成纤维细胞样形态和纤维性基质形成;而II型胶原诱导软骨细胞样形态和GAG基质形成。Stark等6将软骨细胞种植在不同的胶原基质上，结果显示软骨细胞在胶原基质上具有很高的活力，呈三维排列方式，软骨细胞特异性产物II型胶原大量表达。1.1 I型胶原支架材料I型胶原除了具有胶原的优点，且由于其分布最广，易于提取，因而在组织工程软骨中广泛应用。主要有海绵和凝胶两种形式。Wanmbach等7以I型胶原为支架培养软骨细胞，软骨细胞存活并表达其自身表型，产生细胞外基质。Yates等8将牛关节软骨细胞种植在胶原海绵支架上4周，采用定量软骨细胞合成物、基因表达产物的方式评价该支架，得到的数据显示胶原海绵支架能够有利于软骨细胞的粘附、增殖、分化和表型的保持。Willers等9应用基质诱导自体软骨细胞移植术(MACl)，在I型胶原膜支架上接种软骨细胞，并植入3 mm软骨缺损的兔膝关节，结果细胞支架复合物增殖分化形成健康软骨，12周时完全修复软骨缺损。Wakitani等10用I型胶原凝胶与软骨细胞和间充质干细胞混合后修复兔膝关节软骨的全层缺损，取得了比较满意的结果。卢华定等11构建I型胶原支架，并复合兔骨髓基质干细胞培养后移植于兔膝关节全层软骨缺损处，结果BMSCs在I型胶原支架材料内贴附良好，分泌胞外基质。组织学检测术后12周为透明软骨样修复。1.2 型胶原支架材料II型胶原主要由软骨细胞产生，具有促进软骨细胞分化的作用，并可为软骨细胞的黏附提供基础。在体外，II型胶原可刺激软骨的形成。李斯明等12应用II型胶原海绵植入兔膝关节软骨缺损处，结果表明实验组在2周即出现新生软骨细胞。且向缺损处迁移。12周后新生骨和软骨组织填满缺损区并与周围组织整合。杨小红等13对II型胶原海绵修复软骨缺损进行组织学观察，结果表明，II型胶原具有较强的诱导软骨细胞生长的能力，其诱导生长的新生软骨具有正常透明软骨的表型和功能。Lee等14用自体软骨细胞种植于型胶原支架在体外培养4周后，修复犬的关节软骨缺损，发现缺损区形成的组织中纤维性组织明显减少，但修复组织的强度仅为正常关节软骨的1/20。Atsushi F等15采用II型胶原凝胶与兔软骨细胞混合后移植到兔右膝缺损处进行软骨修复。结果表明，移植1224周后，有与周围软骨类似色泽且整合良好的新生软骨。2 胶原复合材料胶原可以作为软骨组织工程支架具有很多优越性，但胶原也存在加工性能差、缺乏柔韧性、抗拉强度低等缺点。为了改善胶原的力学性能，并根据仿生原理来模拟软骨组织成分，研究者制备胶原与其他材料(如壳聚糖、蛋白多糖等)的复合材料，以期得到理想的组织工程支架材料1626。2.1 胶原-透明质酸复合材料软骨的主要成分是胶原蛋白和糖胺多糖。其中透明质酸和硫酸软骨素均是糖胺多糖的主要成分。糖胺多糖可以键合和调节生长因子和细胞因子，抑制蛋白酶降解。并影响细胞黏附、迁移、增殖和分化，并在组织发育和修复过程中发挥重要的作用。Florin A等16制成胶原-透明质酸海绵材料，加入软骨细胞悬液培养后表明，低浓度的透明质酸与胶原蛋白共价结合可以促进软骨细胞合成蛋白多糖和硫酸软骨素、基质的聚集和特定软骨细胞基因表达。体外实验证明，胶原透明质酸复合材料对软骨形成有很好的相容性和再现性。吴炜等17制成胶原-透明质酸海绵材料，复合材料具有良好的三维空间结构和生物相容性，软骨细胞在材料上生长状况良好，且有基质分泌。2.2 胶原-壳聚糖复合材料壳聚糖能促进透明质酸等糖胺多糖的分泌，使伤口愈合加快，并能抑制成纤维细胞的生长，减轻瘢痕的形成。壳聚糖与胶原的结合除了可促进伤口愈合外，还可增强其力学性能。壳聚糖属多糖类，胶原属蛋白质类，蛋白质和糖类在一起可能存在氢键作用和静电作用，再加上交联作用，在胺基、羟基等之间相互交联，进一步提高其力学强度。Shi等18采用冻干法，将I型胶原和脱乙酰度88%壳聚糖制备成多孔海绵状三维支架，该支架具有良好的孔洞结构，并采用碳化二亚胺交联后力学强度得到提高。皮下种植试验证明其生物相容性和可降解性好。体外培养软骨细胞和支架复合物，发现支架促进了软骨细胞的增殖、分化并维持其表型。倪云峰等19研究了以壳聚糖-胶原共混膜为三维支架材料的同种异体软骨细胞构建组织工程化软骨的能力。倒置显微镜下观察兔软骨细胞接种于壳聚糖-胶原共混膜上后分裂增殖并向周围延伸。史德海等20也采用壳聚糖与型胶原复合制作了组织工程软骨三维多孔支架，并对其理化性能进行了检测。结果表明细胞生长状况良好，但体外降解较单纯的壳聚糖支架更快。2.3 胶原-硫酸软骨素复合材料糖胺多糖主要成分之一是硫酸软骨素，约占软骨干重的20%。因此，II型胶原蛋白-硫酸软骨素复合材料是培养软骨类组织再生的合适环境。Cao H等21用碳化二亚和N-羟基酰亚胺交联II型胶原蛋白和硫酸软骨素，通过冷冻和冷冻干燥法制备成多孔的基质。体外评价发现软骨细胞在复合支架中蛋白多糖和型胶原的表达较高，且组织学分析表明在支架边缘形成一个较厚的软骨层。2.4 胶原-聚乙烯醇复合材料聚乙烯醇具有良好的杨氏模量和抗张强度，适用于作为很多软组织的研究22，但单纯的PVA对细胞的吸附能力是有限的23。因此，在PVA中加入了胶原蛋白来改善其细胞的粘附性，从而使其更适合于软骨组织工程材料的研究。叶春婷等24利用胶原与PVA复合，研制成凝胶状材料，并对材料进行了细胞相容性与组织相容性评价，PVA-胶原材料无毒副作用，细胞能在其上三维生长，体内埋植4周后异物反应消失，材料与组织相互融合，表明材料具有良好的细胞相容性与组织相容性，可作为软组织体内植入材料与组织替代材料。2.5 胶原-壳聚糖-透明质酸复合材料由于软骨成分复杂，研究者们也研究了多种材料的复合，希望得到理想的组织工程软骨支架。Yan等25将壳聚糖-胶原-透明质酸通过冻干法制成多孔支架，经检测这种混合支架的水溶性好，降解慢，抗压性好的特点。与单独在胶原支架中培养相比，在该支架内体外培养软骨细胞21 d后，复合支架上布满了软骨样组织，DNA和糖胺聚糖(GAG)含量明显增高。2.6 胶原-透明质酸-硫酸软骨素复合支架材料张其清等26应用胶原-透明质酸-硫酸软骨素复合支架材料，模拟软骨基质成分，加入软骨细胞悬液在培养21 d后即形成软骨样组织，结构稳定。此种复合支架较之人工合成材料有更好的生物相容性和低免疫原性，且降解产物无毒。3 面临的挑战和展望理想的支架材料应具有一定的孔洞结构并可降解，能够使细胞保持其增殖和分化能力。良好的生物相容性及生物力学强度为种子细胞提供适合的生长微环境，以及有利于在缺损处形成具有功能的新的软骨组织。 胶原作为组织工程材料的优点是与组织的相容性良好，植入人体后无毒性，无刺激，并能促进细胞黏附、增殖，加快创面愈合，还可被人体分解吸收，分解产物亦无不良反应，可塑性好，容易加工成型。目前已经应用于组织工程修复的各个方面。多年来的研究亦表明胶原的性能能满足作为多种细胞的培养基质。胶原在组织工程软骨中也进行了大量的研究，并取得了一些进展，但也存在着问题。胶原蛋白支架缺乏一定的机械强度，而人工合成支架材料虽然有良好的机械强度，但是其细胞吸附性差、降解产物有一定毒性。因此胶原在组织工程软骨支架材料目前研究的重点之一是通过改进胶原支架材料及其制备工艺，进一步研究材料的交联方法提高胶原的机械强度，并采用胶原与人工材料或其他天然材料复合制备软骨支架。此外，以骨髓间充质干细胞作为组织工程软骨的种子细胞，以胶原为载体基质仍然需要进一步的研究27。 如今也有胶原材料复合生长因子来进行软骨修复，将胶原和细胞或生长因子混合后的得到复合生物活性材料，能够得到良好的组织工程化的软骨。总之，胶原作为一种天然生物材料应用于软骨组织修复的体外及体内的研究，已经被证实有很好的应用价值和可行性。基于胶原蛋白为原料的复合生物活性材料的开发，将促进关节软骨修复这一难题的解决。【参考文献】 1 Chajra H,Rousseau CF,Cortial D,et al.Collagen-based biomaterials and cartilage engineering. 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