一个肿瘤新生血管内皮新标志分子的分离鉴定及AA98抗体片段VHL的表达复性

中中 国国 科科 学学 院院 微微 生生 物物 研研 究究 所所 博士后出站报告博士后出站报告 一个肿瘤新生血管内皮新标志分子的分离鉴定及 AA98 抗体片段 VH/L 的表达复性 张志强 指导教师姓名： 阎锡蕴 研究员 中国科学院微生物研究所 二零零一年八月 The Separation and identification of a Novel Target Molecule in Tumor Neovascular Endothelial Cell an activation antigen on human endothelial cells. Blood, 1997, 90: 1150 1159 77 Chandrasekaran L, He C, Al-Barazi H, et al. Cell contact-dependent activation of 31 integrin modulates endothelial cell responses to thrombospondin-1, Molecular Biology of the Cell, 2000, 11: 28852900 78 Seki M. Membrane type-matrix metalloproteinase and tumor invasion. Curr Top Microbio Immunol, 1996, 213: 2332 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 文献综述文献综述 22 79 汤健, 阎锡蕴, 刘元义等. IV 型胶原酶人基因工程抗体的研制. 中国科学 C 辑, 1998, 28(3): 277282 80 王维刚, 张胜华, 李毅等. 以型胶原酶为靶点的细胞内表达单链抗体的抗肿瘤 作用, 中国科学(C 辑), 2000, 30(2): 123130 81 Ignar D M, Andrews J L, Witherspoon S M, et al. Inhibition of establishment of primary and micrometastatic tumors by urokinase plasminogen activator receptor antagonist. Clin Exp Metastasis, 1998, 16: 920 第二部分 抗体在肿瘤诊断和治疗中的应用 从 1975 年杂交瘤技术问世及 1982 年 Miller1最早揭示单克隆抗体在临 床应用中的巨大潜力以来，世界各国广泛开展起来了单克隆抗体的研究。在 早期的研究中，单克隆抗体在体内所引起的免疫应答以及从动物试验中获得 的显著疗效，极大地鼓舞了研究人员的热情。然而，研究的进展并不象人们 预先想象的那样顺利。一方面，单克隆抗体在动物试验中疗效往往在人体试 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 文献综述文献综述 23 验中得不到重现， 同时还可能产生致命的毒副作用和超免疫反应。 另一方面， 当时抗体的制备也相当昂贵。近年来，抗体基因工程技术的发展促进了单克 隆抗体在临床中的应用。 据报道2， 已有 10 种单克隆抗体作为临床治疗药物 得到了 FDA 的批准， 其应用范围包括： 抗肿瘤治疗、 移植排斥、 RA 和 Crohn 病、抗病毒预防及抗血栓形成等多方面。其中，单克隆抗体在肿瘤诊断和治 疗中的应用，尤其引起人们的关注。目前有多种抗肿瘤抗体正在进行第一或 二期临床试验。本文主要论述单克隆抗体、人源化抗体及抗体片段在肿瘤诊 断和治疗中的应用进展。 1. 单克隆抗体 70 年代末发展起来的杂交瘤技术为肿瘤的抗体诊断和治疗提供了基础， 使单克隆抗体介导的肿瘤靶向显像分析和药物治疗、降低全身用药的毒副作 用成为可能。其中，以单克隆抗体为基础的免疫检测应用最广泛。单克隆抗 体在肿瘤诊断方面的应用主要有： 放射免疫显像分析 放射性核素对单克隆抗体的成功标记，是单 克隆抗体在肿瘤诊断中最重要的进展。如单克隆抗体经 131I 标记后注入患者 体内，经过 48 至 72 小时后，进行体外扫描，可以显示肿瘤所在的部位，从 而得到肿瘤准确的定位图象。 单克隆抗体结合 FACS（Fluorescence activated cell sorter）技术进行 免疫学和医学检测 FACS 技术曾为细胞的鉴定和筛选带来了方便，但常 规的 FACS 试剂存在的不足限制了 FACS 技术的进一步发展。近年来，以单 克隆抗体作为 FACS 试剂的研究发展迅速。单克隆抗体作为 FACS 试剂的研 制成功，使限制 FACS 技术在生物学和医学检测中应用的瓶颈难题就得到了 很好的解决。目前，单克隆抗体结合的 FACS 技术在临床诊断中的应用已经 从癌症检测扩展到白血病、HIV 等的检测3。 以抗体为基础的蛋白质芯片技术 以抗体为基础的普通免疫分 析，每天能分析的样品数量是非常有限的，同时也往往只能检测已知的分析 物，这对于蛋白质组的分析是无能为力的。采用类似于 DNA 芯片的原理， 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 文献综述文献综述 24 可以制备抗体库蛋白质芯片来大规模分析蛋白质组4。在医学上，人们采用 抗体蛋白质芯片，通过对比健康细胞和病人细胞的蛋白质组谱的不同，就能 了解细胞的信号和代谢途径，进而开出新颖的治疗药物。已有报道应用抗体 蛋白质芯片来检测人细胞培养过程中细胞的变化情况5。抗癌 p53 基因的抗 体芯片检测人血清，能被用作来肿瘤的早期诊断6。该方法具有简单、快速 和灵敏度高的特点。为保证作为检测探针的抗体的多样性，必须依赖重组抗 体技术和抗体库技术。如何将多样性的抗体排列在芯片上，抗体蛋白质芯片 技术需要解决的问题。 细胞学诊断 应用抗肿瘤单抗对肿瘤转移引起的腹水或胸水进行 免疫荧光或免疫酶标细胞学检测，可以得到较普通细胞学检测更为准确的结 果，不但可以提高阳性率，而且能够辨别转移肿瘤的来源。 血清学检测 在一些恶性肿瘤患者的血清中，有肿瘤相关抗原的 表达。 应用胃癌单克隆抗体进行免疫学检测， 可以测得血清中的胃肿瘤抗原。 这一手段还可用于观察病情、 判断疗效、 监视肿瘤复发。 如应用 111In-CYT-356 对前列腺癌术后前列腺特异抗原升高的患者的诊断表明，该方法可以检出前 列腺窝部位和淋巴结的转移7。 病理组织学诊断 应用单克隆抗体通过免疫组织化学方法如 ABC 法进行组织切片染色。 在单克隆抗体治疗方面，人们利用单克隆抗体识别抗原的高度特异性， 针对肿瘤细胞特异或相关抗原进行了大量的研究。如利用单克隆抗体本身的 细胞毒作用，在临床中直接将抗体用于抗肿瘤治疗。但单克隆抗体与抗癌剂 交联后进行的肿瘤导向治疗，往往有更理想的疗效。能够与单克隆抗体交联 的分子有放射性核素、免疫毒素、细胞因子及化疗药物等。常用于抗体标记 的放射性核素如表 1 所示8。常用的免疫毒素有蓖麻蛋白 A 链、假单孢菌外 毒素 A、 白喉毒素、 丝裂霉素及阿霉素等。 而细胞因子则包括-干扰素和 IL-2 等。已有动物试验表明，IL-2 或者 TNF 与抗体组成的融合蛋白质，能引起 小鼠抗肿瘤免疫应答9。蓖麻蛋白 A 链与抗 GD2 抗体形成的融合蛋白具有 抑制神经胶质瘤活性10。以单克隆抗体融合蛋白为基础治疗，将是肿瘤免疫 治疗的重要策略。 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 文献综述文献综述 25 经过 20 多年的实践，以单克隆抗体为导向的治疗虽然在动物体内取得 了成功，而临床效果并不理想。主要原因是这些单克隆抗体多为鼠源性的完 整抗体。这种抗体的分子量大，难以穿透到肿瘤内部11；在人体内使用时会 产生 HAMA 反应，使临床疗效减弱或消失。为解决导向药物难以达到肿瘤 内部的问题，近年来开展了以肿瘤血管为靶的抗体导向治疗12, 13。以肿瘤血 管为靶的抗体治疗策略主要有抗血管生成疗法和抗血管疗法两种，这两种策 略在动物试验中均取得了令人鼓舞的发展。这些治疗肿瘤的新方法，一部分 已经进入临床试验，为恶性肿瘤的治疗提供了又一新手段14, 15。 表 1-2 常用于肿瘤导向治疗的放射性核素 放射性核素 半衰期 能量（MeV） 发射射线的核素 211As 7.2 hr 5.866 212Bi 60.6 min 6.090 发射射线的核素 67Cu 2.6 d 0.484, 0.577 177Cu 6.7 d 0.497 131I 8.1 d 0.336 32P 13.5 d 1.711 186Re 3.8 d 0.934 188Re 16.9 hr 1.973 90Y 2.6 d 2.288 发射俄歇电子的同位素 77Br 2.4 d 0.002 123I 13.0 hr 0.003 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 文献综述文献综述 26 125I 60.3 d 0.007 2. 人源化抗体 进行单克隆抗体的临床治疗的一个关键步骤是解决鼠源性抗体的 HAMA 反应问题，即对鼠抗进行人源化改造。80 年代以来，人们用基因工 程技术对鼠进行人源化，制备了人-鼠嵌合抗体16和改型抗体17；从噬菌体 抗体库中筛选人抗体18；采用基因打靶技术获得转基因小鼠，直接生产人抗 体19, 20。但由于嵌合抗体中约 35%的部分是鼠源的，仍可能引起不同程度的 HAMA 反应。改型抗体设计方案复杂，技术难度大，且难以保持原鼠抗的亲 和力。从转基因小鼠生产人抗体的技术难度大，不易获得多样性的转基因小 鼠。抗体库技术的发展为鼠源性抗体人源化提供了一条新的思路21。从抗体 库中不仅可以筛选出完全的人抗体，而且由于其筛选过程类似于体内抗体生 成过程，因此可能获得高亲和力的新型抗体，但条件是首先必须建立足够多 样性的抗体库。 鼠抗人源化改造成功的例子是抗 VEGF 抗体的人源化22。 抗 VEGF 抗体 在体内通过阻断 VEGF 与受体的相互作用， 即可抑制肿瘤内皮细胞生长和血 管生成，从而阻止肿瘤的生长和转移23。而从抗体库筛选出的抗 TNF抗体 和抗 TGF2 抗体，已经进入临床试验期或期24。另有一系列从抗体库 获得的抗肿瘤和抑制肿瘤血管生成的抗体，亲和力高。目前这些人抗体在医 疗应用方面的研究正广泛开展25。 3. 抗体片段 采用抗体工程技术制备的抗体片段，包括 Fab 及单链抗体 ScFv 等。其 中以单链抗体 ScFv 的研究最广泛。ScFv 是具有完全抗原结合位点的最小抗 体片段，大小为完整抗体的六分之一，约为 27kD。与完整抗体相比，抗体 片段的优势主要体现在如下 5 个方面： 可以通过基因工程手段大量获得， 价格低廉；容易进入实体瘤周围的微环境； 免疫原性低，不易产生抗 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 文献综述文献综述 27 异种蛋白反应； 半衰期短，在肾肾脏中蓄积少； 不易与具有 Fc 受体 的非靶细胞结合，显像分析应用中成像清晰。抗体片段也有不足，主要是： 抗体片段多为单价抗体，它与抗原的结合力较弱； 半衰期短，容易从 血液中清除； 缺乏 Fc 段，只有中和抗原的能力，不具备激活补体系统和 介导细胞免疫的功能。抗体片段如 ScFv 在肿瘤诊断和治疗中的应用主要有 如下几方面： 3.1 肿瘤的诊断分析 完整抗体应用于肿瘤的放射免疫显像诊断的缺点是完整抗体在肿瘤组 织中有清除速率慢，显像分析需要的时间长，抗体的非特异性结合（如与 Fc 段结合）使本底升高。而放射性核素标记的抗人肿瘤相关抗原 ScFv，同样能 有效地集中在肿瘤局部。已有 ScFv 显像分析诊断黑色素瘤、乳腺癌和卵巢 癌成功的报道。如 George 等26研制的 99Tcm标记的抗卵巢癌 ScFv，不但具 有良好的亲和活性， 而且在血浆中很稳定， 对人卵巢癌显像效果很好。 Marlies 等27用 99Tcm标记的抗肿瘤相关抗原的 ScFv， 24 小时后测得肿瘤部位的放射 活性占总量的 4%。 3.2 肿瘤的治疗 单链抗体除本身作为抗肿瘤药物直接用于临床治疗外，更多的是它作为 载体，通过连接在其 C 端的效应分子进行肿瘤的导向治疗。与单链抗体连接 的效应分子有放疗药物、放射性核素、免疫毒素及细胞因子等。目前研究较 多的是单链抗体与免疫毒素的偶联或融合，如融合蛋白通过抗体的导向，将 毒素引至肿瘤细胞而更好地发挥杀伤作用。由于单链抗体融合蛋白去除了毒 素原有的受体结合位点，因此毒性低；去除了完整抗体的 Fc 段，因此免疫 原性低，易于穿透肿瘤组织。从总体上说，在肿瘤治疗中单链抗体比完整抗 体更具优势和潜力。 如将抗卵巢癌 ScFv 基因与假单孢菌外毒素基因 pE40 相 连，表达出具有抗原结合能力和细胞毒作用的重组单链抗体-免疫毒素 Tac(Fv)-pE40，治疗治疗裸鼠体内的移植瘤时可以使肿瘤完全消退28。Wels 等29表达的抗 erbB-2 和 EGF 受体单链抗体免疫毒素， 治疗表达 erbB-2 的肿 瘤，可以使肿瘤缩小。 3.3 肿瘤疫苗 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 文献综述文献综述 28 抗体在肿瘤疫苗方面的应用主要是指抗独特型抗体肿瘤疫苗。抗原刺激 机体产生相应抗体 Ab1，Ab1 又能刺激该动物产生 Ab2，能同 Ab1 竞争结合 抗原的 Ab2 与 Ab1 将结合抗原上的相同决定簇，这样的 Ab2 称抗独特型抗 体。抗独特型抗体具有模拟抗原及免疫调节的双重作用。它可以打破机体对 肿瘤的免疫抑制状态，诱导机体产生类似于肿瘤特异性抗原的免疫应答，同 时又与正常组织无交叉，不易诱发对自身组织的免疫应答。恶性黑色素瘤、 结直肠癌及淋巴瘤等人类肿瘤的抗独特型肿瘤疫苗，已经进入了临床试验， 并观察到了保护性免疫反应。 Mittleman 等30采用 HMW-MAA 的 Ab2治疗 恶性黑色素瘤发现，60%患者产生了抗 HMWHAA 抗体（Ab3） ，Ab3 反应 与患者存活期的延长显著相关。而将识别人卵巢抗原 CA125 的单链抗体 ScFv-PDL10 应用于 PLGA 中心体包裹免疫小鼠，其体内可产生抗独特型抗 体，说明该单链抗体可以作为一种免疫疫苗应用于肿瘤治疗31。应用抗独特 型抗体替代原始肿瘤疫苗有利于疫苗的标准化，避免了原始肿瘤抗原可能带 有肿瘤病毒及癌基因等潜在危险。研究显示，抗独特型抗体诱导保护性免疫 反应的过程中受到多种因素的调节，具体调节方式及其被诱导的机制也有待 阐明。 3.4 单链抗体基因导入宿主体内 Deshane等32人将抗erbB-2单链抗体通过腺病毒载体注入卵巢癌患者的 腹腔内， 在人体中很容易检测到 ScFv， 该抗体保持了肿瘤特异性的生物学效 用，且没有发现与与载体有关的毒性。目前，主要用作为载体将单链抗体导 入宿主体内。由于腺病毒感染时，DNA 不整合到宿主细胞染色体中，安全 性高，并且很容易在肠道、呼吸道等处繁殖，所以腺病毒介导的基因转移不 仅可以采用静脉注射重组病毒的方式，而且可以将重组病毒制成胶囊和药 液，通过口服、喷雾等简单的方式导入体内。 4. 双功能抗体 双功能抗体是指将抗体分子改造后生成的具有两种不同抗原结合特异 性的抗体分子。双功能抗体可以通过化学交联、基因工程手段及生物学方法 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 文献综述文献综述 29 获得。双功能抗体的一个臂往往结合靶细胞表面抗原，另一个臂结合免疫活 性细胞表面的特征分子，从而将抗体的靶向性与激活免疫细胞的杀伤功能结 合起来。这种抗体可以是完整抗体，也可以是单链抗体。以肿瘤细胞和肿瘤 血管为靶的双功能抗体研究有不少报道33。 其中以单链抗体为基础构建的双 特异性抗体，具有体积小，副作用少，快速进入肿瘤组织的特点，愈来愈受 到重视。 大多数双功能抗体都是将靶细胞与 CTL 连接起来，发挥 CTL 的细胞毒 杀伤作用。 如将抗荧光素单链抗体和抗 TCR 单链抗体连接， 在 E.coli 中表达 得到的双功能单链抗体， 可以识别并结合标记有荧光素的肿瘤细胞和 T 细胞 （主要 CTL） ， 而使 CTL 活化对肿瘤产生杀伤作用34。 CD3/神经胶质瘤双功 能抗体也已应用于神经胶质瘤的临床前期试验，该抗体同样可以激活杀伤性 T 细胞35。 同样， 蓖麻蛋白 A 链与抗 CD3xanti-GD2 抗体形成的双功能抗体， 具有抑制神经胶质瘤的活性10。 但是， 双功能抗体的稳定性往往不是太理想， 这是临床应用中需要解决的问题。 参 考 文 献 1 Miller RA. 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Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92: 7021-7025 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 实验研究工作实验研究工作 34 实验研究工作 第一部分 抗体 AA98 特异性靶分子的分离鉴定 1引言 以新生血管为靶的肿瘤导向治疗研究已成为肿瘤综合治疗的重要组成 部分。 该疗法的理论基础是 Folkman 等提出并发展起来的肿瘤的生长和转移 依赖于血管生成的观点1, 2，以及肿瘤新生血管不同于正常血管的事实。与 正常血管相比，肿瘤血管处于快速增殖状态。肿瘤血管管腔膨胀或呈囊状， 血管内皮细胞稀少，基底膜不完整，缺乏周细胞和血管平滑肌，血管渗漏性 高3。同时，肿瘤血管不具备完整的微循环功能，血管生成后不再分化，不 具备有收缩功能，不受神经及体液调节。 肿瘤血管导向治疗所采用的策略有两种4： （1）抗血管生成疗法 （anti-angiogenesis therapy） ，即防止和抑制肿瘤新生血管的形成，以抑制肿 瘤的增大和转移。 （2）抗血管疗法（anti-vasculature therapy） ，即直接或间接 破坏已经形成的肿瘤血管，使肿瘤因缺血坏死而消退。同肿瘤治疗的常规方 法、特别是化疗和放疗等方法相比，肿瘤血管导向疗法具有高效、低毒、广 谱及不易产生耐药性等明显优势5-8。 肿瘤血管导向治疗策略成功的一个关键是药物所作用的靶分子选择。在 肿瘤血管生成过程中，内皮细胞快速增殖和迁移，常常过度表达一些正常血 管不表达或低表达的分子。发现和筛选这些肿瘤血管特异性分子，为肿瘤血 管导向治疗寻找理想的靶标，是目前抑制肿瘤研究领域的热点。肿瘤新生血 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 实验研究工作实验研究工作 35 管内皮细胞是肿瘤靶向治疗最重要的靶位9，这不仅是由于内皮细胞在血管 生成过程中变化极为显著，而且内皮细胞最直接与血液循环中的药物接触。 近十年来，国际上陆续报道了一些肿瘤血管刺激因子和抑制因子及其相应的 受体分子。如血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, 简称 VEGF)及受体、 血管生成因子 （Angiopoietin） 、 内皮细胞抑制素 （endostatin） ， 血管抑制素（angiostatin） ，整合素v3，选择素 E 等等10。其中一些已进入 临床期实验，并显示出了良好的应用前景。 特异性靶分子可以通过多种途径来寻找，例如化学药物、抗体蛋白质和 基因分析等。 最近， Croix 等9人从基因水平比较了恶性结肠癌组织内皮细胞 和正常的血管内皮细胞，证实肿瘤血管内皮上可能存在众多可资利用、与血 管生成相关的特异性靶点。 抗体 AA98 是我室筛选和制备的一株肿瘤血管的特异抗体，体内外试验 表明该抗体具有明显的抑制血管生成作用，能识别 20 多种不同肿瘤的新生 血管而不与重要脏器的正常血管、外周血及骨髓发生反应，是一种很有潜力 的抗肿瘤药物。以抗体 AA98 为工具，本研究鉴定出了肿瘤血管内皮上的一 个新靶标。该分子与抗体 AA98 具有高度特异性，在多种肿瘤血管内皮中有 表达，而不在正常组织及其毛细血管中表达，可望成为肿瘤血管导向治疗的 新的高效靶标。 2实验材料和方法 21 实验材料和主要仪器 实验材料包括：抗体 AA98 由本实验室制备和提纯；正常与肿瘤组织标 本购自北京肿瘤医院；脐带来自北京市和河南省的不同医院；ATCC 的人脐 静脉内皮细胞（HUVEC） ；Zymed 的 Biotin 偶联羊抗鼠 IgG（H+L） ；Sigma 的 AP 偶联羊抗鼠链及十二烷基磺酸纳（SDS） ；Fluka 的显色底物 DAB 和 NBT/BCIP 及丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺；Pharmacia 的 CNBr-Sepharose、 Sephacryl 200、 DEAE Sepharose 及 Sephadex G100； Amersham 的硝酸纤维素 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 实验研究工作实验研究工作 36 （NC）膜和 PVDF 膜；其余试剂为国产分析纯。 主要仪器包括：上海第三分析仪器厂 UV-754 型紫外可见分光光度计； Bio-Rad 液相层析系统 Biologic LP，Bio-Rad 蛋白电泳槽 Mini-PROPEAN II Cell, 电转移槽及电泳仪 Power/Pac200；Bio-Rad 酶联免疫检测仪 Model 550 Microplate Reader； 湖北黄石医疗器械厂电热恒温培养箱； Sigma 台式离心机 1-15；Sigma 台式冷冻离心机 3K30；上海精密仪器厂普通和精密电子天平； Pharmacia 的 Protein G 柱、 Protein A 柱、 Mono Q 柱、 Superdex 200 柱和 FPLC 系统。 22 实验方法 2.2.1 从脐带中提取靶分子 取新生儿脐带，纵行剪开，洗去血凝块。将脐静脉血管内壁撕下，剪碎 后在冰上研磨，按 2ml/g 血管内壁加入缓冲溶液，4C 静置提取 2h，10,000g 离心 15min，收集上清液并用 0.05M、pH7.5 的 PBS 透析过夜，即为靶标蛋 白质粗提液。 2.2.2 抗体 AA98 的亲和层析纯化 取含抗体 AA98 的细胞培养上清或腹水，过滤除不溶物。调节 pH 值到 8.0 左右。Protein G 或 Protein A 柱用 0.1M, pH8.0 的 PBS 平衡后，将粗品溶 液以 0.3 ml/min 的速度上到柱中， 依次用 0.1M, pH8.0 的 PBS、 0.5M 的 NaCl 溶液和 0.1M, pH8.0 的 PBS 洗去杂蛋白。最后用 0.1M, pH2.8 的甘氨酸-盐酸 将抗体 AA98 洗脱下来。洗脱下抗体 AA98 溶液用 Tris-HCl 调节 pH 值至中 性，并用 0.05M、pH7.5 的 PBS 透析过夜。 2.2.3 离子交换层析分离靶分子 将离子交换层析柱（Mono Q 柱或用 CM Sepharose、DEAE Sepharose 等 装填成的 1.0cm15cm 柱）用初始平衡缓冲液充分平衡。靶分子粗品溶液透 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 实验研究工作实验研究工作 37 析除盐和调节 pH 值后，以 0.5 ml/min 的速度上到柱中，用初始平衡缓冲液 洗掉未被吸附的杂蛋白后， 采用 0-1.0M NaCl 溶液梯度洗脱， 洗脱速度为 1.0 ml/min。收集各组分，检测靶分子所在的洗脱峰。 2.2.4 凝胶过滤层析分离靶分子 凝胶过滤层析柱为 10mm1000mm，将分离介质均匀装填到柱中，并用 0.15M NaCl, 0.02M、pH7.5 的 PBS 充分平衡装填好的层析柱。取获得的靶分 子蛋白质粗提液2.0mL上到柱中并洗脱， 流动相为0.15M NaCl, 0.02M、 pH7.5 的 PBS， 流速 0.2-0.5 ml/min， 收集富含靶分子蛋白质的洗脱部分， 用 0.05M、 pH7.5 的 PBS 透析过夜后超滤浓缩后待分析。 2.2.5 抗体 AA98 免疫亲和层析凝胶的制备 方法 1 以 CNBr-Sepharose 为基质的亲和凝胶制备 CNBr-Sepharose 的预处理 取 0.5g 凝胶溶胀于 1mM 的 HCl(pH2-3)中，并用 150ml 1mM 的 HCl(pH2-3)分次淋洗，去除胶中的 添加剂。 配基 （抗体 AA98） 的准备 将配基溶解于 0.1M NaHCO3, pH8.3, 0.5M NaCl 中，体积为 5ml/g 干胶，蛋白质按 5-10mg/ml 胶加入。 将预处理好的胶与配基溶液混合，室温轻微摇动 1 h，或 4过夜。 用 5 体积的 0.1M NaHCO3, pH8.3, 0.5M NaCl 淋洗掉多余的配基。 用 0.1M Tris-HCl, pH8.0 或 1M 的乙醇胺, pH8.0 封尾 2 h. 用 A 溶液和 B 溶液交替清洗胶，每次 5 体积，重复三次 A: 0.1M acetate buffer, pH4.0, 0.5M NaCl B: 0.1M Tris-HCl, pH8.0, 0.5M NaCl 方法 2 以 protein A Sepharose 为基质的亲和凝胶的制备 将 AA98 溶液与 protein ASepharose 混合，室温轻微摇动 1 h，使 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 实验研究工作实验研究工作 38 每毫升凝胶上至少吸附 2 毫克抗体。 用 0.2M, pH9.0 硼酸盐缓冲溶液洗涤胶 2 次， 每次 10ml/ml 胶。 温 和离心收集凝胶。 将凝胶悬于 10 倍体积的 0.2M, pH9.0 硼酸盐缓冲溶液中，加入固 体 Dimethylpimelimidate 至 20mM 的浓度。 室温轻微摇动 1 h。 温和离心收集凝胶，用 0.2M Tris-HCl, pH8.0 或 0.5M 的乙醇胺, pH8.0 封尾 2 h. 2.2.6 亲和层析纯化 AA98 靶分子 将制备好的免疫亲和凝胶装入内径为 10mm 的层析柱中，用 0.05M、 pH7.5 的 PBS 充分平衡。 将靶标蛋白质粗提液以 0.2ml/min 的速度上到柱中， 用 PBS 淋洗掉未被吸附的杂蛋白，然后用 1.5M 的 KCNS 溶液洗脱出 AA98 靶标蛋白质，洗脱速度为 1.0ml/min。亲和柱用 PBS 平衡备下次使用。将含 靶标蛋白质的洗脱液用 0.05M、pH7.5 的 PBS 透析过夜后，超滤浓缩备用。 2.2.7 AA98 靶标分子的免疫印迹检测 将 AA98 靶标蛋白质用 10% SDS-PAGE 凝胶进行电泳分离，电转移 （0.2-0.4A, 1h）至硝酸纤维素膜。5%（W/V）脱脂奶粉将膜封闭 2h，于封 闭液中加入 AA98 抗体至 1g/mL， 370C 温育 2h， 0.05%Tween-20/PBS 和 PBS 各洗膜三次，每次 5min。加 AP/羊抗鼠链，370C 继续温育 1h， 0.05%Tween-20/PBS 和 PBS 各洗膜三次，每次 5min。用氮蓝四唑（NBT）/5- 溴-4-氯-3-吲哚-磷酸（BCIP）底物显色。 2.2.8 靶分子的 ELISA 检测 取靶分子样品溶液调节 pH 值后包被 96 孔免疫板，50l/孔，湿盒内 40C 过夜。5%脱脂牛奶在 370C 封闭 2h。弃封闭液，每孔加 50l 的用牛奶稀释 张志强博士后出站报告张志强博士后出站报告 实验研究工作实验研究工作 39 的 AA98 抗体，湿盒内室温 2h。用 PBST 和 PBS 各洗 3 次。加 1：2000 稀 释的 HRP-羊抗鼠二抗，50l/孔，湿盒内室温 2h 后，用 PBST 和 PBS 洗涤。 用 OPD 底物液显色 15min，2MH2SO4终止反应后，酶标仪测定 490nm 吸光 度。 2.2.9 AA98 靶分子蛋白质末端氨基酸序列分析 将 AA98 靶分子蛋白质用 10% SDS-PAGE 凝胶进行电泳分离，电转移 （0.2-0.4A, 2h）至 PVDF 膜。用 0.1%（G/V）的考马斯蓝染色，用 1：1 的 甲醇/水漂洗膜后， 小心切下目标蛋白质带， 用蛋白质氨基酸序列自动分析仪 测定蛋白质末端氨基酸序列。 3 实验结果 3.1 抗体 AA98 的靶分子的分布 采用 protein A 亲和层析纯化抗体 AA98，其纯度可达到 95%以上。亲