粘附分子CD146的抗体及其在疾病检测中的应用

分类号 分类号 密级 密级 UDC 编号 编号 中国科学院研究生院 中国科学院研究生院 博士学位论文博士学位论文 粘附分子粘附分子 CD146 的抗体及其在疾病检测中的应用的抗体及其在疾病检测中的应用 张莹 张莹 指 指 导导 教教 师师 阎 锡 蕴 研究员 阎 锡 蕴 研究员 中国科学院生物物理研究所 中国科学院生物物理研究所 申请学位级别 申请学位级别 博士 博士 学科专业名称 学科专业名称 生物化学与分子生物学 生物化学与分子生物学 论文提交日期 论文提交日期 2008 年 12 月 2008 年 12 月 论文答辩日期论文答辩日期2008 年 12 月 30 日 2008 年 12 月 30 日 培 培 养养 单单 位 位 中国科学院生物物理研究所 中国科学院生物物理研究所 学位授予单位 学位授予单位 中国科学院研究生院 中国科学院研究生院 答辩委员会主席 答辩委员会主席 目录 目录 摘要II 摘要II AbstractIV AbstractIV 文献综述:细胞粘附分子与炎症1 文献综述:细胞粘附分子与炎症1 细胞粘附分子1 细胞粘附分子1 细胞粘附分子与炎症反应5 细胞粘附分子与炎症反应5 可溶性粘附分子8 可溶性粘附分子8 细胞粘附分子CD14611 细胞粘附分子CD14611 研究内容15 研究内容15 第一部分 CD146 不同表位的抗体及其在疾病检测中的应用 15 第一部分 CD146 不同表位的抗体及其在疾病检测中的应用 15 一、材料与方法.16 一、材料与方法.16 二、实验结果.24 二、实验结果.24 三、讨论.39 三、讨论.39 第二部分 外周血单核细胞CD146 在炎症发生过程中的作用及机制 42 第二部分 外周血单核细胞CD146 在炎症发生过程中的作用及机制 42 一、材料与方法.43 一、材料与方法.43 二、实验结果.46 二、实验结果.46 三、讨论.55 三、讨论.55 参考文献57 参考文献57 在读期间已发表和待发表文章64 在读期间已发表和待发表文章64 致 谢.65 致 谢.65 I 张莹博士学位论文2008 摘要 摘要摘要 细胞粘附分子 CD146 是一个新近发现的血管内皮细胞标志分子，参与细胞 间的粘附及血管新生过程。然而，以不同的 CD146 抗体为工具对其组织表达谱 及生物学功能进行研究时，往往得到不同的结果。例如，抗 CD146 单抗 S-endo1 和 P1H12 均能广泛结合各种血管的内皮细胞； 而单抗 MUC18 只结合毛细血管和 高内皮微静脉；我们实验室自制的 CD146 单抗 AA98 则特异结合新生血管内皮 细胞，特别是肿瘤血管内皮细胞上的 CD146 分子，而且，AA98 具有抑制血管内 皮细胞增殖和迁移的活性，可用于以肿瘤血管为靶标的肿瘤靶向治疗，这是已报 道的其它 CD146 抗体都不具备的新特性。分析上述研究结果，我们推测这可能 是由于不同的 CD146 抗体分别识别不同的抗原表位，造成结合谱和功能上的差 异。为证明该假设，我们又制备了一组（6 株）识别 CD146 不同表位的单克隆 抗体，分别命名为 AA1、AA2、AA3、AA4、AA5 和 AA7，与 AA98 一起，在 分子、细胞和组织水平系统研究了它们的识别表位及组织结合谱，借此阐明 CD146 介导细胞粘附及血管新生过程的结构学基础， 并探讨 AA98 抑制血管内皮 细胞增殖和迁移功能的机制。 表位鉴定表明， AA1 和 AA2 识别 CD146 第 24-128 位氨基酸之间的肽段； AA3、 AA4、 AA5和AA7识别的表位位于CD146第335-381 位氨基酸之间；AA98 则特异识别一个位于 CD146 第 313-560 区段内依赖于二 硫键的构象表位。细胞免疫荧光结果显示，AA1、AA2 和 AA98 可以识别活细胞 膜表面的 CD146 分子，而另外 4 株抗体则不能；与该结果相呼应的是，免疫组 化结果显示，AA1、AA2 和 AA98 识别冰冻组织切片上保持天然构象的 CD146 蛋白，而 AA3、AA4、AA5 及 AA7 只识别经甲醛固定而引起表位变化的石蜡组 织切片。上述结果提示，AA1、AA2 和 AA98 识别的均是 CD146 天然构象中的 表位，而 AA3、AA4、AA5 和 AA7 识别的表位在天然状态的 CD146 中不存在 或不暴露。 在分析了上述抗体的识别表位的基础上， 进一步的抗体功能研究表明， 尽管识别 CD146 天然构象，但 AA1 对血管内皮细胞的增殖、粘附和迁移没有影 响； 只有 AA98 具有抑制血管内皮细胞的增殖和迁移的活性。 这些结果提示我们， AA98 识别的抗原表位是 CD146 介导内皮细胞增殖和迁移的关键结构， 首次在表 位水平揭示了 CD146 作用机制的结构学基础。 在上述研究结果的基础上，我们利用抗 CD146 不同表位的抗体 AA1 和 AA98， 建立了新的双抗体夹心 ELISA 检测体液中可溶性 CD146 （soluble CD146, sCD146）的系统。过去的研究显示，在慢性肾衰、血管炎等炎性疾病患者血清 中的 sCD146 存在过量表达。而在本研究中，我们利用自己建立的 sCD146 检测 系统， 首次在脑脊液中发现了sCD146的存在。 不仅如此， 进一步对脑脊液sCD146 与炎症的相关性研究表明，与正常人脑脊液中的 sCD146 水平（0.040.047nM， n=22）相比，多发性硬化（multiple sclerosis, MS）和急性播散性脑脊髓炎（acute disseminated ence-phalomyelitis, ADEM）等炎症患者的脑脊液 sCD146 水平明显 升高（P90%。接下来我们以 0.134nM 作为判定标准，若脑脊液 sCD146 高于此值，我们初步判定该病例有可 能表现为中枢神经系统脱髓鞘病。据此标准，我们发现，在 MS 组 26 名患者中 有 18 例患者被检出，而 ADEM 组 11 名患者中则有 10 例被检出，其检出的灵敏 度分别为 69.23%和 90.91%。 表 1-2：患者脑脊液中 sCD146 含量与临床指标间的相关性分析。 MS 相关系数相关系数 rP ADEM 相关系数相关系数 r P 年龄 0.099 0.632 年龄 0.073 0.831 血清血清 sCD146(ng/ml) 0.567 0.003*血清 sCD146(ng/ml)0.187 0.582 IgG 合成率 -0.203 0.321 IgG 合成率 0.131 0.702 IgG 指数 -0.116 0.572 IgG 指数 0.111 0.744 BBB 通透率 -0.045 0.827 BBB 通透率 0.278 0.408 c MBP -0.474 0.014*c MBP -0.177 0.604 s MBP -0.401 0.042*s MBP -0.191 0.573 c MBP.Ab -0.04 0.846 c MBP.Ab 0.145 0.67 s MBP.Ab 0.23 0.259 s MBP.Ab 0.274 0.415 c MOG.Ab 0.094 0.648 c MOG.Ab 0.078 0.819 s MOG.Ab 0.029 0.887 s MOG.Ab 0.214 0.527 c MBP： 脑脊液髓鞘碱性蛋白 （Myelin Basic Protein） ， s MBP： 血清髓鞘碱性蛋白， c MBP.Ab： 脑脊液髓鞘碱性蛋白抗体，s MBP.Ab：血清髓鞘碱性蛋白抗体，c MOG.Ab：脑脊液髓鞘少 突胶质细胞糖蛋白（Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein）抗体，s MOG.Ab：血清髓鞘少突 胶质细胞糖蛋白抗体。（*：P0.05，*：P0.01） 为进一步分析 sCD146 与脱髓鞘病疾病进程的关系，我们将 MS 患者和 ADEM 患者脑脊液中的 sCD146 数据分别与临床指标如血清 sCD146、IgG 合成 率、BBB 通透率、c MBP、c MBP.Ab、c MOG.Ab 等进行相关性分析（表 1-2）。 结果显示 MS 组脑脊液 sCD146 与血清 sCD146、c MBP、s MBP 之间有相关性， 尤其是与血清中的 sCD146。MBP 是组成髓鞘的主要蛋白之一，具有神经组织特 异性。凡中枢神经系统病变累及髓鞘时，MBP 可释放入脑脊液，且 MBP 的含量 增高与髓鞘的破坏程度平行，故脑脊液 MBP 可作为判断中枢神经系统破坏程度 的指标，但由于血脑屏障的特殊作用，MBP 仅有少量进入血液中。当血脑屏障 遭到破坏时，血清中 MBP 明显增多，从而反映了血脑屏障破坏的范围，这两个 指标是作为脱髓鞘或脑损害的特异性生化指标125。MS 患者脑脊液 sCD146 的 水平与这两个临床指标相关，提示我们 sCD146 在 MS 患者脑脊液中的变化可以 反应 MS 患者的疾病进程。血清 sCD146 由于本底水平较高，病理情况的变化不 36 张莹博士学位论文2008 研究内容 足以使之产生与正常情况血清 sCD146 的显著性差异，但 MS 患者血清 sCD146 的水平与脑脊液 sCD146 的水平相关，进一步说明体液 sCD146 的变化是在病理 过程中产生的。但对 ADEM 组患者来说，脑脊液 sCD146 的水平则与所有的指 标均没有相关性，这种情况也许是由于不同的发病机理造成的差别，但也可能是 该组样本的病例数较少造成。 关于此方面的研究尚需更多的病例及试验证据的支 持。 综上，我们发现在正常人脑脊液中，sCD146 含量应该是无或痕迹量，但当 发生中枢性神经系统脱髓鞘病变时，脑脊液中的 sCD146 异常升高，且其水平与 临床指标 c MBP、 s MBP 相关。 脑脊液 sCD146 水平在正常和病理情况下的变化， 使之有可能成为中枢神经系统脱髓鞘病的的诊断中新的辅助诊断指标。 7.3 CD146 在脱髓鞘病病灶部位的血管高表达在脱髓鞘病病灶部位的血管高表达 以上结果显示，sCD146 在中枢神经系统脱髓鞘病患者脑脊液中有显著地升 高，那么造成这种变化的原因是什么呢？为更好的回答这个问题，我们利用免疫 组化检测了正常脑组织及 MS 患者脱髓鞘病变部位脑组织 CD146 的表达情况。 图 1-11：脑组织石蜡切片免疫组化染色。A：正常脑组织的 CD146 主要表达于较大的血管 上，部分小血管中可以检测到较弱的结合。B：在脱髓鞘病灶处，CD146 阳性的部位集中于 血管丰富的地方,毛细血管、小血管包括小动脉和小静脉均可以被染上，尤其是小静脉的部 分。C, D：抗 CD31 抗体用于标记血管内皮细胞，与所有的血管内皮细胞均有结合。 在正常脑组织中，CD146 主要表达于较大的血管，部分小血管中可以检测到 较弱的结合（图 1-11A），此外，血管周围的平滑肌亦可以发现 CD146 的表达。 而在 MS 患者的脑脱髓鞘病灶处，CD146 阳性的部位集中于血管丰富的地方,毛 细血管、小血管包括小动脉和小静脉均可以被染上，尤其是小静脉的部分，相比 37 粘附分子 CD146 的抗体及其在疾病检测中的应用 正常脑组织表现为很强的结合（图 1-11B）。此外在血管周围的平滑肌上同样可 以检测到 CD146 的表达。作为血管内皮细胞的阳性对照，CD31 表达于正常及脱 髓鞘病变的脑组织中的所有血管内皮细胞，包括毛细血管和各种大小的动静脉 （图 1-11C, D）。 在中枢神经系统脱髓鞘病中，血管周围炎性细胞成套袖样浸润，髓鞘水肿变 性，髓鞘处于不断脱失再生过程。在此过程中，侵润的炎性细胞、血管内皮细胞 及构成髓鞘的胶质细胞表面分子均有可能脱落而进入脑脊液中。 免疫组化的结果 显示，与正常脑组织相比，在脱髓鞘病变发生的部位，CD146 在血管内皮细胞 的表达明显升高。由此，我们推测脑脊液中的可溶性 CD146 有可能是血管内皮 细胞在疾病的发生过程中由于炎性细胞因子等的刺激作用导致其从表面发生脱 落而进入脑脊液。为验证这种推测，我们设计了体外实验，检测多种血管内皮细 胞在不同炎性因子刺激前后培养上清中的 sCD146 的水平。 我们采用的血管内皮细胞包括人微血管静脉内皮细胞（HMEC）、人脐带静 脉内皮细胞（HUVEC）和人脐带静脉内皮细胞（ECV304） 。当细胞培养至 80% 汇片时，在培养液中分别加入不同的炎性因子 TNF- （10ng/ml ） 、 IL-1(10ng/ml)、IFN-(100ng/ml)、PMA(10ng/ml)，刺激 24-48h 后收集细胞培 养上清，利用双抗夹心法检测细胞培养上清中的 sCD146 含量。初步的实验结果 表明， 这三种血管内皮细胞在刺激前/后的培养上清中均没有检测到 sCD146 的存 在。分析其结果，可能有两个原因（1）培养上清中 sCD146 含量太少，用目前 的检测系统很难检测到， 可以考虑用放射标记示踪法检测；（2） 迄今为止， sCD146 的产生机制还不清楚，也许 sCD146 的产生并非是在炎性因子刺激下从膜结合形 式的 CD146 脱落而来。 38 张莹博士学位论文2008 研究内容 三、讨论三、讨论 细胞粘附分子 CD146 是一个新近发现的血管内皮细胞标志分子，参与细胞 间的粘附及血管新生过程。本研究首次通过一组识别不同表位的 CD146 抗体， 在分子、细胞和组织水平系统研究了它们的识别表位及组织结合谱，并借此阐明 CD146 介导细胞粘附及血管新生过程的结构学基础， 探讨 AA98 抑制血管内皮细 胞增殖和迁移功能的机制。 我们的结果表明，本研究中的 7 株 CD146 的抗体可以据其识别表位分为 3 组，AA1 和 AA2 识别 CD146 第 24-128 位氨基酸之间的肽段；AA3、AA4、AA5 和 AA7 识别的表位位于 CD146 第 335-381 位氨基酸之间；AA98 则特异识别一 个位于 CD146 第 313-560 区段内依赖于二硫键的构象表位。AA1、AA2 对分子 水平还原和非还原状态的 CD146 均可以结合，但 AA98 只能结合非还原的 CD146，但这 3 者均可以与活细胞膜表面及冰冻组织切片上的 CD146 分子结合， 这些结果提示我们 AA1、AA2 和 AA98 均可以识别天然构象的 CD146 蛋白，但 不同的是 AA1 和 AA2 结合的抗原表位是一个线性表位，而 AA98 则识别一个二 硫键依赖的构象表位。AA3、AA4、AA5 和 AA7 则与这 3 株抗体不同，尽管它 们可以识别分子水平还原或非还原的 CD146 蛋白，但与活细胞及冰冻切片上的 CD146 抗原不能结合，而石蜡切片的 CD146 则可以被这 4 株抗体识别。利用 ProtScale 软件对这一组抗体表位区段氨基酸的序列进行分析（336-380 位： QELLVNYVSDVRVSPAAPERQEGSSLTLTCEAESSQDLEFQWLRE)，我们可以 发现在该区段含有两个潜在的疏水区， 339 位-350 位氨基酸 （LVNYVSDVRVSP） 及 361 位-365 位（LTLTC）。结合实验结果我们推测 C2-2 组抗体识别的表位可 能是一个位于 CD146 第二个 IgC2 结构域的疏水内核。因此，C2-2 组抗体的表 位可能无法暴露于天然构想的 CD146 蛋白的表面， 导致这些抗体在流式细胞术、 细胞免疫荧光及免疫组化分析中的阴性结果。然而在一些变形的条件下，例如 SDS-PAGE 的上样缓冲液或碱性的 ELISA 包被液（pH9.6）的环境中，以及石蜡 包埋和热修复的过程，可以使它们的抗原表位暴露出来，而被抗体识别。综合这 些结果，提示我们不同的 CD146 抗原表位在不同情况下的暴露可能有所不同。 研究发现，CD146 的不同抗体与各种类型的血管内皮具有不同的结合活性。 在本研究中的 7 株抗体尽管具有不同的抗原识别表位， 但它们与各种血管内皮的 结合情况并没有差别，均可以特异结合多种肿瘤组织的血管，而与大部分的正常 组织血管没有反应。 这个结果与 CD146 的另外两个抗体 S-endo1 及 P1H12 不同， 它们对于各种不同类型的血管均可以结合79, 81，提示我们 S-endo1 及 P1H12 识别的可能是 CD146 的另一个区段。 CD146 的不同抗体在之前的研究中显示出了不同的生物功能，例如单抗 S-endo1 可以通过与 CD146 的相互作用引起血管内皮细胞内 FYN、FAK 等一系 列蛋白的磷酸化，引发胞内外钙离子的波动，进而影响局部的粘附集合、细胞骨 架重组等过程126, 127；P1H12 与 CD146 的相互作用能够引发血管内皮细胞的 FAK 磷酸化以及 NF-B（p50）的核转移，增强血管内皮细胞的通透性80，而 单抗 AA98 则可以抑制血管的新生过程， 在裸鼠膜型上显示出良好的抗肿瘤效果 83。CD146 的这些抗体在生物功能的差别可能正是由于其结合表位的不同导 39 粘附分子 CD146 的抗体及其在疾病检测中的应用 致。 因此在抗体表位鉴定的基础上， 我们进一步分析了识别不同表位抗体的功能。 研究表明，尽管识别 CD146 天然构象，但 AA1 对血管内皮细胞的增殖、粘附和 迁移没有影响；只有 AA98 具有抑制血管内皮细胞的增殖、粘附和迁移的活性。 这些结果提示我们， AA98 识别的抗原表位是 CD146 介导内皮细胞增殖和迁移的 关键结构，首次在表位水平揭示了 CD146 作用机制的结构学基础。对于 CD146 不同表位抗体的功能分析可以揭示 CD146 发挥生物功能的关键结构域，对针对 该分子的治疗性抗体的制备起到指导性的作用。 单克隆抗体的高度的特异性和亲和力使其在医学检验方面得到了广泛的应 用，许多检验试剂盒均由单抗制成。目前在 sCD146 检测中应用最多的是 2003 年Bardin等基于CD146的单抗S-endo1和COM7A4建立的双抗夹心试剂盒111。 但该试剂盒的灵敏度相对较低，只能检测浓度高于 10ng/ml 的样品，不适宜进行 局部体液 sCD146 的检测。在本部分研究中，我们利用了两个靶向 CD146 不同 表位的单克隆抗体 AA1 和 AA98，配合生物素亲和素放大系统建立了一套新的 sCD146 的双抗夹心检测体系。该体系的检出灵敏度为 1ng/ml，相对商业化的试 剂盒提高了一个数量级，可以很好的应用于血清或脑脊液等不同体液形式 sCD146 的检测。研究显示，sCD146 在慢性肾衰、血管炎等多种疾病中具有异常 的升高，对 sCD146 的检测具有潜在的临床诊断应用价值111，因此本研究中建 立的sCD146双抗夹心检测系统可以成为基础研究或临床应用中有效的检测或诊 断工具。 可溶性粘附分子如 sICAM-1、sL-selectin、sVCAM-1 等在中枢神经系统脱髓 鞘病患者的血清和脑脊液中经常可以检测到异常的升高39, 123, 124。本研究利 用我们自己建立的 sCD146 双抗夹心检测系统，检测了 MS 和 ADEM 患者血清 和脑脊液的 sCD146 水平。研究中首次在 MS 患者中发现了一种新的体液形式 sCD146-脑脊液 sCD146，Western blot 结果显示其大小在 90-100kD 间，与之前 Bardin 等在内皮细胞培养上清中的检测结果相符87。进一步的研究显示，MS 和ADEM组患者脑脊液sCD146的水平相对对照组明显升高， 但二者血清sCD146 的水平没有显著性差异。此外，相关性分析显示 MS 组患者脑脊液 sCD146 水平 与血清 sCD146 及临床检测指标 c MBP、s MBP 之间相关，c MBP、s MBP 是 MS 疾病中反映脱髓鞘或脑损害的特异性生化指标125， 这个结果提示我们脑脊 液 sCD146 的变化伴随着中枢性神经系统脱髓鞘病的疾病进程，可以在一定程度 上反映脑损害的情况。 在之前对血清 sCD146 的研究我们可以发现， 尽管疾病患者和健康志愿者血 清 sCD146 的水平有显著性差异，但二者之间并没有一个明显的界限，因而很难 用于区别健康人和患者的个体检测。 在本研究中， 我们发现， 不同于血清 sCD146， 脑脊液 sCD146 可以 0.134nM 作为判定检测样本正常与否的标准，据此标准，本 研究涉及的 MS 组 26 名患者中有 18 例患者可以被检出， 而 ADEM 组 11 名患者 中则有10例可以被检出， 其检出的灵敏度分别为69.23%和90.91%。 MS和ADEM 作为一种严重的累及中枢神经系统的炎性脱髓鞘病，疾病的确诊必须十分谨慎， 需要结合多方面的检查结果， 脑脊液的各项检测指标在此类疾病的诊断中是一个 十分重要的辅助指标。而本研究的结果显示，脑脊液 sCD146 可能是一个 MS 和 ADEM 一类中枢神经系统脱髓鞘病中的疾病标志物， 脑脊液 sCD146 水平的检测 有可能成为中枢神经系统脱髓鞘病的的诊断中新的辅助诊断指标。 40 张莹博士学位论文2008 研究内容 过去的研究显示， 在慢性肾衰等疾病血清 sCD146 水平可能是一个反映血管 内皮细胞连接情况的标志物。对脑组织免疫组化的结果发现，相比正常脑，脱髓 鞘病患者脑组织的血管内皮细胞的 CD146 表达水平明显升高， 与脑脊液 sCD146 的变化一致。之前的研究显示，CD146 可以介导血管内皮细胞间的粘附80，但 脱髓鞘病病灶部位血管内皮层的渗透性相比生理状态明显提高， 以利于炎性细胞 向病灶部位的侵润。因此，我们推测，血管内皮细胞上的 CD146 的变化可能类 似于 VE cadherin，在脱髓鞘疾病发生过程中，细胞表面的 CD146 发生了重新分 布， 不再表达于细胞间连接的位置， 从而一定程度上增加了血管内皮层的渗透性。 此外， 在 MS 等中枢性神经系统脱髓鞘病的病灶部位往往可以检测到高水平的各 种细胞因子和趋化因子的存在121，这种炎性的环境往往可以造成细胞表面粘 附分子的脱落。脑脊液中的 sCD146 正有可能是病灶部位内皮细胞表面高表达的 膜型 CD146 在蛋白酶的作用下脱落所致。但体外实验中，各种不同的血管内皮 细胞的培养上清中均未检测到 sCD146 的存在，各种刺激因素的加入亦没能对其 产生影响，关于 sCD146 的产生机制还需更多的试验证明。 41 粘附分子 CD146 的抗体及其在疾病检测中的应用 第二部分第二部分 外周血单核细胞外周血单核细胞 CD146 在炎症发生过程中的作用及机制在炎症发生过程中的作用及机制 包括 MS 等在内的许多自身免疫病实际上是一种失控的炎症。 尽管到目前为 止有关的致病机理及病原尚不清楚， 但病灶部位过度的炎症反应最终导致组织损 伤已是共识。炎症过程的一个重要特征就是血液中的单核细胞粘附于血管内皮， 随后渗出并迁移至炎症组织，在这一过程中，单核细胞与血管内皮细胞的粘附分 子扮演着重要角色。 人们利用现有的多种研究模型发现了许多参与炎症反应的分 子及信号途径，已提出几种可能的单核细胞-内皮细胞粘附机制，包括 L-selectin- 外周淋巴结 addressin、2 Integrin-ICAM-1、2 Integrin-VCAM-1 等途径29。但 仍有大量细节得不到解释， 表明还存在诸多未知的重要单核细胞受体和调节途径 有待鉴定。CD146 在过去的研究中发现可以在一些自身免疫病中激活的淋巴细 胞及中性粒细胞上表达96，介导淋巴细胞与内皮细胞的粘附过程99，但其在 单核细胞上的表达调控与功能尚未见报道。因此在研究慢性炎症疾病 sCD146 的 同时，我们同时分析了其单核细胞膜结合形式 CD146 的动态表达情况。在以系 统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）为代表的另一类慢性炎症 疾病患者中，我们发现粘附分子 CD146 可以特异地表达于单核细胞表面，而且 这种表达具有时空特异性，由 IFN-介导的 STAT1 信号通路可能参与其表达调 控过程。进一步的实验显示 CD146 的单克隆抗体可以抑制激活的单核细胞与血 管内皮细胞的粘附，提示我们 CD146 可能通过与其未知配体的相互作用参与炎 症部位单核细胞的募集。 42 张莹博士学位论文2008 研究内容 一、材料与方法一、材料与方法 （一） 、实验材料（一） 、实验材料 1. 细胞系、血样细胞系、血样 人单核细胞白血病 THP-1 购自 ATCC；人微静脉内皮细胞 HMEC 为清华大 学罗永章教授惠赠；健康人外周血购自北京市红十字血液中心；慢性炎症病人外 周血取自广州市人民医院。 2. 引物引物 引物名称 引物序列 CD146 正向引物 F-CD146 5 CCCGGAGCTGTTGGAGAC 3 CD146 反向引物 R-CD146 5 ATGCCTCAGATCGATGTATTTC 3 GAPDH 正向引物 F-GAPDH 5 CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT 3 GAPDH 反向引物 R-GAPDH 5 AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC 3 3. 主要试剂主要试剂 CD146 兔多抗 RACD146、单克隆抗体 AA98 由本实验室制备；PE 标记小鼠 抗人 CD14 单克隆抗体购自 BD；兔抗 actin 多克隆抗体购自 SantaCruz；鼠 IgG （mIgG） 、 FITC标记羊抗小鼠抗体购自Sigma； HRP标记抗兔抗体(GAR-IgG-HRP) 购自 Pierce； 反转录试剂盒、Trizol试剂购自Invitrogen；TNF-、 IL-4 、GM-CSF购自 R quiz S414. 23 G.S. 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