安全生产_碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠品质及安全性影响

碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对对猪猪肉肉肠肠品质及品质及安全性安全性的的 影响影响 Effects of sodium nitrite replaced partially by carboxyhemoglobin on qualities and security of pork sausage 作作 者者 姓姓 名名 檀 胜 江 学学 位位 类类 型型 学 历 硕 士 学学 科、专科、专 业业 食 品 科 学 研研 究究 方方 向向 食 品 化 学 导导 师师 及及 职职 称称 周存六 副教授 2013 年年 4 月月 I 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对对猪猪肉肠肉肠品质品质及安全性及安全性的影响的影响 摘摘 要要 肉制品中的色素研究一直是国内外的热门之一。传统的发色剂亚硝酸钠存 在安全问题，使用受到限制。目前开发的亚硝酸盐替代物均存在一些缺陷，而 在肉制品加工中尚无得到实际应用。本文研究碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠 对猪肉肠的理化性质、感官评价和微生物菌落数的影响，并对其安全性开展评 价和发色机理进行研究。结果如下： (1)与空白组相比（A 组） ，添加 0.2%碳氧血红蛋白和 0.005%亚硝酸钠的猪 肉肠（G 组）有显著低的 L*、b*、TBA、TVB-N 值和菌落总数（P0.05），与阳性对照组均有显著性差异 （P0.05），与阳性对照组相比均有显著性差异（P0.05），与阳性对照组相比均有显著性差异（P0.05）。与对照组相比，食用添加 10%碳氧血红蛋白和 0.005%亚硝酸钠的猪肉肠 30 天的大鼠大体解剖和组织病理切片没有异常改变。 上述结果表明碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠的猪肉肠初步结果是安全 的，可以作为一种潜在色素用于肉制品生产。 (3) 对添加 0.2%碳氧血红蛋白和 0.05%亚硝酸钠的猪肉肠的色素成分分析 表明， 呈色物质可能是含有碳氧血红蛋白的热变性产物及其与亚硝酸钠反应的产物。 II 关键词关键词：碳氧血红蛋白；急性毒性试验；Ames 试验；骨髓嗜多染红细胞微核 试验；精子畸形试验；30 天喂养试验 III Effects of sodium nitrite replaced partially by carboxyhemoglobin on qualities and security of pork sausage ABSTRACT Pigment in meat products has been one of the important topics. Usually, sodium nitrite was restricted in the manufacture because of its security. Nitrites substitute has not practically been used in meat processing duing to its shortcomings. This paper studied on the effects of carboxyhemoglobin partially replaced by sodium nitrite on the physical and chemical properties of pork sausage, sensory qualities and microbial properties. Also, it evaluated the safety carboxyhemoglobin-treated pork sausage. The results were shown as the follows: (1) Compared with control(sample A), L*, b*, TBA, TVB-N and the aerobic plate counts were significantly decreased (P0.05), compared with positive control, while there had a significant difference (P0.05), compared with positive control, while there IV had a significant difference (P0.05), compared with positive control, while there had a significant difference (P0.05), on the weight, food utilization, blood indicators, blood biochemical parameters, major organ weight and dirty/body. Compared with control, the rats which fed with the pork sausage that added 10% carboxyhemoglobin and 0.005% sodium nitrite, and there had no abnormal changes in gross anatomy and histopathology,. The above results showed that preliminary result of partial of sodium nitrite in carboxyhemoglobin pork sausage was safe, and could be used as a potential pigment for meat production. (3) The analysis of pork sausage pigment composition which added 0.2% carboxyhemoglobin and 0.05% sodium nitrite showed that the generation substance of color may be contains the thermal denaturation product carboxyhemoglobin product of its reaction with sodium nitrite. Key words: Carboxyhemoglobin; Acute toxicity test; Ames test; Bone marrows many dye red blood cell micro nuclear test; Sperm malformation test; 30-days feeding test V 致致 谢谢 本论文的完成离不开导师周存六的细心指导，从研究方向的确定、论文的 选题、实验方案的设计、试验的实施以及论文的定稿，都得到了周老师的细致 和耐心的指导。在此，衷心感谢周存六老师，感谢他在实验及其他各方面所给 予我的关心和照顾。周老师认真严谨的科研态度深深地激励着我，使我受益匪 浅。 在整个实验研究过程中也得到了生物与食品工程学院其他老师无私的帮 助，特别感谢陈从贵老师、王武老师、李军红老师、汪惠丽老师、叶应旺老师、 胡建鹏老师等，感谢他们在试验过程中给予我的帮助和支持，使我的实验能够 顺利完成，在此向他们表示诚挚的感谢！ 同时，实验的完成也离不开周围许多同学们对我试验的帮助。真挚地感谢 李俊、徐玉红、张淑芬、吴巧、章立新、叶慧琼、董琪、夏新武、吴昕以及 535、 525 及 527 实验室其他师弟、师妹们在实验过程中给予我的大力支持，使我更 好的完成试验内容。 还要感谢我的父母，感谢他们在我读研究生期间给予我的支持和鼓励，使 我能克服种种困难，顺利完成学业。 作者：檀胜江 2013 年 4 月 VI 目目 录录 第一章第一章 前前 言言 . 1 1.1 畜禽血液的开发利用 . 1 1.2 腌肉色素的应用研究 . 1 1.3 碳氧血红蛋白腌肉色素的研究 . 3 1.4 碳氧血红蛋白肉制品安全性研究 3 1.5 问题的提出和本课题的研究内容 3 1.5.1 问题的提出 . 3 1.5.2 本课题的主要内容 . 4 第二章第二章 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠品质特性的影响碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠品质特性的影响 5 2.1 实验材料 . 5 2.2 仪器与设备 . 5 2.3 主要试剂 . 6 2.4 试验设计及检测方法 6 2.4.1 试验原料肉的预处理. 6 2.4.2 原料猪瘦肉的基本成分检测 6 2.4.3 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠试验组设计 . 7 2.4.4 猪肉肠的配方和制备方法 7 2.4.5 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠评价指标的设定及其检测 方法 7 2.4.6 试验结果的统计与分析 .10 2.5 试验结果 . 10 2.5.1 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠色泽的影响 .10 2.5.2 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠 TBA 值的影响 .12 2.5.3 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠 TVB-N 值的影响 .12 2.5.4 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠 pH 值的影响 13 2.5.5 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠亚硝酸盐残留量的影响 14 2.5.6 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠菌落数增长的影响 .15 2.5.7 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠感官品质的影响 .15 2.6 本章小结 . 17 第三章第三章 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对对猪肉肠猪肉肠安全性安全性的影响的影响 18 3.1 实验材料 . 18 3.2 仪器与设备 . 18 3.3 主要试剂 . 18 VII 3.4 试验方法 . 19 3.4.1 小鼠急性毒性试验 20 3.4.2 细菌回复突变(Ames)试验 .20 3.4.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 .20 3.4.4 小鼠精子畸形试验 21 3.4.5 大鼠 30 天喂养试验 21 3.4.6 试验结果的统计与分析 .22 3.5 试验结果与分析 22 3.5.1 小鼠急性毒性试验 22 3.5.2 细菌回复突变(Ames)试验 .22 3.5.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 .24 3.5.4 小鼠精子畸形试验 25 3.5.5 大鼠 30 天喂养试验 26 3.6 本章小结 . 30 第四章第四章 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠的猪肉肠发色机理探究碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠的猪肉肠发色机理探究 34 4.1 实验材料 . 34 4.2 仪器与设备 . 34 4.3 主要试剂 . 34 4.4 试验设计与方法 . 35 4.5 试验结果与讨论 . 35 4.6 本章小结 . 36 第五章第五章 结论与展望结论与展望 . 37 5.1 结论 . 37 5.2 展望 . 37 参考文献参考文献 . 39 攻读硕士学位期间发表的论文攻读硕士学位期间发表的论文 . 44 VIII 插图清单插图清单 图 2- 1 贮藏期内碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠 L*值的影响 10 图 2- 2 贮藏期内碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠 a*值的影响 . 11 图 2- 3 贮藏期内碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠 b*值的影响 . 11 图 2- 4 贮藏期内碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠 TBA 值的影响 12 图 2- 5 贮藏期内碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠 TVB-N 值的影响 13 图 2- 6 贮藏期内碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠 pH 值的影响 .14 图 2- 7 贮藏期内碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠亚硝酸盐残留量的影响 14 图 3- 1 小鼠骨髓细胞微核（ 400 油镜）.25 图 3- 2 小鼠精子畸形（ 400 油镜） .26 图 3- 3 大鼠主要脏器病理组织切片 .33 图 4- 1 紫外-可见光谱图.36 IX 表格清单表格清单 表 2- 1 主要仪器设备 . 5 表 2- 2 主要试剂 . 6 表 2- 3 原料肉的基本组成 7 表 2- 4 不同处理组中碳氧血红蛋白与亚硝酸钠添加量 . 7 表 2- 5 猪肉肠的配方 . 7 表 2- 6 猪肉肠的感官评价标准 8 表 2- 7 菌落总数检测结果 .15 表 2- 8 贮藏期内碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠感官评价的影响 16 表3- 1主要仪器设备18 表 3- 2 主要试剂 19 表 3- 3 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠 Ames 试验结果（第一次）.22 表 3- 4 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠 Ames 试验结果（第二次）.23 表 3- 5 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠对小鼠骨髓微核发生率和 PCE/NCE 比 值的影响 24 表 3- 6 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠对小鼠精子畸形发生率的影响 25 表 3- 7 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠对大鼠体重的影响 .27 表 3- 8 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠对大鼠食物利用率的影响 27 表 3- 9 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠对大鼠血常规的影响 .28 表 3- 10 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠对大鼠血液生化指标的影响 28 表 3- 11 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠对大鼠实验末禁食后体重、脏器重量 和脏器/体重比值的影响 29 表4- 1主要仪器设备34 表 4- 2 主要试剂 34 1 第一章第一章 前前 言言 色泽是肉制品的重要感官品质特性之一，是消费者用来衡量是否购买的重 要依据。良好的色泽可以刺激人们的食欲1。传统的发色剂主要是亚硝酸盐， 具有发色、防腐和呈味作用2-3。但大量使用亚硝酸盐，不仅会引起急性食物中 毒，还会增加患癌症风险。亚硝酸盐可以与食物或胃中的仲胺类物质作用转化 为亚硝胺，亚硝胺具有强烈的致癌作用4，主要引起食管癌、胃癌、肝癌和大 肠癌等5。因此，亚硝酸盐在食品加工中的使用受到很大限制，减少亚硝酸盐 的使用和寻找亚硝酸盐的替代品一直是肉制品加工领域的重要课题之一6-7。 1.1 畜禽血液的畜禽血液的开发利用开发利用 2011年我国年出栏生猪66170万头，以每头猪约产2.5kg猪血计，年产猪血 大约有165.4万吨，资源非常丰富8。畜禽血液含有非常丰富的营养。营养性首 先体现在蛋白质上，全血蛋白质高达17%21%9，经过干燥的血粉，蛋白质含 量高于80%，是全乳粉的三倍，且氨基酸种类齐全，含有人体必需的8种氨基酸 和2种半必须氨基酸10，总量高于人乳和全蛋；同时畜禽血液中还含有多种矿 物质、激素和酶类及其他一些生物活性物质。畜禽血液也是超氧化物歧化酶 （SOD）及多肽的来源11，猪源SOD氨基酸与人体相同率达82.4%，具有能够 清除人体内过多氧自由基的特性，在防辐射、防衰老、抗肿瘤等方面表现出惊 人的效果12。此外，血液中含有的免疫球蛋白（immunoglobulin Ig）13-14是具 有抗体活性或与抗体相似的球蛋白，是动物重要的免疫活性物质，在动物营养 代谢和生理调节方面有重要作用，能够帮助婴儿防病抗病能力、促进生长和增 强老年人的抵抗力。免疫球蛋白可以分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类，在 猪血中，免疫球蛋白达到2%左右，是一个巨大的资源。血红素在医学、食品、 化妆品等领域得到广泛的应用15。血红素由卟啉环和中间一个二价铁构成，每 100g血液中铁含量高达40mg16，是良好的补铁剂，可以治疗缺铁性疾病17； 血红素的衍生物血卟啉，在人体肿瘤部位停留更长时间，并对紫外激光反应增 强，因此在红色激光作用下、血卟啉产生自由基可以杀死肿瘤细胞18；血红素 还可以作为食品蛋白添加剂19、血豆腐、血粉等。鉴于畜禽血液的独特作用， 国外很早就开始进行了研究，一些国家主要制作成饲料20，更多的是进行深加 工研究，如猪血经过酶解提取的活性肽，可以抑制ACE活性、降血压，对心血 管疾病和肥胖症有一定疗效21-24。目前，我国畜禽血液大部分因不能及时处理 利用，主要作废弃物倒掉，既造成浪费、又污染了环境。以畜禽血液制备腌肉 色素是畜禽血液综合利用的重要途径之一25-26。 1.2 腌肉色素的腌肉色素的应用研究应用研究 畜禽血液中血红蛋白（Hb）是运载氧的一种蛋白质，使血液呈红色。血红 2 蛋白是由四条珠蛋白链组成，两条链和两条链，每一条链有一个包含一个铁 原子的环状血红素，141个氨基酸组成的两条链的多肽链和146个氨基酸组成 的两条链形成四面体紧密结构，形成口袋的样子称为疏水口袋，将血红素包围 在里面。肌红蛋白是由一条肽链和一个血红素组成的单链蛋白，结构与血红蛋 白三级结构相同，肌红蛋白可以与一氧化氮形成亚硝基肌红蛋白，那么血红蛋 白也可以和一氧化氮或亚硝酸盐形成亚硝基血红蛋白（NOHb） ，经研究是可行 的27-30。还有研究认为变性后的珠蛋白肽链结构断开，使得血红素从疏水口袋 暴露出来，更加容易与一氧化氮或亚硝酸盐NO-结合生成亚硝基血红素31-33。 同样利用酶酶解血红蛋白后，在酸性条件下再与亚硝酸盐反应，稳定性有很大 提高，这是肽链断开血红素暴露出来更加容易与一氧化氮或亚硝酸盐结合34。 由于亚硝基血红蛋白见光易分解，加热易变性等不稳定性35，研究发现向反应 液中加入-环糊精、变性淀粉和麦芽糊精，经微胶囊包埋后，稳定性有一定提 高36-37，但为水不溶性，其应用受到限制38。在血红蛋白与亚硝酸盐反应液中 加入壳聚糖，经过糖基化反应，也可提高亚硝基血红蛋白的稳定性，但稳定性 仍然需要进一步提高39-40。 血红蛋白(Hb)与配体氧气、一氧化氮结合是协作的，一分子结合促进更多 （24）的氧气、一氧化氮与同一血红蛋白结合，肌红蛋白是单链，一分子肌 红蛋白只能和一分子氧气、一氧化氮结合，因此肌红蛋白对氧气、一氧化氮的 结合力更强与血红蛋白，使得血红蛋白失去亚硝基（NO-） ，生成亚硝基肌红蛋 白（NOMb）41。因此亚硝基血红蛋白发色剂替代亚硝酸盐添加到肉制品中， 游离的NO-被肉中肌红蛋白结合， 亚硝基血红蛋白中的NO-被没有结合完的肌红 蛋白再夺去一部分，生成亚硝基肌红蛋白，使得肉制品中亚硝酸盐残留量极大 的减少，使得肉制品有一定色泽，风味和防腐抗菌性质，同时使肉制品中还有 一部分血红蛋白，血红蛋白中的铁极易被人体吸收，对缺铁性贫血及引起的疾 病有一定治疗作用17,42，同时还能提供人体的需要的其他物质，如蛋白质、铜、 维生素C、维生素B12、矿物质等。亚硝基血红蛋白还具有溶解性、起泡性和乳 化性，提高使肉制品的保水性、弹性、切片性、产品率43-44。 天然畜禽血液由于稳定性差，很容易变质和受污染。不能直接应用到肉制 品中。利用畜禽血液的血红蛋白资源，合成亚硝基血红蛋白(HbNO)腌肉色素应 用到肉制品中45-46，可以取代硝酸盐或亚硝酸盐的使用，实现肉制品的无硝或 低硝28,35,47-48，提供更加营养安全的肉制品，而且充分利用了畜禽血液资源， 避免了浪费和减少了污染。由上可以得出亚硝基血红蛋白腌肉色素存在热稳定 性差见光易分解，色泽变暗，反应产物着色稳定性不够等缺点 43,49，使得研究 者急需寻找更加稳定安全的色素。 3 1.3 碳氧血红蛋白腌肉色素的研究碳氧血红蛋白腌肉色素的研究 血液中血红蛋白不但能与氧气、一氧化氮等配体结合，还能与一氧化碳结 合形成碳氧血红蛋白50-52。一氧化碳开始是作为气调保鲜技术应用到肉制品当 中，炉火中的烟就是因为含有一氧化碳才会使肉制品保持良好的色泽，在气调 包装中加入少量的一氧化碳可以使肉拥有鲜亮的颜色，色泽比较稳定53-56。后 来研究更多的是一氧化碳与血红蛋白反应生成碳氧血红蛋白。目前对于碳氧血 红蛋白的研究，更多的是作为单一的色素添加剂应用到肉制品当中。新鲜猪血 向其中通入一氧化碳气体，贮藏四天后猪血红度值（a*） ，黄度值（b*）显著增 加，亮度值（L*）值无显著变化，未通入一氧化碳的血液四天后色泽变暗，这 说明猪血中血红蛋白与一氧化碳反应生成了碳氧血红蛋白，且碳氧血红蛋白比 血红蛋白颜色更好，更稳定57。研究发现，经一氧化碳处理的猪血在高氧和低 氧的袋子里贮藏12周与未经一氧化碳处理的猪血比较，在低氧的袋子里时候碳 氧血红蛋白与对照组有显著性差异，高氧没有差异性变化，说明碳氧血红蛋白 遇氧气容易氧化变质分解58。还有研究认为碳氧血红蛋白添加到猪肉肠，鸭肉 肠中，可以很好的提高a*值，但是L*值出现下降，过多添加出现颜色发暗，且 贮藏时间不长等缺点59。碳氧血红蛋白单一添加使用，不能完全解决现代肉制 品的需求，碳氧血红蛋白的稳定性容易受到容器、温度、容器内空气、碳氧血 红蛋白初始饱和度等影响60，随时间延长会出现缓慢降解。碳氧血红蛋白经冷 冻干燥制成血粉，更加有利于储存，方便使用，稳定性极大提高。碳氧血红蛋 白单一应用到肉制品中，还有很多不足和需要改进的地方，需要进一步研究改 进。 1.4 碳氧碳氧血红蛋白血红蛋白肉制品肉制品安全性研究安全性研究 碳氧血红蛋白有优于血红素，亚硝基血红蛋白，血红蛋白等色素更加方便、 稳定、安全等特点，具有巨大的应用前景和研究价值。随着研究的深入，碳氧 血红蛋白研究越来越多，更多在性质应用上的研究，但是对于安全性评价目前 研究很少， 国外研究添加2%碳氧血红蛋白的猪肉肠的亚慢性和慢性毒理安全性 研究发现是安全的61。但是对于碳氧血红蛋白和亚硝酸钠的混合添加的猪肉肠 的安全性评价，还有待进一步研究，这对深入的研究具有重要意义。 1.5 问题的提出和本课题的研究内容问题的提出和本课题的研究内容 1.5.1 问题的提出 随着生活水平的不断提高, 人们对食品的安全越来越重视，无硝及低硝腌 制剂的研制与应用已经成为社会和历史发展的必然要求。国内外肉类科技工作 者利用血红蛋白合成腌肉色素改善肉制品颜色的同时，也有效地利用了畜禽血 液，提高肉制品的营养价值。本文拟在前人研究基础上，研究利用碳氧血红蛋 4 白和亚硝酸钠的不同配比对猪肉肠的品质特性与安全性的影响，为其生产和应 用提供理论依据和技术支持。 1.5.2 本课题的主要内容 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠在猪肉肠中应用研究： （1） 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠添加到猪肉肠中，对猪肉肠品质特性的 影响； （2） 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠的猪肉肠的安全性评价研究； （3） 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠的猪肉肠的呈色机理研究。 5 第二章第二章 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对对猪猪肉肠品质肉肠品质特性特性的的影影 响响 血红蛋白和肌红蛋白类似， 也能和一氧化碳结合生成稳定的碳氧血红蛋白。 Fontes58等报道，在贮藏过程中，用一氧化碳处理的猪血颜色的稳定性有很大 增强。一氧化碳处理的猪血产生鲜红的颜色，从而在香肠的中具有巨大的使用 潜力。Zhou59等报道，与没有添加碳氧血红蛋白的猪肉肠相比，添加碳氧血红 蛋白的猪肉肠具有较高的 a*值，但较低的 L*值。单独添加碳氧血红蛋白处理 的猪肉肠颜色不均匀和外侧部分相对比较暗。有必要研究碳氧血红蛋白和亚硝 酸钠在肉制品中组合效果，以便进一步评价碳氧血红蛋白在肉制品生产应用的 可能性。然而，目前还没有报道碳氧血红蛋白和亚硝酸钠组合对肉制品品质特 性的影响。在本章我们研究了在贮藏期内碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪 肉肠色泽、TBA 值、TVB-N 值、pH 值、亚硝酸盐残留量、微生物和感官品质 的影响。 2.1 实验材料实验材料 实验原料：猪后腿肉，购自家乐福超市；猪血，购于合肥市宁国路菜市场。 辅料：加碘精制盐（二级），安徽省盐业总公司生产；太太乐味精（谷氨 酸钠99%），上海太太乐食品有限公司生产；白糖（合肥市售食品级）；磷酸 盐（合肥市售食品级）；白胡椒粉，晋江市阿一波食品工贸有限公司生产；生 姜粉，上海豪美佳调味食品有限公司生产；聚乙烯食品袋（合肥市售）；保鲜 膜（合肥市售）；蒸馏水（实验室自制）；肠衣（合肥市售）；漏斗（合肥市 售）等。 2.2 仪器与设备仪器与设备 实验使用的主要仪器设备见表2-1。 表 2- 1 主要仪器设备 Table 2-1 The main instruments 仪器设备名称 型号 厂家 紫外分光光度计 Spectrumlab 52 上海棱光技术有限公司 冷冻型离心机 CT14RD 杭州纽蓝科技有限公司 真空冷冻干燥机 Alpha1-4LSC 德国 CHRIST 公司 pH 计 PHS-2H 上海雷磁仪器厂 数显恒温水浴锅 HH-2 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 绞肉机（绞肉盘孔径 5 mm） QJH-C 顺德区陈村镇上源电器厨具五金厂 循环水式真空泵 SHZ-D() 巩义市予华仪器有限责任公司 高剪切乳化机 FLUKO 上海弗鲁克流体机械制造有限公司 6 高速分散均质机 FJ-200 上海标本模型厂 全自动测色色差计 WB2000IXA 北京康光仪器有限公司 凯氏硝化仪、定氮仪 K9840 海能（济南）仪器有限公司生产 2.3 主要试剂主要试剂 实验使用的主要试剂见表2-2。 表 2- 2 主要试剂 Table 2-2 The main reagent 试剂名称 纯度 厂家 三氯乙酸 AR 上海中试化工总公司 十水合四硼酸钠 AR 西陇化工股份有限公司 硫代巴比妥酸 AR 上海中试化工总公司 氧化镁 AR 天津博迪化工股份有限公司 乙酸锌 AR 汕头市西陇化工厂有限公司 对氨基苯磺酸 AR 北京博瑞盛嘉化工技术有限公司 盐酸萘乙二胺 AR 上海灵锦精细化工有限公司 亚铁氰化钾 AR 天津市博迪化工有限公司 甲基红 AR 天津市光复精细化工研究所 溴甲酚绿 AR 天津市光复精细化工研究所 亚甲基蓝 AR 无锡市展望化工试剂有限公司 大肠杆菌显色培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司 金黄色葡萄球菌显色培养基 北京奥博星生物技术有限责任公司 2.4 试验试验设计及检测设计及检测方法方法 2.4.1 试验原料肉的预处理 猪后腿肉购自家乐福超市，经去皮，除掉结缔组织，瘦肉和脂肪分开绞碎， 瘦肉500g/袋分装，-18的冰箱储藏备用。 2.4.2 原料猪瘦肉的基本成分检测 从冰箱中随机取出一部分预处理完毕的猪肉，在4冰箱解冻24h后，进行 基本成分分析。 2.4.2.1 水分含量的测定 参照国标GB/T 9695.15-2008的方法测定原料猪肉的水分。 取3组样进行重复 测定，取平均值。 2.4.2.2 灰分的测定 参照国标GB/T 9695.18-2008的方法测定原料肉的灰分。 取3组样进行重复测 定，取平均值。 7 2.4.2.3 蛋白质含量的测定 采用凯氏定氮法，根据国标GB/T 9695.11-2008的方法测定原料猪肉的蛋白 质含量。取3组样进行重复测定，取平均值。 2.4.2.4 脂肪含量的测定 采用索式提取法，根据GB/T 9695.7-2008的方法测定猪肉中脂肪的含量。取 3组样进行重复测定，取平均值。 2.4.2.5 基本成分检测结果 由以上实验，猪瘦肉的基本成分检测结果如下表2-3 表 2- 3 原料肉的基本组成 Table 2-3 Proximately ingredients of raw pork meat 水分/% 灰分/% 蛋白质/% 脂肪/% 75.190.19 1.140.04 22.040.13 1.140.05 2.4.3 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠处理组设计 表 2- 4 不同处理组中碳氧血红蛋白与亚硝酸钠添加量 Table 2-4 The amounts of sodium nitrite and carboxyhemoglobin in various treatments 处理组 A B C D E F G H 亚硝酸钠/% 0 0.015 0 0 0.005 0.010 0.005 0.010 碳氧血红蛋白/% 0 0 0.1 0.2 0.1 0.1 0.2 0.2 2.4.4 猪肉肠的配方和制备方法 在试验中使用的猪肉肠灌制配方成分及含量百分比见表2-5。 表 2- 5 猪肉肠的配方 Table 2-5 Pork sausage formula 添加剂 食盐 味精 生姜粉 胡椒粉 水 磷酸盐 含量/% 2.5 0.05 0.2 0.2 5 0.15 注：瘦肉和脂肪的配比为95:5，食盐等配料和色素的添加量，均按瘦肉和脂肪总量为基准。 猪肉肠的制备：将先前准备好的猪瘦肉和脂肪进行解冻后、再分别称取预 先设计的量。按灌肠配方和实验的不同组分别加入各种添加剂，先用少量水将 色素润湿，斩拌均匀后在4下腌制24h，再次斩拌，灌肠，灌制完的猪肉肠， 在85蒸煮40 min，取出后立即用冰水浴冷却，在4冰箱保存，得到产品。 2.4.5 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠评价指标的设定及其检测方法 2.4.5.1 评价指标的设定 试验在王纪霞62研究的基础上，考察碳氧血红蛋白和亚硝酸钠不同添加量 应用到猪肉肠中，在贮藏期内的色度值、亚硝酸盐残留量、TBA、T-VBN、pH 值和菌落数检测及感官品质的变化，色度值为仪器所得，色度值是感官品质的 一种客观反应，在一定范围内，L*值、a*值越大越好，亚硝酸盐残留量、TBA、 T-VBN、pH值和菌落数，是样品在贮藏期期间的重要指标，产品能否被消费者 接受，感官品质才是主要的影响指标。 8 2.4.5.2 感官评价 感官评价标准参照GB/T 22210-2008，见表2-6。感官评价小组由生物与食 品工程学院535实验室的9位研究生组成。 表 2- 6 猪肉肠的感官评价标准 Table 2-6 Standards of sensory evaluation on pork sausages 等级 颜色（40%） 香味（20%） 口感（30%） 切片性能 （10%） 910 分 颜色呈灰红色，色 泽鲜亮、较好，较 易接受 香气浓郁，有浓 郁的猪肉香味 富有弹性， 味 道好 切片坚实， 平滑 78 分 颜色呈灰色或灰红 色，色泽一般 香气一般，基本 没有猪肉的香 味 弹性一般， 味 道较好 切片偶有裂隙， 外周有软化现 象 46 分 颜色呈灰色、色泽 暗淡、表面无光泽 香气较少，较难 闻到猪肉的香 味 弹性一般， 味 道一般 切片裂隙较多， 外周软化 03 分 颜色呈灰色或暗黑 色，表面无光泽， 不易接受 没有香气 弹性较差， 味 道较差 不成片 2.4.5.3 色度值 猪肉肠的色度值的测量参照Zhou等人59方法，指标有L*、a*和b*。在一定 范围内，L*表示亮度值，值越大说明颜色亮度值越好；a*表示红度值，值越大 说明颜色越红；b*表示黄度值，值越大说明颜色越黄。 测定方法：使用WB-2000 IXA全自动测色色差计，在L*a*b*模式下，将猪 肉肠切成3mm的薄片，放在探头下测定。每个样品取3根猪肉肠，每个猪肉肠切 3片，每片重复测定6次，取平均值。 2.4.5.4 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠脂肪氧化值（TBA）的测定 TBA值的检测是参照John等63的方法，并有所改进。称取5g样品，然后将 样品加入25mL混合溶液，混合溶液含0.375%TBA，15%三氯乙酸和0.25mol/L 的盐酸。将混合物在沸水浴中加热10min来提高红色，在流动自来水下冷却， 然后离心（3268RCF，25min）。在532nm波长条件下测量清液的吸光度，空白 为没有加肉，但加所有试剂和进行所有步骤。TBA值是用每100g克肉中所含有 的丙二醛的毫克数来表示。 TBA No.（ppm）= sample A5322.77 每个组取3根猪肉肠，每根取5g，测量后取平均值。 9 2.4.5.5 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠挥发性盐基氮（TVB-N）的测定 挥发性盐基氮（TVB-N）是用半微量定氮法，按照GB/T 5009.44-2003的方 法测定，并且用每100g肉中所含氮的毫克数来表示。每个组取3根猪肉肠，每根 取10g，测量后取平均值。 测量方法：取约10.0g绞碎的肉糜，置于锥形瓶中，加100mL水，间隔性的 振摇，浸渍30min，过滤，滤液置冰箱备用。量取10mL吸收液，加入5滴-6滴混 合指示液，置于冷凝管下端，并使凯氏定氮仪的管子下端插入吸收液的液面下。 然后准确吸取5.0mL上述试样滤液于蒸馏器反应室内，加入5mL氧化镁混悬液 （10g/L），迅速盖塞，并加水以防漏气，通入蒸汽，进行蒸馏，蒸馏3min即停 止。将吸收液用标定好的盐酸标准溶液（0.010mol/L）滴定，终点至蓝紫色。 同时做试剂空白试验。试样中挥发性盐基氮的含量按下式进行计算： X=（V1-V2） C 14 m5/100 100 式中： X表示试样中挥发性盐基氮的含量，单位为毫克每百克（mg/l00g） ； V1表示测定用样液消耗盐酸标准溶液体积，单位为毫升（mL） ； V2表示试剂空白消耗盐酸标准溶液体积，单位为毫升（mL） ； C表示盐酸标准溶液的实际浓度，单位为摩尔每升（mol/L） ； 14表示与1.00 mL盐酸标准滴定溶液c （HCl） =1.000mol/L相当的氮的质量， 单位为毫克（mg） ； m表示试样质量，单位为克（g） 。 2.4.5.6 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠 pH 值的测定 pH的检测是参照Deng等64的方法，并有所改进，具体操作方法：将猪肉 肠切碎，称取10g肉糜，置于锥形瓶中，加入90mL蒸馏水，均质1min，用自动 pH计立即测定pH值。每个样品取3根猪肉肠，每根取10g切成肉糜，三次测量后 取平均值。 2.4.5.7 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠亚硝酸盐残留量的测定 亚硝酸盐残留量的测定参照国标 GB/T 5009.33-2010 亚硝酸盐采用盐酸萘 乙二胺法。 2.4.5.8 A 组和 G 组菌落总数、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌检测 菌落总数参照GB/T 4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落 总数测定。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检测是从试剂公司购买的大肠杆菌显 色培养基和金黄色葡萄球菌显色培养基。 大肠杆菌显色培养基：按照显色培养基的使用说明，称取本品 3.8g 加入 100mL 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，灭菌，冷却至 50左右，迅速倾注无菌 平皿备用。大肠杆菌显蓝绿色，大肠菌群显无色，其它菌显黄色或无色。 金黄色葡萄球菌显色培养基：按照显色培养基的使用说明，称取本品 3.8 10 克加入 100mL 蒸馏水中，加热煮沸充分溶解，灭菌，冷却至 50左右，迅速 倾注无菌平皿备用。金黄色葡萄球菌显绿色，其他葡萄球菌显粉红色，杂菌被 抑制或呈无色菌落。 2.4.6 试验结果的统计与分析 本试验对相同条件下的重复试验采用 Excel 2003 计算，结果以“均值标准 差”表示。图、表反映的结果分别采用 t-检验进行显著性分析, P0.05 有显著性 差异，P0.05 没有显著性差异。 2.5 试验结果试验结果 本部分主要考察碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠品质特性等影 响，实验设了空白对照、亚硝酸钠对照和碳氧血红蛋白对照，另外还有碳氧血 红蛋白和亚硝酸钠的不同配比等共 8 组进行试验， 具体添加量参照表 2-4 方案。 2.5.1 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠色泽的影响 2.5.1.1 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠 L*值的影响 图 2-1 表示在贮藏过程中各组样品颜色的变化。由图可知，随碳氧血红蛋白 添加量的增加导致 L*值显著的减少（P0.05） 。在碳氧血红蛋白添加量不变时，改变亚硝酸钠的添加量，没有显著影 响 L*值（P0.05） 。 图 2- 1 贮藏期内碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠 L*值的影响 Fig.2-1 The effect of sodium nitrite replaced partial by carboxyhemoglobin on L* value of pork sausages during storage 2.5.1.2 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠 a*值的影响 图 2-2 表示碳氧血红蛋白或亚硝酸钠的添加都会引起的 a*值的显着增加 55 57 59 61 63 65 67 69 71 18152229 天数(d) L* A B C D E F G H 11 （P0.05） 。 同样， 添加亚硝酸钠导致控件的初始 pH 值显着降低 （P0.05） ，表明添加亚硝酸 钠具有抑制微生物生长防止乳酸形成的作用。 碳氧血红蛋白或碳氧血红蛋白 和亚硝酸钠的组合处理的样品的 pH 值，在第 15 天到第 29 天没有显著减少 （P0.05） ，但对照组显著减少（P0.05） 。在亚硝酸钠添加量不 变，碳氧血红蛋白添加量不同的样品，高碳氧血红蛋白组有低的亚硝酸盐残留 量，但是无显著性差异（P0.05） ，表明碳氧血红蛋白和亚硝酸钠在加工过程中 可能发生了反应。综上所述，亚硝酸钠和碳氧血红蛋白的组合比单独使用亚硝 酸钠有显著降低亚硝酸盐残留量的效果。一些研究已经表明，亚硝酸盐残留量 对亚硝胺的形成有着关键作用27。因此，碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠可减 少亚硝酸盐的残留，从而提高了肉肠的安全性。 图 2- 7 贮藏期内碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠亚硝酸盐残留量的影响 Fig.2-7 The effect of sodium nitrite replaced partial by carboxyhemoglobin on nitrites residues of pork sausages during storage 0 10 20 30 40 50 60 70 18152229 天数 (d) NO2-(mg/kg) A B C D E F G H 5.7 5.8 5.9 6 6.1 6.2 18152229 天数 (d) pH A B C D E F G H 15 2.5.6 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠对猪肉肠菌落数增长的影响 微生物检测的两个样品（A 组：空白对照组样品与 G 组：添加 0.005的 亚硝酸钠和 0.2的碳氧血红蛋白组合处理的样品）进行分析，结果见表 2-7。 正如预期的那样，菌落数随贮藏时间的增加而增加。但是在贮藏期间 0.005 的亚硝酸钠和 0.2的碳氧血红蛋白组合处理样品的菌落数显著低于空白对照 组的菌落数（P0.05） ，但显著增加了颜色、口感和切片性能等得分（P0.05 没有显著差异。 3.5 试验结果试验结果与分析与分析 3.5.1 小鼠急性毒性试验 用添加 10%的碳氧血红蛋白和 0.005%的亚硝酸钠的猪肉肠，以 20g/kg bw 剂量灌胃给雌、雄昆明种小鼠灌胃后未见明显中毒症状，观察 14 天无死亡。观 察期末将受试动物处死进行解剖检查，肝、脾、肾、胃、肠、心、肺等主要脏 器，未见明显异常改变。碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠对昆明种雌、 雄小鼠的最大耐受剂量(MTD)大于 20g/kg bw。根据保健食品检验与评价技术 规范(2003 年版)中的急性毒性分级标准，属无毒级。 3.5.2 细菌回复突变(Ames)试验 细菌回复突变(Ames)试验结果见表 3-3 及表 3-4。由表 3-3 及表 3-4 可以发 现， 10%的碳氧血红蛋白和 0.005%的亚硝酸钠的猪肉肠对 TA97、 TA98、 TAl00、 TA102 四株试验菌株，无论添加 S-9 与否的条件下，各处理组回变菌落数均未 超过空白对照组回变菌落数的 2 倍，亦无剂量反应关系。结果表明添加 10% 碳氧血红蛋白与 0.005%亚硝酸钠的猪肉肠未见可观察的诱变性。 表 3- 3 碳氧血红蛋白部分替代亚硝酸钠猪肉肠 Ames 试验结果（第一次） Table 3-3 The effect of sodium nitrite replaced partial by carboxyhemoglobin on Ames test of pork sausages (the first) 组别 剂量(g/皿) TA97 TA98 +S9 -S9 +S9 -S9 处理组 5000 151.6710.60 134.339.29 33.672.52 32.675.86 1000 1526.56 124.6710.97 33.671.53 322.65 200 153.337.77 124.3310.97 34.332.08 362.65 40 152.339.61 149.3312.86 35.671.53 34.332.52 8 153.335.51 125.6715.37 332.65 35.672.52 空白对照组 145.3313.20 13715.13 32.672.52 362.65 溶剂对照组 148.678.33 127.3311.50 33.671.53 32.332.31 23 阳性对照组 855.6741.74* 56335.38* 1365144.25* 34521.63* 组别 剂量(g/ 皿) TA100 TA102 +S9 -S9 +S9 -S9 处理组 5000 156.3313.58 141.679.71 28011.14 28310 1000 14281.72 13912.49 27411.79 27012.77 200 145.3323.97 130.3315.53 278.3313.50 27915 40 125.335.13 130.3318.90 26716.70 265.6717.50 8 121.6714.64 136.3312.58 26614.80 265.3316.77 空白对照组 14919 137.337.57 259.679.61 258.336.66 溶剂对照组 14915.52 1346.56 25312.29 25113.22 阳性对照组 1664.67107.45* 3866.67268.58* 153894* 126479.22* 注:溶剂为二甲基亚砜（DMSO），阳性对照:TA