IL-2基因多态性与中国汉族人群特发性扩张型心肌.doc

精品论文大集合il-2基因多态性与中国汉族人群特发性扩张型心肌病的相关性研究1黄萍1，周斌2，张林2，刘星1，陈斌1，饶莉11 四川大学华西医院心内科，成都（610041）2 华西基础医学与法医学院，成都（610041）email: 摘要：目的 研究中国西南地区汉族特发性扩张型心肌病（idiopathic dilated cardiomyopathy，idcm）患者白细胞介素-2（interleukin-2，il-2）基因启动子区-384t/g、-475a/t、-631g/a多态性与idcm的相关性。方法 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性 技术分析中国西南地区无血缘关系的109例汉族idcm患者和210例正常对照者il-2基因启动 子区-384、-475、-631位点的单核苷酸多态性。结果 il-2基因启动子区-384位点tt+tg基因型频率和t等位基因频率在idcm患者中升高，与 正常对照组相比有统计学差异（分别为95.41% vs. 87.62%，p=0.042 和72.94% vs. 64.52%， p=0.039）；而il-2基因-631位点与-475位点基因型和等位基因频率在idcm组与正常对照组之 间无差异。结论 本研究首次表明il-2基因启动子区单核苷酸多态性与人类idcm间的相关性。 il-2基因启动子区-384位点t等位基因可能会增加发生idcm的危险性。 关键词：特发性扩张型心肌病；白细胞介素-2；单核苷酸多态性特发性扩张型心肌病（idiopathic dilated cardiomyopathy，idcm）是一组以心室腔扩大 伴收缩功能障碍为特征的原因不明性心肌疾病，常导致进行性心力衰竭及左室收缩功能下 降、传导系统异常、血栓栓塞及心源性猝死，预后极差1。目前认为，三个因素可能与 idcm 的发生有关，即遗传易感、病毒感染和自身免疫 2。研究表明，以 t 淋巴细胞活化为中心 的过度细胞免疫是 idcm 弥漫性心肌受损的关键环节3。而白细胞介素-2（interleukin-2，il-2） 是影响 t 细胞活化的关键因子4，il-2 系统及其引发的 t 细胞活化异常可能是 idcm 发生 发展的重要因素5 。近来发现，il-2 基因启动子区单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，snps）可引起基因转录水平的变化，直接影响 il-2 的表达，并与某些 t 细 胞介导的自身免疫相关性疾病的发生有关6-8。但目前国内外尚无 il-2 基因启动子区 snps 与 idcm 关系的报道。本研究旨在探讨中国西南地区汉族人群 il-2 基因启动子区-384t/g、-475a/t、-631g/a 多态性是否与 idcm 的发病有关联。1对象与方法1.1 对象病例组为 2002 年 12 月至 2006 年 6 月经成都市多家三甲医院诊断的 idcm 患者 109 例， 诊断依据1995 年中华心血管学会专题讨论会关于扩张型心肌病诊断标准；有持续性高 血压、冠心病、心脏瓣膜病等基础心脏病史，有长期大量饮酒史、肿瘤药物使用史，有糖尿 病、结节病、自身免疫疾病、骨骼肌病等系统性疾病病史者未入选。idcm 组平均年龄（5714）岁，男性 68 例、女性 41 例。正常对照组为 210 例体检健康人，平均年龄（5411） 岁，男性 132 例、女性 78 例。所有受试对象均为无血缘关系的汉族人，均测量心率及血压 并进行超声心动图检查了解房室大小及心功能情况。1本课题得到教育部高等学校博士学科点专项基金（20070610144）的资助。- 7 -1.2 方法（1） 基因组 dna 提取及聚合酶链反应取受试者静脉血 1.5 ml，edta-na2 抗凝，按酚-氯仿法提取基因组 dna ， -20 保 存备用。 pcr 扩增引物用引物设计软件 primer3(/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi)设计，由 invitrogen 公司合成。il-2基因启动 子区 -475a/t 、 -631g/a snp 的 检测采用 同一对引 物，引物 序列为 5-atagacattaagagacttaaac-3和 5-gtaactcagaaaattttctttg-3；-384t/g snp检 测 采 用 的 引 物 序 列 为5-attcacatgttcagtgtagttct-3 和5-gtgatagctctaattcatgc-3。pcr 反应总体系 25l，含 10 pmol 引物，200 pmol dntp，1.5 mmol/l mgcl2，75 mmol/l tris hcl (ph 9.0)，150 mmol/l kcl，2 mmol/l (nh4)so4，50ngdna 模板和 1.5 u taq dna 聚合酶。pcr 反应条件：94预变性 5 分钟，94变性 30 秒，62退火 45 秒，72延伸 55 秒，循环 36 次，72延伸 7 分钟结束反应。用 1%的琼脂糖 凝胶电泳，检测特异性 pcr 扩增产物。（2）pcr 扩增产物的酶切鉴定 -475a/t、-631g/a 和-384t/g snp 检测采用的限制性内 切酶分别为 trul i、rsa i 和 fspb i（jingmei biotech）。酶切反应总体系 10l，含 pcr 产物7.0l，ddh2o 1.0l，10buffer 1.0l，10u/l 内切酶 1.0l。酶切反应条件：fspb i、rsa i 酶为 37恒温水浴 2 小时；trul i 酶为 65恒温水浴 1.5 小时。取酶切产物 3l 与 2l loading buffer(溴酚蓝、二甲苯青凝胶上样缓冲液)混匀后加入 6%聚丙烯酰胺凝胶板，以 600v 电压 电泳 40 分钟，清洗后硝酸银染色，观察结果并记录拍照。（3） dna 序列测定根据酶切后电泳条带结果，选择有多态性存在的条带以及一正常对 照组标本进行扩增产物 dna 序列测定。测序前，首先采用 3s pcr product purification kit 3.0 对 pcr 产物进行纯化，纯化后的 pcr 产物送上海申能博采生物技术公司采用 abi-377 毛细 管电泳仪自动测序。1.3 统计学分析直接通过凝胶电泳结果判读个体基因型，用直接计数法计算病例组和对照组样本基因型 频率及等位基因频率，经过 hardy-weinberg 平衡检验确认样本的群体代表性。临床计量资 料中，正态分布数据用 xs 表示，非正态分布数据取其自然对数，正态化后进行分析。计 量资料两组间比较采用不配对 studentt 检验，计数资料组间比较采用 x2 检验，p0.05 为 差异有统计学意义。2. 结果2.1 idcm 组与正常对照组临床及超声心动图资料的比较由表 1 可见，idcm 组和正常对照组的心率、左室结构及左室功能多项指标之间均存在显 著性差异（p0.05）。2.2 il-2 基因384t/g 多态性分析用限制性内切酶 fspb i 消化 pcr 产物后，由于 22bp 的片段太短，电泳后不能观察到，gg 纯合子只显示 109bp 一条带，tg 杂合子只显示 131bp 和 109bp 两条带，tt 纯合子显示131bp 一条带（图 1）。对 3 种基因型进行 dna 序列测定（图 2），测序结果与酶切结果一 致。2.3 idcm 组与正常对照组 il-2 基因-384 位点基因型和等位基因频率的比较idcm 组和正常对照组的 il-2 基因-384t/g 多态性基因型分布符合 hardy-weinberg 遗传 平衡定律。由表 2 可见，与正常对照组相比，idcm 组的 tt+tg 基因型及 t 等位基因频率 增高，差异有统计学意义（p0.05）。2.4 idcm 组 il-2 基因-384t/g snp 不同基因型亚组临床及超声心动图参数的比 较idcm 组 il-2 基因-384t/g snp 三种基因型之间以及 tt+tg 与 gg 基因型之间各项临床 及超声心动图参数比较，差异均无统计学意义（p0.05）（表 3）。2.5 il-2 基因启动子区-475a/t 和-631g/a 多态性检测仅在-475 位点正常对照组中检测到 2 例 at 基因型，其余 317 例均为-475aa 型； -631位点 319 例全部为 gg 基因型。两位点的基因频率分布在 idcm 组与对照组之间无差异。3讨论越来越多的研究证实，遗传易感背景下，病毒感染后的自身免疫反应是导致 idcm 发 生的重要因素。现已发现多种免疫分子基因多态性与中国汉族人群 idcm 有关。如最近的 研究显示 idcm 患者细胞毒性 t 淋巴细胞相关抗原-4（ctla-4）表达异常，ctla-4 基因 启动子区-1772c/t、-1661a/g snps 和外显子+49a/g snp 与 idcm 遗传易感性相关 9-10。 此外， 人类白细胞抗原（hla）-dqa1*0501、hla-dqb1*0303 和 hla-a*03 等位基因被 认为与中国北方汉族 idcm 的遗传易感性相关，是 idcm 易感性的遗传标记；而 hla-dqa1*0201 及 hla-dqb1*0502,*0504 等位基因则是 idcm 的保护基因11-12。这些研 究表明，在中国汉族 idcm 患者中，至少有一个亚群存在着遗传因素相关的自身免疫功能 异常。il-2 是一种在机体细胞免疫中起核心作用的细胞因子，一方面，它诱导 t 细胞增殖和 分化；另一方面，它激活 treg 发挥其抑制 t 细胞的作用13。因此，血清 il-2 只有在一个相 对较窄的浓度范围内，才能使 t 细胞介导的自身免疫反应维持在正常状态；il-2 水平过高 或过低都可能导致 idcm 等自身免疫相关性疾病的发生14。早有研究发现，idcm 患者及 其无症状左室增大亲属血中的 il-2 水平异常增高15，而活化细胞膜上 il-2 受体的数量和密 度明显下降且其表达水平与左室舒张末压显著相关，表明 il-2 系统及其引发的 t 细胞活化 异常可能是 idcm 发生及血流动力学恶化的重要因素5。而 il-2 水平受到遗传背景的影响。 研究显示 il-2 基因启动子区 snps 可通过引起基因转录水平的变化而直接影响蛋白表达，并 与特定人群对某些 t 细胞介导的自身免疫相关性疾病，如多发性硬化、肾移植后急性排斥 反应、精神分裂症等的遗传易感性有关6-8 。既然 idcm 的发生与遗传易感、il-2 水平及 t 细胞活化异常有关，而 il-2 基因启动子 区 snps 可影响 il-2 表达并与某些 t 细胞介导的自身免疫性疾病相关，那么 il-2 基因启动 子区 snps 与 idcm 之间也可能存在相关性，但目前国内外尚无二者关系的报道。迄今为止， il-2 基因启动子区共发现 3 种 snp，分别位于-384、-475 和-631 位点。本实验通过检测 319 例中国西南地区汉族人 il-2 基因启动子区-384t/g、-475a/t 及-631g/a snps 的基因型频率 和等位基因频率发现，il-2 基因-384 位点 tt+tg 基因型频率和 t 等位基因频率在 idcm 患 者中升高，与正常对照组相比有统计学差异。这一研究结果表明在中国西南地区汉族人群中，il-2 基因-384t/g 多态性与 idcm 相关，t 等位基因可能是 idcm 的易感基因。-384t/g 多态性变异可能通过影响 il-2 基因转录活性，干扰蛋白的表达和功能，导致 t 细胞活化异常 而对 idcm 易感。而 il-2 基因启动子区-475 和-631 位点 snps 在中国西南地区汉族人群中 为低频率分布(低于 snps 数据库-475t 3%、-631a 1%的频率，与欧洲的研究结果相似16)， 二者的基因型和等位基因频率在 idcm 组与对照组之间无差异。-475a/t 及-631g/a 多态性 可能与 idcm 的易感性无关。本研究为全面探讨 idcm 的易感基因提供了新的实验数据，为深入认识免疫紊乱及遗 传背景参与 idcm 的发病机制提供了新的理论依据。但是，在 idcm 的发生过程中，遗传 结构及免疫功能的改变具有多样性和复杂性，snp 在不同人种不同地区间的分布也存在显 著差异。因此，只有多地区、大样本的研究，并且同时对参与 idcm 发病的多个基因、各 种可能因素进行全面研究，才能真正明确某一 snp 在 idcm 发病中扮演的角色，进而从根 本上揭示 idcm 的发病机制。参考文献1maron bj, towbin ja, thiene g, et al. contemporary definitions andclassification of the cardiomyopathies: an american heart association scientific statement from the council on clinical cardiology, heart failure and transplantation committee; quality of care and outcomes research and functional genomics and translational biology interdisciplinary working groups; and council on epidemiology and prevention. circulation, 2006, 113:1807-1816.2fu m. autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy: from patients to molecules and back to patients. int j cardiol, 2006, 112:1.3pankuweit s, portig i, maisch b. pathophysiology of cardiac inflammation: molecular mechanisms. herz,2002, 27:669-676.4gaffen sl, liu kd. overview of interleukin-2 function, production and clinical applications. cytokine,2004, 28:109-123.5parissis jt, adamopoulos s, karas sm, et al. an overview of inflammatory cytokine cascade in chronic heart failure. hellenic j cardiol, 2002, 43:18-28.6matesanz f, fedetz m, collado-romero m, et al. allelic expression and interleukin-2 polymorphisms in multiple sclerosis. j neuroimmunol, 2001, 119:101-105.7morgun a, shulzhenko n, rampim gf. interleukin-2 gene polymorphism is associated with renal but not cardiac transplant outcome. transplant proc, 2003, 35:1344-1345.8schwarz mj, kronig h, riedel m, et al. il-2 and il-4 polymorphisms as candidate genes in schizophrenia.eur arch psychiatry clin neurosci, 2006, 256: 72-76.9liu w, li wm, gao c, et al. the research on associating the single nucleotide polymorphism of ctla-4 gene promoter region with idiopathic dilated cardiomyopathy. chin j med genet, 2006, 23: 198-201. 10liu w, li wm, gao c, et al. cytotoxic t lymphocyte associated antigen-4 gene exon 1 a49g polymorphisms confer susceptibility to idiopathic dilated cardiomyopathy. j microbiol immunol, 2005, 3:131-135.11liu w, li wm, sun nl. hla-dqa1, -dqb1 polymorphism and genetic susceptibility to idiopathic dilated cardiomyopathy in hans of northern china. annals of human genetics, 2005, 69: 382388.12cao fl, sun zy, fang s, et al. hla-a* gene polymorphism in patientswith idiopathic dilated cardiomyopathy. chin j end, 2005, 24: 607-608.13de-la-rosa m, rutz s, dorninger h, et al. interleukin-2 is essential for cd4+cd25+ regulatory t cell function. eur j immunol, 2004, 34: 2480-2488.14nelson bh. il-2, regulatory t cells, and tolerance. j immunol, 2004, 172: 3983-3988.15marriot jb, goldman jh, keeling pj, et al. abnormal cytokine profiles in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy and their asymptomatic relatives. heart, 1996, 75: 287-290.16fedetz m, alcina a, fernandez o, et al. analysis of -631 and -475 interleukin-2 promoter singlenucleotide polymorphisms in multiple sclerosis. eur j immunogenet, 2002, 29: 389-390.the association of il-2 promoter polymorphisms with idiopathic dilated cardiomyopathy in chinese han populationhuang ping1, zhou bin2, zhang lin2, liu xing1, chen bin1, rao li11 (department of cardiology, west china hospital of sichuan university, chengdu（610041）2 (department of forensic biology, west china hospital of sichuan university, chengdu (610041)abstractobjectiveto investigate whether -384t/g, -475a/t, and -631g/a polymorphisms in theinterleukin-2(il-2) gene promoter region are associated with idiopathic dilated cardiomyopathy(idcm)in southwestern chinese han population. methodspolymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism techniques were used to analyze single nucleotide polymorphisms of the il-2 gene at positions -384, -475, and -631 in 109 idcm patients and 210 unrelated healthy subjects in han population of southwestern china. results compared to healthy controls, thefrequency of tt and tg genotypes (0.9541 in patients vs. 0.8762 in controls, p =0.042) and the t allele (0.7294 in patients vs. 0.6452 in controls, p =0.039) at position -384, were significantly increased in idcm patients, whereas no differences of genotype or allele frequencies were found between idcmpatient and healthy control groups at position -475 and -631. conclusions these data indicate theassociation of il-2 gene single nucleotide polymorphisms with human idcm. additionally, the t allele of the il-2 gene promoter at position -384 may increase the risk of developing idcm. keywords: idiopathic dilated cardiomyopathy; interleukin-2; single nucleotide polymorphisms附图表：m：分子量参考物；1、2、3、5、7、11、13：tt 基因型（131bp）；4、6、9、10、12：tg 基因型（131bp、109bp）；8：gg 基因型（109bp）。 图 1 il-2 基因启动子区-384t/g 多态性 pcr-rflp 结果纯合子 tt 型测序图纯合子 gg 型测序图杂合子 tg 型测序图图 2