海藻糖对酶热稳定性保护作用的研究.pdf

海藻糖对酶热稳定性保护作用的研究 李 群 袁勤生 李永丰 (华东理工大学生化研究所,上海200237) 摘 要 初步研究了海藻糖在保护酶蛋白热稳定性方面的作用。实验表明:海藻糖可以作为 一种天然保藏剂,有效地提高酶蛋白的热稳定性;本文还分别比较了葡萄糖、 蔗糖、 甘露醇和海藻 糖对酶蛋白的保护效果,结果发现海藻糖保护效果最佳,蔗糖次之,葡萄糖和甘露醇较差。 关键词 海藻糖;乙醇脱氢酶;超氧化物岐化酶(SOD ); 热稳定性 酶在医药、 化工、 食品及临床与化学分析 等领域获得了广泛的应用。但是由于酶不稳 定而使其应用开发受到限制。虽然引起酶蛋 白变性的因素很多,如物理因素、 化学因素以 及生物学因素等,但是温度却是造成酶失活 的最主要因素。 近年来,一种建立在海藻糖基 础上的天然保藏剂,为酶的热稳定性保护提 供了新的方法。海藻糖是由两个葡萄糖残基 通过半缩醛羟基结合而成的一个非还原性二 糖,在昆虫、 无脊椎动物、 酵母、 真菌的孢子和 子实体以及高等植物中都发现其存在,化学 性质很稳定1。本文采用海藻糖作为酶的稳 定介质,初步研究了它对乙醇脱氢酶和SOD 的保护作用,并比较了葡萄糖、 蔗糖、 甘露醇 和海藻糖在保护酶活方面的效果。 1 材料与方法 111 材料 海藻糖由上海生化试剂商店提供; SOD 由华东理工大学生化研究所提供;葡萄糖、 蔗 糖、 甘露醇均为分析纯试剂。 112 方法 11211 酵母中乙醇脱氢酶的制备2 150m l 01066mol?L的N a2HPO4溶液加 入到达50克酿酒酵母细胞中, 37水浴中搅 拌保温 2h 后,取出,室温下再搅拌抽提3h, 离心弃菌体,上清液立即置于55水浴中 15m in,冷却后离心,上清液置0冰箱中过 夜。 冰浴下按每100m l的抽提液中,加入 50m l的冷丙酮, 20m in后, 0离心,弃沉淀; 再在上清液中按每100m l加入55m l冷丙酮, 0维持20m in后离心,弃上清液,沉淀用冰 水溶解,置透析袋中透析3h, 3500r?m in下离 心20m in,弃沉淀。每100m l上清液中加入 36g硫酸铵, 0冰箱放置3h, 14000r? m in离 心20m in,弃上清液;沉淀用15m l水溶解,加 入 3g 硫酸铵,盐析 3h 后离心弃沉淀。 上清液 中即含有乙醇脱氢酶。 乙醇脱氢酶活力测定采用Dotzayer 法3。 11212 酵母蛋白的制备及测定 (4) 20克酵 母中加水30m l,在- 20下速冻2h,取出放 在20恒温水浴中保温30m in,为一次冻融; 重复三次。离心取出上清液,得到酵母蛋白。 利用紫外分光光度计分别测定酵母蛋白 溶液样品在260nm , 280nm处的吸光度值, 按下表计算蛋白含量: 蛋 白 质 浓 度(mg?m l) = 1155A280- 0177A260 82 药 物 生 物 技 术 PharmaceuticalBiotechnology 1997, 4(1): 2831 收稿日期 1996205220 11213 海藻糖对酶热稳定性的影响 分别 在25mmol?L、100mmol?L海藻糖溶液中,加 入等体积的乙醇脱氢酶溶液,在35、40、 45、50、55、60的水浴中加热8m in, 冰水冷却后,以相应不加热的酶活力作对照 (100% ),测定乙醇脱氢酶活力保留率。 在加入蛋白质溶液的乙醇脱氢酶溶液 中,分别等体积地加入015mol?L的海藻糖 溶液,不同温度下,水浴8m in,冰水冷却后, 以相应不加热的酶活力作对照(100% ),测定 酶活力保留率。 在50mmol?L、100mmol?L海藻糖的水 溶液中分别加入等体积的SOD (1560U ), 在 不同的温度下加热20m in后,冰水冷却,测 SOD活力,以不加热的SOD活力作对照 (100% ),计算SOD活力保留率, SOD 活性 测定采用改进的邻苯三酚自氧化法5。 11214 其它多羟基化合物对酶热稳定性的 影响 015mol?L葡萄糖、 蔗糖、 甘露醇分别 等体积地加入到乙醇脱氢酶中,不同温度下 处理8m in,以相应不加热酶活力作对照 (100% ),测定酶活力保留率。 11215 海藻糖对SOD反复冻融时的活力影 响 在50mmol?L、100mmol?L、500mmol?L 海 藻 糖 溶 液 中,分 别 等 体 积 加 入SOD (1835U), 0 冰箱中冷冻, 25水浴中融化, 为一次冻融;重复两次,测SOD活力;以不冻 融SOD活力作为对照(100% ),测定三次反 复冻融后的SOD活力保留率。 2 结果 211 海藻糖对乙醇脱氢酶活力的保护作用 酶活力保留率的高低与海藻糖的浓度密 切相关。从图中可见, 500mmol?L海藻糖的 效果最好, 25mmol?L海藻糖较差,但是它们 都比不加海藻糖的酶溶液活力要高,说明海 藻糖可以稳定乙醇脱氢酶。见图1。 212 蛋白质对乙醇脱氢酶稳定性的影响 酵母体内的代谢是一个很复杂的过程, 体内蛋白质之间的相互作用非常复杂,为了 了解体内海藻糖的作用,利用酵母抽提液,检 测乙醇脱氢酶活力保留率。酵母蛋白质的浓 度为9mg?m l。结果见表1。 Fig 11 Thermal stability of alcohol dehydrogenase as influenced by trehalose1 500mmol?L 100mmol?L 50mmol?L 25mmol?L 3Control Tab 11Protecive effects of alcohol dehydrogenase by the addition of yeast protein and trehalose Temperature () 015mmol?L trehalose+ protein Protein 3098129814 4090168612 441585157713 5071146214 5552173517 571523191112 601115315 6200 213 海藻糖对SOD热稳定性影响 SOD在不同浓度海藻中以不同温度处 理20m in,其残余酶活力如表2。从结果中可 看出,相对于空白SOD而言,海藻糖具有保 护SOD酶活力的作用,但是由于SOD本身 是一个含金属的酶,与其它一些酶相比,对温 度不太敏感,因此海藻糖对SOD的热稳定性 保护效果不那么明显。 92李群:海藻糖对酶热稳定性保护作用的研究 Tab 21Protective effects of SOD by trehalose(% ) Temperature () 100mmol?L trehalose 50mmol?L trehalose Control 60991599129911 70971896159512 75951493119017 80771774136719 85201318151614 90719514316 214 其它多元醇化合物对酶活力的保护作 用 测定了015mol?L葡萄糖、 蔗糖和甘露 醇对乙醇脱氢酶的保护作用效果,结果见图 3。 从实验结果看,蔗糖的保护效果最好,而 甘露醇较差。 Fig 21Thermal stability of alcohol dehydrogenase as influenced by surcose, glucose and mannitol1 0. 5mol?L surcose 0. 5mol?L mannitol 0. 5mol?L glucose Control 215 海藻糖对反复冻融SOD稳定性影响 酶的反复冻融可使酶活力下降。但在加 入海藻糖后,情况却有所不同。结果见图4。 一次冻融后, 500mol?L和100mol?L海藻糖 所保护的SOD活力几乎没有丧失;在经过三 次反复冻融后, 500mol?L海藻糖还能使 50%的酶活力保存,而同样情况下,不加海藻 糖的SOD活力仅剩36%。说明在反复冻融 时,海藻糖的加入可以起稳定作用。 Fig 31Stability of SOD as influenced by freeze2thaw2 ing1 500mmol?L 100mmol?L 50mmol?L Control 3 讨 论 311 酶的稳定性一直是困扰其大规模应用 的原因 为了保持液体酶的活力,国内外大多采 用在浓缩酶液中加入金属离子、 多元醇、 多糖 类化合物等方法6。海藻糖作为一种多元醇 化合物,既可通过氢键与酶蛋白表面分子相 联结,也能通过氢键有效地与外部水分子相 联结,使酶蛋白分子稳定。 312 酵母蛋白提取液的加入能提高酶的热 稳定性 这是因为从蛋白质表面相互作用的区域 中排除水,因而降低了自由能,增加了蛋白质 的热稳定性7。 313 不同糖类化合物在稳定酶活方面作用 各不相同 一般认为,二糖比其它糖类的保护效果 更加有效;虽然在二糖之间其效果也有不 同8,可以认为热处理时酶活力的保留不仅 依靠加入的糖的类型,而且其亚基的定位作 用也很重要9,但是对糖类化合物的具体保 护机理还不清楚。对于海藻糖稳定生物分子 03 药物生物技术 4卷 的机理目前主要有两种假说:一种称为 “水替 代” 假说(water replacement hypothesis) 10, 它认为海藻糖与其它多元醇化合物一样,可 以同生物分子形成氢键,替代维持空间结构 所必需的水分子。另一种称为 “玻璃态” 假说 (the glassy statetheory) 11, 它认为通过海藻 糖玻璃化转变的趋势,导致无定型连续相的 形成,在这种结构中分子运动和分子变性反 应非常微弱。 目前,这两种假说还不能完全解 释已发现的现象,有待于更进一步的研究。 参 考 方 献 1 吴东儒 1 糖类生物化学 1 高等教育出版社, 1987 2641 2 Racker,E, Crystalline alcohol dehydrogenase from bakers yeast1J1Biol1chem istry, 1950, 184 3131 3 B1 施特尔马赫 1 酶的测定方法 1 中国轻工业出 版社, 199214 4 张炳然,解芳 1 新编生物化学实验 1 华东理工大 学, 198951 5 谢卫华,袁勤生,姚菊芳 1 连苯三酚自氧化法测 定超氧化物歧化酶活性的改进 1 中国医药工业 杂志, 1988, 19(5), 2171 6 卓肇文 1 使酶蛋白增加稳定性的途径 1 生物科 学动态, 1988 (4), 221 7 Mozhaev VV , M artined karrel1Structure-sta2 bility relationships in proteins: new approaches to stabilizing, Enzyme1M icrob1Technol1; 1984, 6 (2), 501 8 Crowe LM , Crowe JH and Chapman D1Interac2 tionofcarbohydratesw ithdrydipal m i2 toylphosphatidylchdine (DPPC ), A rch1 Biochem1Biophys1; 1985, 2362881 9 Crowe JH, Crowe LM , Carpenter JF Stabilization on dry phospholipid bilayers and proteins by sug2 ars, Biochem1J1; 1987, 24211 10 O tting G1,L iepinsh E1andW uthrich K1Protein hydration in apueons solution1Science, 1991, 254 9741 11 Franks F,Hatley, RHM andM athias SF1M ate2 rials science and the production of shelf2stable bio2 logicals1Biopharm1, 1991, 4381 Study on Stabilization of Enzymes by Trehalose L i qun, Yuan qinsheng, L i yongfeng (East China university of science and technology shanghai200237) W e studied the trehaloses protective effects on the thermal stability of enzymes1The results showed that trehalose can serve as a naturl prote