酿造酱油过程中废弃液再利用的研究.pdf

吉林农业大学学报2 0 0 8 ， 3 0 ( 3 ) ： 3 6 4 3 6 7 J o u r n a l o f狱i n A g r i c u l t u r a l U n i v e i h t t p： x u e b no fl a e d u c r t E - m a i l ： fl n d x b r i p s i n a c o n 酿造酱油过程 中废弃液再 利用的研 究 孙元宾 ( 吉林工商学院生物工程 系，长春 1 3 0 0 6 2 ) 摘要： 研究回收利用在酿造酱油和大酱过程 中产生的副产品大豆蒸煮液作为培养基， 通过对其进行蛋 白酶处理并添加 2 0异 L的葡萄糖来培养耐盐性接合酵母。结果表明： 蛋白酶处理大豆蒸煮液的最佳时14为3 h ，添加蛋白酶剂处理的大豆蒸煮液中的氮溶解系数为9 5 8 ； 对大豆蒸煮液进行蛋 白酶处理并添加 2 0 g L 的葡萄糖配制的培养基， 酵母培养液 0 D 6 6 o 值达到 1 5 9 1 7 ， 培养酵母菌的效果明显优于 Y P G培养基。 关键词：大豆蒸煮液； 耐盐性接合酵母；培养基； 酿造酱油 中图分类号 ： I S 2 6 1 9 文献标识码 ： A 文章编号 ：1 0 0 0 - 5 6 8 4 ( 2 0 0 8 ) 0 3 0 3 6 4 - 0 4 Re s e a r c h O i l t h e Re u s e o f t h e W a s t e Re s i du e s d u r i n g t he S o y Br e wi n g S UN Y u a n b i n ( D e p a r t m e n t ofB i o l o g i c a l E n g i n e e r i n g， J i l i n B u s i n e s s a n d T e c h n o l o g y C o l l e g e ，C h a n g c h u n 1 3 0 0 6 2 ， C h i n a ) Ab s t r a c t ：T h e f o l l o w i n g a r t i c l e i l l u s t r a t e s a n e w me a s u r e c o n f e c t i n g s a l i n e t o l e r a n c e z y g o s a c c h a r o m y c e s r o u x i i u n d e r t h e r e c y c l i n g o f re m a i n i n g s o j a c o o k i n g l i q u o r a f t e r t h e b re win g s o y A c c o r d i n g t o th e I s u l t the b e s t d i s p o s a l t i m e f o r the s o j a c ook i n g l i quo r with p r o t e a s e i s 3 h o u r s a n d th e m e l t i n g m o d u l u s o f th e a z o t e i n th e s o j a c ook i n g l i quo r a d d e d the p r o t e a s e C an a m o u n t t o 9 5 8 and with 2 m o re z y g o s a c c h a r o m y c e s m i x e d with d e s t r o s e i n t h e s o j a c ook i n g l i quo r ，th e l i g h t a b s o r b i n g d e g r e e rea c h e s 1 5 9 1 7 ， C O B p a r i n g t o 1 3 0 3 9 ， t h e l i ght a b s o r b i n g d e g r e e o f the Y P G s u b s t r a t e A s i t i s me n t i o n e d a b o v e ， t h i s p r o d u c t c a n b e a p p l i e d t o t h e maf a c t u r i n g o f t h e s a u c e and t h e s o y s a u c e t o a b i g e x t e n t a s th e z y g o s acc h a r o m y c e s i s p rio r t o the YP G s u b s t r a t e d i s t i n c t l y K e y w o r d s ：s o j a c o o k i n g l i quo r ；Z y g o s a c c h a r o m y c e s r o u x i i ；c u l tu re m e d i u m；s a u c e b re win g 大豆蒸煮液和大豆浸渍液是在酿造酱油和大 酱过程中产生 的副产品。由于在大豆蒸煮液中仍 然含有不少大豆原有的营养成分 ， 其 中有机物含 量较高。因此不加处理地扔掉 ， 既浪费资源、 又污 染环境。大豆蒸煮液里含有丰富的蛋 白质 、 糖分 、 灰分等多种营养成分 ， 可以给微生物提供丰富的 碳源 、 氮源及生长因子 ， 因此是微生物生长的良好 培养基 l_ 1 培 。据报道 ， 目前大豆蒸煮液主要用来生 产香料和培养真菌 J 。本研究 的目的是 回收利用 大豆蒸煮液 ， 探讨用大豆蒸煮液作为培养基 ， 通过 蛋 白酶处理和添加葡萄糖 ， 来培养耐盐性接合酵 母( Z y g o s a c c h a r o m y c e s r o u x i i ) ， 并将其应用于酱油 基金项 目：吉林省教育厅项 目( 吉教科合 字 2 o 0 7 第 2 4 9 号 ) 作者简介：孙元宾 ， 男 ， 副教授 ， 研究方向 ： 粮 油食 品教学与研究 。 收稿 日期 ：2 0 0 7 - 0 9 1 6 修 回日期 ： 2 0 0 7 1 2 1 9 和大酱 的酿造工艺中。 1 材 料与方法 1 1 试验 材 料 大 豆 蒸 煮 液 使 用 整 豆 蒸 煮 ， 蒸 煮 条 件 为 1 8 Jc m 2 ， 保压 81 0 mi n 。大豆 蒸 煮液 含 氮 0 2 8 ，糖 2 o 9 。蛋 白酶为 P 3和 S型 ( 北京加 成助剂研究所 ) 。果胶 分解酶为 G和 S S型( 湖北 新生源生物工程公司) 。耐盐性接合酵母为酿造 酱油时常用的酵母 Z y g o s a c c h a r o m y c e s r o t a x i i Z R 5 1 0 株 。 维普资讯 孙元宾等：酿造酱油过程 中废弃液再利用的研究 3 6 5 1 2 大豆蒸煮液培养基的配制 1 2 1 蛋 白酶的处理蛋 白酶 的处理方法 ： 在 大豆蒸煮液 里添加 P 3 和 S型 2种酶剂 。每种酶 剂 的添加剂量选择 3个浓度 ， 见表 1 ( 表中剂量 2 与剂量 3的添加量分别为剂量 1的 5和 1 O倍) 。 蛋白酶 的处理 条件 ： 反应 前 的 p H值为 6 0 ( 提取大豆蒸煮液时的 p H值) ， 反应时问 3 5 h ， 反 应温度 4 5 ， 搅拌速度 3 0 0 r m i n 。 表 1 蛋 白酶处理中的酶剂添加量 Ta b le 1 Ad d in g a mo u n t o f t h e e n z y me d u r i n g t h e p r o t a in a s e p r o c e s s g L 1 2 2 补充碳源 为 了补充 酵母 生长所需 的碳 源 ， 在大豆蒸煮液中添加葡萄糖。添加葡萄糖时 设 5 ， 1 O ， 2 O L 3个处理浓度。 1 2 3 果胶分解酶的处理 选择 G型和 S S型 果胶分解 酶添加 到大 豆蒸煮 液 中， 添加 量选 择 0 1 g L和1 g L 2个浓度。 反应 条件 ： 反 应前 大 豆 蒸 煮 液 的 p H值 为 6 0 ， 反 应 时 间 1 h ， 反 应 温 度 4 5 C， 搅 拌 速 度 3 0 0 r mi n。 1 3 酵母的培养方法 用 2 O g L葡萄糖、 1 O L蛋 白胨 、 5 L酵母 浸出膏、 5 L K H 2 P 0 4 、 2 g L M g S 0 4 7 H 2 0、 5 0 g L N a C 1 配制 Y P G培养基 ， p H值 为 5 2 ， 进行 7 2 h的 前期培养 ， 然后将培养 的菌体 接种 到大豆蒸煮液 培养基 ( 本文“ 1 2 ” ) 中， 接种量为 1 0 0 0个 m L ， 在 2 8 C 温度下 ， 以 1 0 0 r m i n摇床 培养。在 6 6 0 B i n 下测定培养液的吸光度。 1 4 分析检测方法 氨基酸含量采用茚三酮法测定 。酵母中糖 的 测定按国标 G B 5 0 0 9 72 0 0 3和 G B 5 0 0 9 82 0 0 3 标准进行测定 。 2 结果与分 析 2 1 蛋 白酶处理条件的确定 用蛋 白酶处理大豆蒸煮液 的过程 中， 蛋 白质 水解而游离 出来的茚三酮反应 阳性 物质 ( N r t P S ) 吉林农业大学学报 J o u r n a l o fJ i l i n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y 随时问的变化规律曲线见图 1 。 t h 一 剂量1 Do s e1 ； 一剂量2D o s e 2 一剂量3 D o s e 3 图 1 蛋 白质酶 处理 过程 中大豆 蒸煮 液 里 的 N R P S 的变 化 F i g 1 N R P S t r a n s f o r ma t i o n i n t h e s o j a c o o k i ng l i q u o r d u r in g p r o t e a s e p r o c e ss 从 图 1中可 以看 出， 3个剂量处 理只要经过 3 4 h的反应， 大豆蒸煮液中的 N R P S变化都大 致趋于稳定 。所 以， 把蛋 白酶处理大豆蒸煮液 的 时问确定为 3 h 。经过 3 h处理后 ， 测定大豆蒸煮 液 中的氮溶解系数 ( 氮溶解系数是指蛋 白质悬浊 液 中上清液的氮含量与整个悬浊液中总氮含量之 比) 。结果显示 ： 未添加酶剂 、 添加酶剂 1 处理、 添 加酶剂 2 处理、 添加酶剂 3 处理的大豆蒸煮液中 氮 溶 解 系 数 分 别 为 5 6 O 、 8 3 3 、9 1 7 、 9 5 8 。 2 2 耐盐性酵母的培养 通过蛋 白酶处理和添加葡萄糖等试验 ， 配制 大豆蒸煮液培养基见图 2 。在此培养基上进行酵 母 培养并测定菌体生长状况。 庆 匿 亟面亟 圈 ! l 鋈 亟 ( 2 I r= 叠垫堑鱼塑1 1 1 1 2 1 匝受 亟 l 直遏基堕叠亟壅鱼 ! 2 I 图 2 大豆蒸煮液培养基 的配制流程 图 Fig 2 Th e c o n f e c t i ng f lo w c h a r t o f t h e c u lt u r e me d iu m of t h e s o j a c o o k ing l i q u o r 在不同酶剂剂量处理条件下 ， 用大豆蒸煮液 培养基培养 Z R 5 1 0 株酵母 7 2 h 后 ， 酵母生长状况 见表 2 。为了便于 比较 ， 本研究参考 了 Y G P培养 维普资讯 3 6 6 吉林农业大学学报2 0 0 8年 6月 基的培养结果。在添加酶剂剂量 2的基础上再添 加 l 0 g L的葡萄糖， 或者在添加酶剂剂量 3 的基 础上再添加 5 g L以上 的葡萄糖时 ， 发现培养 的 菌体数量赶 上或超 过 Y G P培养 基 的培养 数量。 由此可以证明， 大豆蒸煮液是培养耐盐性酵母 的 理想培养基。 表 2 大豆蒸 煮液培养基上 的酵 母生长状况 ( OD s s o ) T a b le 2 D ia g r a m o f t h e g r o w i n g c o n d i t io n of t h e c u l t u r e m e d iu m o f t h e s o j a c o o k i n g l iq u o r 2 3 酵母培养过程中大豆蒸煮液培养基的成 分 变化 在大豆蒸煮液培养基 中， 含有小分子 的氮源 物质肽和氨基酸 ， 是在蛋 白酶 的处理过程 中由蛋 白质分解生成的。此外 ， 在大豆蒸煮液培养基 中 还含有未经分解 的中、 高分子蛋 白质 的残渣。为 了弄清蛋白酶处理大豆蒸煮液对酵母吸收氮源的 影响 ， 笔者对大豆蒸煮液、 大豆蒸煮液培养基和酵 母培养液进行凝胶体过滤试验( 图 3 ) 。 比较 图 3的波形发现 ， 经过蛋 白酶处理 的其 高分子段的波峰相对减小 ， 而低分子段的波 峰却 2 0 0 3 1 O 0 相对增大。与低分子段增大的幅度相比， 高分子 段减小的幅度却微乎其微 。可能是因为进行凝胶 体 的过滤试验时 ， 由于试剂 的去膜处理导致一些 不溶性蛋白质被剥离 ， 而这些不溶性蛋 白质可能 在蛋 白酶的处理过程 中被分解。 从图 3中还可以清楚地看 出， 培养酵母后 ， 培 养液 的低分子段波峰在减小 ， 但高分子段的波形 没有变化 ， 说明 Z R 5 1 0株酵母 只对低分子的氮源 进行转化 。这更加证明蛋白酶处理 的有效性。 大豆蒸煮液培养基 中无论 添加葡萄糖 与否 ， 其色谱图没有明显改变。 A 未处理妁大豆蒸煮液培养基 U n d i s p o s e d c u l t u r e m e d i u m；B 酵母培养液 ( 未添加葡萄糖 ) Z y g o s a c c h a r o m y c e s( w i th o u t d e x t r o s e ) o f t h e S O j a c o o k ；C 蛋 白酶处理后的大 豆蒸 煮液培养基 C u l tu r e m e d i u m o f t h e吣j a c o o k i n g ；D 酵母培养 液 ( 添 加 2 0 g L葡 萄糖 )Z y g o s a c c h a r o m y c e s l i q u o r a f t e r t h e p r o t e a s e d i s p o s a l( w i th 2 0 g L d e x t r o s e ) 图 3 各处 理液相色谱图 F i g 3L iq u i d c h r o ma t o g r a p h y of d iff e r e n t t r e a t me n t s J o u r n a l o fJ i l i n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y 2 0 0 8， J u n e 维普资讯 孙元宾等 ： 酿造酱油过程 中废弃液再利用的研 究 3 6 7 2 4 果胶分解酶处理对菌株生长的影响 大 豆 蒸 煮 液 中 含 有 多 糖 类 和 寡 核 苷 酸 ( O l i g o s ) 糖等多种糖分。其 中多糖质 的低分子化 处理可以为酵母的培养提供 足够的碳 、 氮源。这 正是笔者潜心研究和探讨果胶分解酶的处理方法 及其在酵母培养 中应用的目的所在 。在果胶分解 酶的处理过程 中所使用 的酶剂 可以是 G型和 s s 型中的任何一种 。在图 2所示 的流程 图中， 果胶 分解酶的处理应领先于蛋 白质分解酶的处理 。当 果胶分解酶处理之后 ， 可 以省去添加葡萄糖的步 骤 ， 其它操作流程与蛋 白酶 的处理过程完全相同。 用配制好的大豆蒸煮液培养基 ， 对 Z R 5 1 0株 酵母进行培养 ， 培养 7 2 h后 ， 测定 菌体 的生 长状 况 ， 结果见表 3 。 表 3 果胶 分解 酶处理对菌株生长 的影响 T a b le 3 In f l u e n c e o f t h e p e c t e a s e d i s p o s a l o n t h e c u l t u r e me d i u m o f t h e s o j a c o o k i n g l iq u o r 使用 1 0 g L的果胶 分解酶处 理 的培养 基 ， 菌体 的生长数量 比添加 5 g L葡萄糖的培养基培 养效果略差， 即使改变果胶分解酶的处理条件， 也 未见任何效果。由此看 出， 当利用大豆蒸煮液培 养酵母时， 添加葡萄糖 比果胶分解酶 的处理更为 有效 。果胶分解酶的处理效果不明显。 3 结论 1 )本试验研究 了回收利用在酿造酱 油过程 吉林农业大学学报 J o u r n a l o fJ i l i n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y 中残留下来 的大豆蒸煮液 ， 将其配制成培养 耐盐 性酵母培养基 的一种新方法。 2 )通过对大豆蒸煮液进行蛋 白酶处理 和葡 萄糖的添加寻找最适宜 的添加量 ，