魔芋生物碱的微胶囊化工艺及生防效果试验.pdf

第19卷 第4期 2003年7月 农 业 工 程 学 报 T ransactions of the CSA E Vol . 19 No. 4 July 2003 魔芋生物碱的微胶囊化工艺及生防效果试验 庞 杰1, 2,张甫生2,肖丽霞3,田世平1,庄宇翔2 (1. 中国科学院光合作用与环境分子生理学重点实验室,北京100093; 2.福建农林 大学食品科学学院,福州350002; 3.中国农业大学食品学院,北京100094) 摘 要:为研究生物碱微胶囊及其生物防治效果,对魔芋生物碱进行提取分离,并以其为芯材,以海藻酸钠和魔芋胶为壁 材,用锐孔2凝固法研究魔芋生物碱微胶囊的工艺条件。探讨了壁材组成、 氯化钙浓度、 固化时间及下滴速度和高度对微胶 囊效果的影响。 结果表明,飞粉与乙醇配比以13,常温下机械桨叶高速搅拌48 h为佳。 干柱层析时以甲醇为展开剂,且展 开剂与被展开溶液之间配比以3mL3mL效果最好。 正交试验结果表明,海藻酸钠和魔芋胶的最佳配比为101,氯化钙 浓度为0. 25 mol? L , 固化最佳时间为10 m in,下滴速度和高度分别以120180滴?m in和1015 cm为宜;将所制得的生 物碱微胶囊经过虫效的生防试验,探讨其引诱和忌避的效果。 关键词:魔芋生物碱;提取;分离;微胶囊化;生物防治 中图分类号: S632; O 629. 39; R944. 5; S476 文献标识码: A 文章编号: 100226819(2003)0420188205 收稿日期: 2002209223 作者简介:庞 杰(1965- ),男,博士,副研究员,现在中国科学院植 物研究所从事博士后研究。北京 中国科学院光合作用与环境分子 生理学重点实验室, 100093 通讯作者:田世平, 1 引 言 魔芋及其多糖在食品工业、 医疗上发挥着愈来愈大 的作用1 3, 在魔芋多糖生产过程中产生几乎等量的飞 粉,因其含粗蛋白,主要被用作动物饲料,但是,因其含 有生物碱,对动物口腔粘膜有强烈刺激,严重影响了动 物对饲料的采食4。生物碱是最古老的药物之一,也是 现今药物的最主要来源之一。近年来,国外对各种生物 碱的研究利用愈来愈深入5, 6,国内研究表明用生物碱 配制的植物源杀虫剂的效果不亚于常规使用的氧化乐 果,且能够有效的保护害虫天敌5 9, 但有关魔芋生物 碱方面的研究甚少10, 11。 魔芋属天南星科魔芋属 (A m orphophallus blum e)的多年生草本植物,其块茎 内含有丰富的魔芋葡甘聚糖、 淀粉、 蛋白质、 矿质元素及 生物碱等10 13, 其生物碱的成分较复杂10。魔芋产区 的农民早就有以其叶驱蚊虫的习惯,以此推测其中含有 的生物碱具有驱虫作用11 14, 并且它属于纯天然产物 提取的药物,能迅速降解,不会在环境中蓄积,对人畜安 全11 14。 微胶囊技术是近年来国内外兴起的高新技术,已广 泛用于药物控制的缓释,风味包埋等方面15, 16,而在害 虫生物防治方面的控释研究较为罕见。 本文通过对飞粉 中的生物碱提取分离,并将其制成微胶囊,研究其对害 虫拒食或驱避的影响,旨在为生物碱微胶囊化及其生物 防治效果提供参考依据及探索 “绿色蔬菜” 生产的新途 径。目的是提高魔芋的附加值及利用率,加快我国魔芋 产业化发展。 2 材料和方法 2. 1 主要材料和药品 魔芋飞粉(广西多环公司 ), 中性氧化铝 (80 200 目 ), 工业酒精(90%以上 ), 盐酸(37. 5% ),甲醇,正丁 醇,三氯甲烷,盐酸,乙酸丁酯,黄原胶,卡拉胶, 2环状 糊精,海藻酸钠、 魔芋胶、 氯化钙,吐温280。 2. 2 试验方法 2. 2. 1 生物碱提取 将魔芋飞粉用95%乙醇在JB902D型精密电动搅 拌器搅拌下浸提,得到金黄色的乙醇浸提液,然后用 9923型真空旋转蒸发器,进行真空抽滤,真空旋转蒸发 (T= 6070)将提取液浓缩至粘稠状。 2. 2. 2 生物碱的分离 1) 萃取 萃取浓缩后的半粘稠状液体用1%盐酸调pH值 至2,用三氯甲烷萃取5次,合并有机层并浓缩;水层经 氨水调节pH值至12后用正丁醇萃取5次,合并有机 层并再将其浓缩。 当以三氯甲烷萃取时,第1、2次三氯甲烷与酸化的 浓缩液以11混合萃取,后3次分别以12、13、 13的配比混合萃取,每次取得的萃取液下层(三氯甲 烷层)进行合并得样品?。当以正丁醇萃取经氨水调节 pH值至12的水层时,以同三氯甲烷萃取配比方法进行 萃取,并合并正丁醇萃取层得样品。 2) 柱层析 将所得生物碱样品? 和样品 浓缩后,分别用992 6型氧化铝层析柱进行干柱层析。并用氧化铝均匀地填 装其80%容积,然后从层析柱上端缓慢地注入萃取浓 缩液,并用展开剂使其展开。 在干柱层析展开后,分段取出各层以甲醇洗脱,然 后进行浓缩检测,合并有生物碱的部分,重复干柱层析 操作可获得不同的生物碱。 2. 2. 3 生物碱微胶囊的制备 1) 微胶囊制备的工艺过程(工艺流程如图 1) 881 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 图1 微胶囊制备的工艺流程 Fig. 1 Technological process of m icroencapsulation 2) 海藻酸钠溶液的配制 海藻酸钠为天然植物胶,配制前先用8522型恒温 磁力搅拌器将水加热至4560,而后再边快速搅拌 边将海藻酸钠均匀撒入。撒入量不能过快过多,否则溶 解不及时而结块成团,使其溶解迅速降低。 海藻酸钠与魔芋胶以一定配比完全溶解于蒸馏水 中,并调节浓度,加入生物碱的三氯甲烷溶液,搅拌4 6 h至其表面无聚集上浮油滴后, 以锐孔2凝固浴法将含 有生物碱的海藻酸钠溶液滴入CaCl2溶液中。 3) 生物碱溶液的配制 取生物碱晶体溶解于少量的三氯甲烷中。 4) 芯材与壁材的混合 将芯材缓慢地加入到海藻酸钠溶液中,均匀混合并 搅拌2030 m in,然后通过压力喷嘴,使其形成均匀的 乳化液,表面不出现油滴聚集飘浮。 5) 计算极差值R的折算值R 17 R=dRr 式中 r 设因素每个水平试验重复数;d 为折 数(当r=4时,d=0. 45;当r=8时,d=0. 34); R 为因素的极差。 6) 微胶囊 乳化液在一定的压力下,通过锐孔滴入氯化钙溶液 中进行固化18,完成微胶囊化的过程,当达到一定量 后,用滤网从固化液中取出,经清水清洗后即可得到微 胶囊,最后再用8525型电热鼓风干燥箱进行干燥。 7) 生物碱微胶囊包埋率和包埋度的测定 采 用 索 氏 抽 提 法,以 三 氯 甲 烷 作 溶 剂,并 用 UV 751GD型紫外? 可见分光光度计测定微胶囊中生物 碱的含量,并以下式计算包埋率和包埋度。 包埋率= 实际包埋量 原始添加量100% 包埋度= 实际包埋量 微胶囊质量100% 2. 2. 4 魔芋生物碱的虫效试验 虫效试验用所提取生物碱试剂以在十字花科蔬菜 上发生较重、 为害时间较长的优势种害虫小菜蛾为研究 对象。 1) 小菜蛾成虫产卵驱避作用 田间菜心地内选取大小、 长势基本一致的菜心,仔 细检查并去除植株上的卵和幼虫,挂牌标记,分为24 组,其中12组分别喷上不同的魔芋生物碱(A、B、C、D、 E、F、G、H、I、J、K、L ), 另12组分别为对照组,每组检查 10株菜心, 3个重复。 2) 生物碱微胶囊对斜蚊夜蛾幼虫驱避作用 在田间选取半径约为10 cm且较嫩的槟榔芋叶子 (较嫩的叶子对斜蚊夜蛾有一定的引诱作用 ), 仔细检查 去除植株上的卵和幼虫,然后以直径为0. 8 cm的钻孔 取叶器钻取叶片。 斜蚊夜蛾的引诱与忌避结构装置是以 带塞0. 8 cm的Y型三通玻璃管连接三只锥形瓶。 在 “处理” 的锥形瓶中放入定量的叶片,并在叶片中 洒上生物碱微胶囊。在 “对照” 的锥形瓶中放入等量于 “处理” 锥形瓶中的叶片,并在各个 “生物碱样号” 的锥形 瓶中放入斜蚊夜蛾的幼虫10条,再用带塞三通玻璃器 连接3只锥形瓶。以此法分别做12种生物碱微胶囊的 虫害试验,每种生物碱重复3次,并观察和记录。 2. 2. 5 微胶囊成型效果的评分标准 对微胶囊的成型效果进行评定,评定分为10个等 级,形状为球形,均匀,表面最光滑为10分;形状为椭圆 形,部分拖尾,表面稍不光滑为5分;形状呈蝌蚪形,不 均匀,表面不光滑或呈片状为1分。 3 结果与分析 3. 1 生物碱的浸提 浸提方法与辅助设备对浸提液也有很大影响。 试验 并以飞粉与酒精的比例,搅拌时间及搅拌设备为比较参 数,对用95%乙醇提取生物碱的效果进行了比较。通过 对比试验优化参数后,得飞粉酒精= 13,且在常温 下用机械桨叶旋转高速搅拌48 h,得到浸提液最好。但 须注意过量的浸提液,过长的浸提时间会导致浸出过多 的杂质。 3. 2 生物碱的分离 3. 2. 1 萃取 以1%盐酸调pH值至2用三氯甲烷萃取,合并的 有机层浓缩液为生物碱样品?;水层经氨水调pH值至 12后用正丁醇萃取,合并的有机层浓缩液为生物碱样 品。 酸化时醇提取液不能太稀,否则澄清时不会结块, 且应边搅拌边加酸,这样溶解效果比较好。 三氯甲烷和正丁醇的萃取液应浓缩至一定浓度,这 样可使其在柱层析时有较明显的分层效果,若浓缩液太 稠,在柱层析时三氯甲烷萃取液可用三氯甲烷溶解稀 释。但正丁醇萃取液不能直接用正丁醇溶解,须用乙醇 +氨水溶解或正丁醇+氨水溶解。除杂后,使生物碱得 到最大限度的游离,且pH值应调至12或2,这样有利 于脂溶性或水溶性生物碱的浸取。 3. 2. 2 柱层析 试验对生物碱萃取的三氯甲烷层的氧化铝干柱层 析展开剂(醋酸丁脂、 丙酮、 甲醇)及三氯甲烷与展开剂 的比率,对展开效果的影响进行了比较。得出以甲醇作 为萃取的三氯甲烷层的展开剂,且当甲醇与三氯甲烷层 的用量比例为3mL3mL时展开的效果最好。 生物碱 样品? 和样品 经过氧化铝柱层析,从样品? 中分离出 A、B、C、D、E、F共6种生物碱,从样品 中分离出G、 H、I、J、K、L等6种生物碱。在展开过程中,随着时间的 推移,展开层可能会模糊后逐渐消失,因此须及时分段 分离展开层。 981 第4期庞 杰等:魔芋生物碱的微胶囊化工艺及生防效果试验 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 3. 3 壁材的选择 壁材的选择是否得当,直接影响到微胶囊的结构, 芯材的包埋程度及微胶囊的稳定性等,故我们通过对几 种壁材包埋率和包埋度的测定及感观评定,筛选出最优 的壁材组合(见表 1) 。 表1 壁材对微胶囊的影响 Table 1 Effect of wallmaterial on the m icroencapsulation 壁材 包埋率 % 包埋度 ?% 成品状态及感官 黄原胶62. 538. 2凝胶性差,为丝状物 海藻酸钠51. 234. 9粒度较好,浅黄色,包埋效果差 魔芋胶70. 833. 6丝状物,成型速度慢,包埋效果差 2环状糊精40. 529. 8 包埋效果差 海藻酸钠+魔芋胶77. 456. 7粒度好,近透明,较好光泽度 魔芋胶+卡拉胶+黄 原胶+ 2环状糊精 78. 654. 9粒度好,色混浊,不透明 从表3可看出,在上述试验中,用海藻酸钠+魔芋 胶作壁材的微胶囊粒度、 光泽度、 透明性、 包埋率、 包埋 度性能均较好,其次是魔芋胶+卡拉胶+环状糊精。但 可能是由于纯度的关系导致成品混浊。 3. 4 下滴速度的影响 由图2可知,在下滴速度低时成型效果最好,但效 率低。随着下滴速度的加快效率升高,但是所需的压力 增大。因此,我们选用120180滴?m in的下滴速度。 图2 下滴速度对成型效果的影响 Fig. 2 Effect of drop speed on moulding 3. 5 下滴高度的影响 由图3可知,下滴高度应在1015 cm之间,有较 好的成型效果。 下滴高度太低,使胶成蝌蚪形,太高则形 状变得扁平。 图3 下滴高度对成型的影响 Fig. 3 Effect of drop height on moulding 3. 6 生物碱微胶化正交试验结果与极差分析 采用L16 (4 5) 正交试验方案对生物碱进行微胶囊试 验,四因素分别为海藻酸钠浓度(1. 0% , 2. 0% , 3. 0% , 4. 0% )、 魔芋胶浓度(0. 2% , 0. 5% , 1. 0% , 1. 5% )、 氯化 钙浓度(0. 1 mol?L , 0. 25 mol?L , 0 mol?L , 0 mol?L)、 固化时间(1, 3, 10, 60 m in ), 并对结果进行分析来确定 各因素对指标的影响趋势,如图4所示。 图4 因素对指标影响的趋势 Fig. 4 Changes of the factors affecting the index 由图4可知,其主次因素顺序是ABDC,即海藻酸 钠对试验指标的影响最大,其次分别是魔芋胶、 固化时 间和氯化钙,并在进一步试验的基础上得到最佳的组合 工艺条件是A2B1D3C2,即2. 0%海藻酸钠+ 0. 2%魔芋 胶+ 0. 25 mol?L氯化钙+ 10 m in的固化时间。 通过对比试验优化参数后,海藻酸钠与魔芋胶以8 1配比完全溶解于30 mL 45蒸馏水中,调节浓度 2. 5% ,加入2 mL生物碱的三氯甲烷溶液,搅拌46 h 至其表面无聚集上浮油滴后,以锐孔2凝固浴法将含有 生物碱的海藻酸钠溶液滴至0. 25 mol?L的CaCl2溶液 中,形成无色透明近似球状颗粒,过滤清洗得成品。 以此 法分别制得12种生物碱微胶囊。 魔芋胶可增加微胶囊的光泽度及透明度,但加入不 可过量,否则不利于微胶囊成型。水溶性生物碱所制成 的微胶囊在CaCl2溶液中停留时间不宜超过3 m in,待 成型后立即过滤取出。 其微胶囊后形成无色透明近似球 状颗粒。其粒度、 光泽度、 透明性较好,且包埋率和包埋 度高。 3. 7 生物碱缓释胶囊对小菜蛾产卵驱避作用 用上述方法分离出来的魔芋生物碱(A、B、C、D、E、 F、G、H、I、J、K、L)对十字花科蔬菜的典型害虫小菜蛾 进行防治效果试验。结果如表2。 对表2方差分析结果表明, 12种生物碱全部对小 菜蛾产卵有显著驱避作用。A、B、G、J、L等5种生物碱 的干扰作用控制指数在0. 5以下,且以A的驱避作用 最强。几种生物碱测定结果 ,A 、B、F、G、L等5种能显 著降低小菜蛾卵的孵化率,其中干扰作用控制指数值低 于0. 7的生物碱有A、B 2种,各种生物碱对卵孵化率 的影响不如产卵驱避作用显著。 3. 8 生物碱缓释胶囊对斜蚊夜蛾幼虫的影响 以上述方法试验可作表说明生物碱缓释胶囊对斜 蚊夜蛾幼虫的忌避作用(如表 3) 。 由表3可知, 12种生物碱缓释胶囊对斜蚊夜蛾幼 虫的引诱、 忌避和毒杀作用中,其中A、B、C和K对斜 蚊夜蛾幼虫的驱避毒杀作用最强 ,D 、H和I有忌避作 用,其余的未见有明显的效果。 091农业工程学报2003年 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 表2 不同魔芋生物碱对小菜蛾产卵驱避作用 (试验浓度为1 g DW (100mL ) - 1) Table 2 Expellent effect of Konjac alkaloid on D iamondback moth(p lutella xy lostella)egg2laying 试剂 平均卵密度 1( 粒? 株) 处理对照 干扰作用控制指数 A11. 2037. 200. 3011 B18. 2737. 200. 4910 C8. 2013. 100. 6260 D9. 3013. 100. 7099 E21. 6037. 200. 5860 F6. 0710. 700. 5670 G5. 3310. 700. 4984 H28. 6037. 200. 7688 I9. 2713. 230. 7003 J5. 7913. 230. 4376 K8. 3313. 230. 6297 L18. 5037. 200. 4973 表3 不同生物碱缓释胶囊对斜蚊夜蛾幼虫 引诱和忌避的作用 Table 3 Tempting and expellent effect of konjac alkaloid on D iamondback noctuid insect 试剂生物碱样品瓶处理瓶对照瓶 A1 3(1) 2(2) 5(0) AA210(10) 0(0) 0(0) A3 6(1) 0(0) 4(0) B1 7(1) 0(0) 3(0) BB2 7(5) 1(0) 2(0) B3 4(0) 2(2) 4(0) C1 5(3) 3(1) 2(0) CC2 8(8) 0(0) 2(0) C3 3(3) 3(2) 4(1) D1 3(0) 1(0) 6(0) DD2 1(0) 1(0) 8(0) D3 0(0) 1(0) 9(0) E1 1(0) 7(0) 2(0) EE2 1(0) 1(0) 9(0) E3 2(0) 4(0) 4(0) F1 0(0) 4(0) 6(0) FF2 1(0) 5(0) 4(0) F3 3(0) 1(0) 6(0) G1 1(0) 8(0) 1(0) GG2 3(0) 4(0) 3(0) G3 0(0) 9(0) 1(0) H1 1(1) 2(0) 7(0) HH2 3(3) 2(0) 5(0) H3 3(1) 1(0) 6(0) I1 5(3) 1(0) 4(0) II2 2(0) 2(0) 6(0) I3 4(1) 0(0) 6(0) J1 1(0) 4(0) 5(1) JJ2 0(0) 4(0) 6(0) J3 0(0) 0(0) 10(0) K1 0(0) 2(0) 8(0) KK2 2(1) 3(3) 5(2) K3 1(1) 1(0) 9(0) L1 1(0) 6(0) 3(0) LL2 0(0) 4(0) 6(0) L3 0(0) 8(0) 2(0) 3括号前为各瓶中斜蚊夜蛾幼虫的总数,括号内为死亡的斜蚊夜蛾幼虫 数目。 4 讨 论 微胶囊壁材可单独用海藻酸钠,但包埋率和包埋度 相对不高,加入适量魔芋胶后,微胶囊成品可呈无色、 透 明、 有较好的光泽,并且可提高魔芋生物碱三氯甲烷溶 液的乳化程度,但加入不可过量,否则粘度增加不利于 微胶囊成型。 且水溶性生物碱所制成的微胶囊在氯化钙 溶液中停留时间不宜超过3 m in,待成型后立即过滤取 出,以免生物碱成分流失。 同时乳化剂的选择十分重要, 若乳化剂选取不当,不能使芯材较好地乳化,包埋率和 包埋度必然降低,而且在包埋一段时间后会出现 “漏油” 现象。此外,锐孔成型时以液体形式滴入固化液中固化 成型18,成型大小与锐孔有关,锐孔一般控制在0. 5 mm以上,若锐孔直径过小,则难以全液滴通过。 将生物碱微胶囊后用于小菜蛾和斜蚊夜蛾等害虫 上研究其生防效果,发现取食十字花科植物的小菜蛾产 生驱避和拒食作用,处理植株的小菜蛾的落卵量、 幼虫 数或成虫数显著低于对照,目标植物得到较好的保护。 幼虫取食少量处理叶片后,行动缓慢,虫体柔软弯曲,昏 迷后排出较稀的成串粪便,经一段时间后能复苏9。某 些生物碱微胶囊对斜蚊夜蛾的幼虫有一定的忌避、 毒杀 或引诱的作用,能够较好保护槟榔芋叶不被斜蚊夜蛾幼 虫侵蚀。 魔芋生物碱对害虫的作用是多方面的,初步推断以 驱避和拒食作用为主,同时也影响着昆虫的生长、 发育 和繁殖,并对昆虫还有较强的毒杀作用。又鉴于生物碱 能迅速降解,无生态环境污染问题,对人畜安全,且还不 产生抗性、 无药害、 有肥效,对作物生长有刺激作用等优 点,有较高的选择性。 因此如将其配成植物保护剂,用于 绿色蔬菜的生产,可大大减少由于长期大量使用杀虫剂 所导致的环境污染问题、 害虫抗药性、 再猖獗问题和次 要害虫上升为主要害虫等三大问题,可能会取得较为理 想的害虫防治效果。魔芋生物碱防治害虫,生产绿色蔬 菜具有重大的实际意义。 因此可深入地研究魔芋生物碱微胶囊对蔬菜害虫 的驱避拒食及毒杀作用,并为今后开发以魔芋生物碱为 芯材的缓释制剂作为生物碱缓释控释农药6, 9, 14提供依 据。 5 结 论 魔芋生物碱在提取、 分离时,以飞粉乙醇配比为 13,且在常温下高速搅拌48 h,所取得效果最好,并 且在三氯甲烷层以甲醇作展开剂,比例为11时展开 效果最好。 在微胶囊成型过程中,海藻酸钠对成型效果影响最 大,其次是魔芋胶、 固化时间和氯化钙,最佳的组合工艺 条件是2. 0%海藻酸钠+ 0. 2%魔芋胶+ 0. 25mol?L氯 化钙+ 10 m in固化时间;且较优的下滴速度与下滴高 度分别为120180滴?m in及1015 cm。 魔芋生物碱对小菜蛾和斜蚊夜蛾具有一定的引诱 及忌避作用。 191 第4期庞 杰等:魔芋生物碱的微胶囊化工艺及生防效果试验 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. 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