乳链菌肽Nisin的生物合成及表达调控机制.pdf

收稿日期: 2009- 07- 24 ; 修回日期: 2009- 08- 12 作者简介: 肖长清 ( 1979- ) , 男, 讲师, 硕士, 研究方向为应用 微生物。 doi? 10. 3969 /j? issn?1008- 9632. 2010?05?088 乳链菌肽 Nisin的生物合成及表达调控机制 肖长清, 周? 洁 ( 湖北第二师范学院 化学与生命科学学院, 武汉 430205) 摘? 要: 乳链菌肽 N isin是乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)产生的一种多肽类抗菌物质, 是一种由 34个氨基酸组成的 羊毛硫细菌素。与 N isin合成有关的基因有 11个, 构成一个基因簇 nis A (Z)BTCI PRKFEG。这些相关基因组成三个 操纵子进行转录, 分别是 nis A (Z)BTCIP、 nis RK 和 nis FEG。N isin通过 N isRK双组分调节系统诱导自身合成, 而 N isI 和 N isFEG赋予了 N isin产生菌对 N isin的免疫性。对于 N isin的生物合成机制人们展开了非常广泛的研究。本文 对 N isin的结构、 N isin合成相关的基因簇、 N isin的生物合成及表达调控机制以及 N isin产生菌对 N isin的免疫性进 行了综述。 关键词: 乳链菌肽; 细菌素; 生物合成; 表达调控 中图分类号: Q936文献标识码: A文章编号: 1008- 9632( 2010)05- 0088- 03 Biosynthesis and regulation ofNisin XIAO Chang?qing, ZHOU Jie ( College of Chem istry and L ife Sciences , HubeiUniversity of Education, Wuhan 430205, China) Abstract : The anti m icrobialpeptide , N isin, which belongs to lantibiotics , produced by several strains ofLactococcus lactis ,is a 34?a? m ino acid bacteriocin. A cluster of 11 genes nis A (Z)BTCIPRKFEG has been involved in the biosynthesis ofN isin. The genes are ar? ranged as three operons: nis A (Z)BTCIP, nis RK and nis FEG. . N isin biosynthesis is auto?regulated through the two?component regula? tory syste m N isRK. The i mmunity ofN isin?producing strains is conferred by N isI andN isFEG. W ide research on theN isin biosynthesis has been carried out . This revie w outlines the structure and genes ofN isin, the biosynthesis and regulation ofN isin,and the i mmunity ofN isin?producing strains . K eywords : N isin; bacteriocin; biosynthesis ;regulation 乳链菌肽 (N isin), 又称乳酸链球菌肽或乳酸链球菌 素,是乳品发酵微生物乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)的某 些菌株产生的一种多肽类抗菌物质, 这种微生物过去被称 为乳酸链球菌 (Streptococcus lactis)。N isin对革兰氏阳性 菌呈广谱抗菌作用,包括许多导致食品腐败的微生物, 同 时 N isin对人体安全无毒。所以 N isin作为一种天然食品 防腐剂已在 50多个国家和地区得到应用, 主要用于乳制 品、 罐头食品、 肉制品等的防腐保鲜 1。作为一种独特的 抗生素, N isin在医药方面也有一定的应用 2。 N isin属于 A类羊毛硫细菌素 3, 是人们研究最为深 入的细菌素。成熟的 N isin由 34个氨基酸组成 (参见图 1), 含有 1个羊毛硫氨酸 Ala?S? Ala( Lan)和 4个 ? 甲基羊 毛硫氨酸 Abu?S? Ala(M eLan), 通过这 5个特殊氨基酸的 硫醚键在分子内形成五个内环。另外还含有两个脱氢丙 氨酸( Dha)和一个 ? 甲基脱氢丙氨酸 ( Dhb)。这些稀有 氨基酸都是经过翻译后修饰产生的, 所以 N isin的成熟过 程需要经过一系列翻译后的酶修饰作用。同时 Nisin的生 物合成还受到自身的诱导。随着分子生物学的发展, 人们 对 Nisin的研究也越来越深入, 本文对 Nisin的生物合成机 制及其表达调控的最新进展作了较全面的阐述。 图 1 N isin的分子结构 4 F ig 1 Schematic representation of the structure ofmature N isin 1? 乳链菌肽生物合成的相关基因 与 Nisin合成有关的基因有 11个, 构成一个约 14kb 的基因簇 nis A (Z)BTCIPRKFEG。该基因簇位于一个大约 88 第 27卷第 5期 2010年 10月 生 物 学 杂 志 JOURNAL OF BI OLOGY Vo. l 27? No . 5 Oct , 2010 6 70kb的接合性乳链菌肽? 蔗糖转座子上, 除了 N isin合成相 关基因外, 还有利用蔗糖、 一个或多个噬菌体抗性系统和 合成 N 5 ?( L?1?carboxyethyl) ? L?ornithine的功能, Tn5276是 目前研究的最为详细的一个 5 (参见图 2)。 图 2乳链菌肽? 蔗糖转座子及乳链菌肽生物合成基因簇 F ig 2 N isin?Sucrose transposon and the transcriptional organization ofN isin biosynthetic gene cluster 天然的乳链菌肽 N isin有两个变异体: NisinA和 N is? inZ 6。这两个变异体的差异仅是乳链菌肽分子第 27位 上的氨基酸不同, NisinA的是组氨酸 (H is),而 NisinZ则是 天冬酰氨 ( Asn)。基因 nis A /Z 是编码 N isin的结构基因, 编码由 57个氨基酸组成 N isin前体多肽 4 (参见图 3), 其 N端含有 23个残基的前导序列。N isin前体多肽分泌到 胞外后,经蛋白酶 N isP 7作用切除前导序列, 剩余 34个 残基形成成熟的乳链菌肽分子。 基因 nisB 编码脱水酶 NisB 8, 催化色氨酸 ( Ser)、 苏 氨酸( Thr)脱水,分别生成脱氢丙氨酸 ( Dha)和 ? 甲基脱 氢丙氨酸 (Dhb)。基因 nis C 编码环化酶 NisC 9, 催化脱 氢丙氨酸 ( Dha)与半胱氨酸 ( Cys)形成羊毛硫氨酸 A la?S? A la(Lan), 催化 ? 甲基脱氢丙氨酸 ( Dhb) 与半胱氨酸 (Cys)形成 ? 甲基羊毛硫氨酸 Abu?S? Ala(M eLan)。Nisin 前体多肽经 N isB和 NisC修饰后, 由基因 nis T编码的 ABC 转运蛋白 N isT 10转运到胞外, 再由基因 nis P 编码的蛋白 酶 NisP水解去除前导序列形成有活性的成熟乳链菌肽 N isin。NisB、 N isC和 N isT都是膜蛋白, 而且相互作用形成 一个复合体 11 (参见图 4), 共同完成对 Nisin前体多肽的 修饰和跨膜运输。 基因 nisI编码的脂蛋白 N isI和基因 nis FEG 编码的 ABC 转运蛋白 N isFEG, 与细菌对 N isin 的免疫 性有 关 12- 13。基因 nis R 编码的胞内应答调节物 NisR 7 和基 因 nis K 编码的位于细胞表面的组氨酸激酶 N isK 14, 构成 双组分调节系统 N isRK调节 N isin的表达。 2? 乳链菌肽合成基因簇的转录单元及其启动子 N isin合成相关基因组成三个操纵子进行转录, 分别 是 nis A (Z)BTCIP、 nis RK 和 nis FEG,由 nis A、 nisR和 nisF 启 动子控制其转录, 同时在基因 nisI之前还有一个独立的启 动子控制其转录 15- 16 (参见图 5)。 图 5合成 N isin的基因簇 F ig 5 Transcriptional organization ofN isin biosynthetic gene cluster nis A 和 nis F 启动子有很大同源性, 为可诱导调控的启动子 ( P* 表 示 ), P表示启动子为组成型。nis A 和 nis B 间存在一个反向重复序 列, 可能起到转录终点信号的作用, 负责有限的通读。 图 6 17- 18显示了 nis A、 nis R 和 nis F 启动子的 DNA序 列。nis A 和 nisF 启动子显示出极大的同源性, - 35区极 为类似, 以 CTG起始, 且- 35区和 - 10区中间间隔 20bp, 符合乳酸菌可调控启动子的共同特征。实验也证实 nis A 和 nis F 启动子是可诱导调控的启动子, N isin可以通过双 组分调节系统 N isRK诱导调控 nis A 和 nis F 启动子的转 录。 nis R 启动子与 nis A 和 nisF启动子没有明显的同源性。 且 nis R 启动子是组成型表达的, 所以双组分调节系统 N isRK也是组成型表达的, 这样 N isin产生菌才能对环境中 的 Nisin产生应答, 激活 nisA和 nisF启动子的转录。 图 6 nisA、 nisF和 nisR启动子序列比较 Fig 6 Comparison of the nis A, nisF and nis R promoter sequences 下划线 ( _)表示 - 35区和 - 10区及起始密码子, 竖线 ( )示 ni ? sA和 nisF启动子的同源性, 星号 (* )示核糖体结合位点 3? 乳链菌肽的生物合成和调节过程 图 7较完整的描述了 Nisin合成和调控的过程。结构 基因 nis A /Z 编码的 N isin前体多肽先由水解酶 N isB和环 化酶 NisC 修饰加工, 再由 ABC 转运蛋白 NisT转运到胞 外,经蛋白酶 NisP水解去除前导序列形成成熟的 N isin。 89 第 27卷第 5期 2010年 10月 生 物 学 杂 志 JOURNAL OF BI OLOGY Vo. l 27? No . 5 Oct , 2010 6 成熟的 Nisin作为信号分子与自身细胞表面的受体组氨酸 激酶 N isK结合使之活化, N is K接着使胞内的调节物 NisR 磷酸化从而激活 N isR, NisR进而促进结构基因 nisA /Z 和 与免疫性相关的基因 nis FEG 的表达。可以看到 N isin会 通过双组分调节系统 NisRK促进 N isin自身的表达。这里 值得注意的是, 基因 nis RK 前面的启动子是组成型的; 而 基因 nis A /Z、 nisFEG前面的启动子是诱导型的, 受 N isR的 正调控。 4? 乳链菌肽产生菌对乳链菌肽的免疫性 N isin对于自身细胞也是有毒性的, 所以 N isin产生菌 需要建立相应的免疫系统来抵抗 N isin对自身的伤害。 N isin产生菌对 N isin的免疫性主要由脂蛋白 N isI和 ABC 转运蛋白 N isFEG 这两个免疫系统提供 13。脂蛋白 NisI 位于细胞膜外表面 (见图 7), 与 Nisin有较强的亲和力, 从 而可以优先结合 N isin,避免 Nisin与细胞膜的接触从而保 护细胞。蛋白 N isF具有 ATPase活性, 蛋白 NisE和 NisG 属于膜蛋白, 蛋白 N isFEG组成四聚体的复合物 (见图 5), 它是一种 ABC转运蛋白,其功能就是将侵入细胞膜的 N i? sin转运到胞外空间从而保护细胞。N isI和 NisFEG这两 个免疫系统是相互独立的, 两者都可以单独起作用, 其中 N isI提供的免疫能力要强于 N isFEG; 但是这两个免疫系 统具有协同作用。 图 7乳链菌肽的生物合成和调节过程 4 Fig 7 Schematic representation of nisin biosynthesis and regulation 基因 nisI的表达一方面由 nis A 启动子控制转录,受到 N isin的诱导调节; 同时 nisI前面有一个独立的启动子, 是 组成型表达的 16。而基因 nis FEG 的表达主要受到 Nisin 的调控, N isin的表达会促进 NisFEG的表达, 进而提高自 身对 N isin的免疫力。 5? 结语 乳链菌肽 N isin作为一种安全高效的天然防腐剂已经 在许多国家用于食品防腐和医疗保健。但是由于 N isin的 生产成本较高,限制 N isin的广泛应用。通过对 Nisin的生 物合成机制和表达调控的深入研究, 可以帮助人们构建高 产工程菌、 改进生产工艺, 从而降低其生产成本, 提高其应 用范围。再结合人们对 N isin分子结构与功能关系的研 究,对其进行结构改造, 必将使 N isin在食品、 医疗领域发 挥更大的作用。 参考文献: 1 Delves?Broughton J ,Blackburn P, Evans R J ,et a. l Applications of the bacteriocin ,nisin J. 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