木醋杆菌利用酵母发酵滤液产高纤椰果的研究.pdf

研究报告 中 国 酿造 2 0 0 8 年第9 期 总第 1 8 6 期 7 1 木醋杆菌利用酵母发酵滤液产高纤椰果的研究 邓毛程， 朱晓立 ， 李胜 ( 广东轻工职业技术学院， 广东 广州 5 1 0 3 0 0 ) 摘要 ： 利用酵母与醋酸菌 的共 生关系， 以酵母发酵滤液为培养基进行木醋杆菌的高纤椰果发酵， 对影响因素进行了初步研究。 结果 表明， 主要影响因素是酵母发酵液的乙醇浓度与滤液培养基的初始p H 值， 当酵母发酵1 4h 、 乙醇浓度为2 0 ( v o 1 ) 时， 发酵滤液可作 为木醋杆菌的适宜发酵培养基， 适宜的初始p H值为6 0 ， 此时高纤椰果产量达到最高， 干纤维素产出水平可达l 7 4 8 g L ， 比参照培养 基初始p H 4 5 时的产出水平提高 了3 7 3 。因此 ， 酵母发酵滤液培养基对高纤椰果发酵产量 的提高具有促进作用 。 关键词： 高纤椰果； 木醋杆菌； 酵母 中图分类号： Q 9 3 6 文献标识码 ： A 文章编号 ： 0 2 5 4 5 0 7 1 ( 2 0 0 8 ) 0 9 0 0 7 1 0 3 S t u d y o nNa t a d e C O C O p r o d u c t i o n b yAc e t o b a c t e r x y l i n u m f e r me n t a t i o n o ny e a s t b r o t h fi l t r a t e DENG M a o c h e n g ， Z HU Xi a o l i ， L I S h e n g ( G u a n g d o n g T e c h n i c a l C o l l e g e o f L i g h t I n d u s O y , G u a n g z h o u 5 1 0 3 0 0 , C h i n a ) Ab s t r a c t ： S i n c e Ac e t o b a c t e r x y l i n u m c o u l d s y mb i o s e wi t h y e a s t ，Na t a d e C O C O p r o d u c ti o n wa s p romo t e d b y Ax y l i n u m o n y e a s t b r o th fi l t r a t e I n fl u e n c e f a c t o r s o n Na t a d e C O C O p r o d u c ti o n we r e s t u d i e d p rima r i l y T h e r e s u l t s s h o we d tha t i n i ti a l p H a n d e t h a n o l c o n c e n t r a ti o n o f fi l t r a t e we r e k e y f a c t o rs Wh e n the e thano l c o n c e n t r a t i o n r e a c h e d 2 0 ( v o 1 ) f o r 1 4 h f e r me n t a t i o n b y y e a s t ， the y e a s t b r o th fi l t r a t e wa s o p t ima l me d i u m f o r N a ta d e C O C O p r o d u c ti o n b y A c e t o b a c t e r x y l i n u m w i m o p t ima l ini ti a l p H o f 6 0 Un d e r a b o v e c o n t i o n s the N a ta d e C O C O y i e l d wa s m a x i m a l and the yi e l d o f d r y c e l l u c o s c r e a c h e d 1 7 4 8 g L， wh i c h wa s i mp r o v e d b y 3 7 3 tha n tha t o ff e r me n tat i o n、 i m i n i t i a l p H o f 4 5 T h e r e f o r e ， the y e a s t b roth fil t r a t e e n ha nc e d Na ta d e CO C O p r od u c t i o n o fAc e t ob a c t e r x yl i n u m Ke ywo r d s ： Na tad e C O C O ； Ac e t o b a c t e r x y l i n um ； y e a s t 高纤椰果是产膜醋酸菌在 以椰子水为主要原料的培 养液中静态 发酵， 液体表面形成 富含纤维 素的凝胶膜 状物【 ” 。由于高纤椰果持水性强， 咀嚼性好， 具有减肥、 清 肠胃、 防便秘等保健功能， 可作为一种优 良的高纤维食品， 在中国、 日本 菲律宾和印度尼西亚等国家十分畅销 2 。高 纤椰果原产于菲律宾， 其起源培养基为椰子水， 所追求的 发酵产物是细菌纤维素，关于纯种微生物的细菌纤维素 发酵条件， 国内外众多研究者已进行了大量研究工作 。 我国传统的红茶菌饮料具有悠久历史，其表面的凝胶膜 状物与高纤椰果一样， 都是细菌纤维素睁 7 】 ， 但是， 红茶菌由 醋酸菌、 酵母菌和乳酸菌等多种微生物组成， 菌种间存在着 互生关系 8 - 埘， 这种互生关系也许有利于高纤椰果发酵。因 此， 本文研究了酵母发酵滤液作为培养基的高纤椰果发 酵 条件 。 1材料 与方法 1 1材料与设备 1 1 1材料 木醋杆菌 x y l i n u m ) Y D0 7 0 5 ： 海南亿德食品有限公 司提供： 酵母 A S 2 1 1 9 0 ： 广州甘蔗糖业研究所提供 ； 椰子 水( 成熟椰子破壳取水) ： 海南文昌产 ； 麦芽、 蔗糖、 N I - L C 1 、 K H P O 4 、 Mg S 0 4 、 C a C 1 2 、 F e S O 4 、 Na A C、 N a O H、 营养琼脂等 均为市售 。 1 1 2设备 D NP 一 9 1 6 2电热恒温培养箱： 上海精宏实验设备有限 公司； HWY 2 1 1 恒温振荡培养箱： 上海致诚分析仪器有限 公司； D H G9 1 4 0电热恒温干燥箱： 上海基玮试验仪器设备 公司； S e v e n Mu l t i p H计 ( S 4 0 ) ： Me t t l e r T o l e d o公 司。 1 2 工艺流程 酵母斜面- - 2 5 0 m L三角瓶静置培养- * 2 0 0 0 m L三角瓶静置培养一 过滤除菌一滤液- - - 2 5 0 m L烧杯浅层静态发酵 1 o o o mL三角 振荡培养 醋酸菌斜面 1 - 3麦芽汁制备 按文献 1 l 】 的方法进行制 备 。 1 4酵母斜面及其扩大培养 1 4 1酵母斜面培养 将制备 的麦芽汁稀释至 l 0 o B x ， 加入 2 0 g L琼 脂 ， 分装 入试管 ， 1 2 1 灭菌 2 0 mi n ， 可制得斜面。 斜面接种后， 3 0 培养 2 4 h 。 1 4 2酵母扩大培养 2 5 0 mL三角瓶中装入 1 0 。 B x 麦芽汁 5 0 mL ， 用 8层纱 布包扎瓶 口， 1 2 1 灭菌 2 0 mi n ， 冷却至 3 0 ， 接入 1 环酵 母斜面菌种， 置于 3 0 静置培养 2 4 h 。 1 5醋酸菌斜面及其扩大培养 1 5 1醋酸菌斜面培养 称 取 营 养 琼脂 3 3 g ， 加 入 椰子 水 5 0 0 m L， 蒸 馏水 收稿日期： 2 0 0 8 0 1 0 9 作者简介 ： 邓毛程 ( 1 9 7 1 ) ， 广东徐 闻人 ， 高级工程师， 主要从事微生物技术研 究与教学工作。 维普资讯 2 0 0 8 N o 9 7 2 S e r i a l N o 1 8 6 Ch i n a Br e wi n g R e s e a r c h R e p o r t 5 0 0 m L ， 自然 p H值， 1 2 1 灭菌 2 0 mi n ， 可制得斜面。斜面 接种后 ， 置于 3 0 培养 3 6 h 。 1 5 2醋酸菌扩大培养 液体培养基：蔗糖 8 O g m， N H 4 C 1 4 g m， Mg S O 0 2 g L ， C a C h 0 2 g L ， F e S O 0 0 0 5 g L ， Na A C0 1 g L ， 酵母膏 0 5 g L ， 椰子水 5 0 0 mL ， 蒸馏水 5 0 0 mL ， 调节 p H 4 5 。 l O 0 0 mL三角瓶装入 2 0 0 mL液体培养基， 8层纱布包 扎瓶 口， 1 2 1 灭菌 2 0 mi n ， 冷 却至 3 0 ， 接 入 l环活化 好 的醋酸菌斜面菌种， 恒温 3 0 、 1 5 0 r mi n振荡培养 1 2 h 。 1 6高纤椰果发酵 1 6 1直接发酵 按 1 5 2 配制发酵培养基， 装入 2 5 0 m L无菌烧杯中， 每个烧杯装液 1 0 0 m L， 用 8层纱布包扎烧杯 口， l 2 l 灭菌 2 0 mi n ， 冷却至 3 0 ， 接入 1 5 2培养所得醋酸菌培养液 2 5 mL ， 置于 3 0 静置培养 2 4 0 h 。 1 6 2滤液发酵 按 1 5 2中培养基配方配制 9 5 0 mL发酵培养基， 装入 2 0 0 0 mL三 角瓶， 8 层纱 布包扎 瓶 口， 1 2 1 灭 菌 2 0 mi n ， 冷 却至 3 0 ， 接入 1 4 2 培养所得的 5 0 mL酵母培养液， 置于 3 0 进行发酵 。分别在酵母发酵 1 0 h 、 1 2 h 、 1 4 h 、 1 6 h 、 l 8 h ， 在无菌操作条件下， 用无菌的细菌过滤器对酵母发酵液进 行过滤， 用无菌 N a O H溶液调节滤液 p H 4 5 ( 或其他设定 p H值) ， 然后将滤液装入 2 5 0 mL无菌烧杯中， 每个烧杯装 1 0 0 m L， 并接入 1 5 2培养所得醋酸菌培养液 2 5 mL ， 用 8 层纱布包扎烧杯 口， 置于 3 0 静置培养 2 4 0 h 。 1 7测定方法 乙醇的测定： 采用比重瓶法测定1 2 。 纤维素干重的测定： 取出浮于液面的高纤椰果， 用大 量水冲洗， 去除高纤椰果表面培养基等杂质， 再将其浸泡 于 0 1 mo l L的N a O H溶液中， 1 0 0 煮沸 2 0 mi n ， 去除残留 在内部的菌体和培养基f 1 】 。 然后， 用蒸馏水洗涤、 浸泡， 使 浸泡水 p H值为 7 o 7 2 ， 置于 l 0 5 干燥至恒重， 称重可 得纤维素干重。高纤椰果持水性极强， 以湿重衡量其产 量误差较大， 需采用干纤维素绝对产量和干纤维素产出水 平进行比较， 干纤维素产出水平是每升培养液含有的干纤 维素量 ， g L 。 醋酸 菌 的活 菌 数测 定 ： 采 用平 板 菌 落计 数 法测 定 【 】 ， 平板培养基及其培养条件 同 1 5 1 。 p H值的测定： 采用 p H计测定。 2结果与讨论 2 1不同培养基的高纤椰果发酵 以发酵培养基直接接入醋酸菌发酵为参照 ， 酵母发酵 1 0 h 、 1 2 h 、 1 4 h 、 1 6 h 、 1 8 h的滤 液 经 调节 p H 4 5后 接 入醋 酸 菌发酵， 其干纤维素产出水平及酵母发酵阶段的乙醇产出 水平见图 l 。 毛 D * 寻 | fL 懈 水平 6 o o 5 0 0号 4o o 3 0 0安 丑 2 0 0 L l 舶 对照 1 O l 2 l 4 l 6 l 8 酵母滤液发酵 时间 h 图 1不问培养基 的发酵结果 F i g u r e 1 E t h a n o l y i e l d a n d d r y c e ll u c o s e y i e l d O n d i ff e r e n t me d i u m 从图1 看出， 以酵母发酵 1 4 h的滤液为培养基， 其干 纤维素产出水平最高， 达到 1 5 8 2 g L ： 在酵母发酵 1 4 h以 前， 酵母发酵时间愈长， 干纤维素产出水平愈高： 在酵母发 酵 1 4 h以后， 随着酵母发酵时间延长， 其干纤维素产出水 平呈明显下降趋势。影响干纤维素产出水平的主要原因 是酵母发酵液组分变化， 其中乙醇与残糖的浓度变化是关 键因素 。 由于酵母产生的乙醇可促进醋酸菌的生长， 并在细菌 纤维素发酵过程中起能源物质的作用， 故一定量乙醇积累 有利于细菌纤维素的生成。试验表明， 酵母发酵 1 4 h的乙 醇浓度为 2 ( v o 1 ) ， 以其滤液为培养基的高纤椰果产量最 高， 比对照培养基的高纤椰果产量提高了2 4 3 ： 当乙醇 浓度高于 2 ( v o 1 ) 时， 高纤椰果产量反而下降， 酵母发酵 液中残糖过低是其中原因之一， 但不排除醋酸菌过渡繁殖 而影响高纤椰果产量的因素存在， 这点尚待深入研究。 2 2适宜滤液培养基中细胞数与p H值的变化 从 2 1 可 知酵母 发酵 1 4 h的滤液 是本 次试 验 的适宜 培养基， 在以对照培养基与适宜培养基进行高纤椰果发酵 过程中， 测定醋酸菌的活菌数及 p H值， 结果见图2 。 。 - 一 对照培养基的活菌数一 滤液培养基的活菌数 一对照培养基的p H 值 滤液培养基的p H 值 5 0 o 4 5 O 4 0 0趔 3 5 O 3 0 o 2 5 O O 2 4 4 8 7 2 9 6 l 2 Ol 4 4l 6 8 1 9 221 62 4 0 醋酸菌发酵时间m 图2适宜滤液培养基中活菌数与p H值的变化 F ig u r e 2 C h a n g e s o f v ia b l e c o u n t a n d p H o n t h e o p t i ma l f i lt r a t e me d i u m 从图 2 看出， 醋酸菌在适宜滤液培养基中的生长速度 比对照培养基快 ， 其活菌数在发酵 9 6 h可达到最大值， 比 加 舳 2 1 1 O 0 0 一 _1 1 0 _【 x s x ) 粗烬 煺 一_1Iu 0 _【 x ) 粗烬匪靛 维普资讯 研究报告 中 国酿造 2 0 0 8 年第9 期 总第 1 8 6 期 7 3 对照培养基提前 2 4 h左右， 且活菌数最大值是对照培养基 的 l 0 3倍。活菌数的变化曲线再次证明了酵母发酵滤液 中乙醇对醋酸菌 生长有 促进作用 。 在发酵过程中， 随着醋酸菌代谢所产生的醋酸、 葡萄 糖酸等酸性物质逐渐积累， p H值呈逐渐下降趋势 。其中， p H值下降幅度在发酵 7 2 h以前相当明显； 当 p H值下降 至 3 2左右时， p H值逐渐成为菌体生长和细菌纤维素合 成的抑制因素， 致使其下降速度开始缓慢。 由于醋酸菌在 适宜培养基 中迅速繁殖， 促使发酵液 中糖分被迅速消耗 ， 故 p H值下降速度快于对照培养基， 从而使 p H值对细菌 纤维素合成的抑制作用提前。 2 - 3不同初始 p H值的滤液培养基发酵结果 分别将滤液的 p H值调节至 4 5 、 5 0 、 5 5 、 6 0 、 6 5 ， 然后 按 1 6 2方法发酵， 其结果见图 3 。 醋酸菌最适生长 p H值范 围与细菌纤维素最适合成 p H值范围不尽相同【 ， 而在高 纤椰果的浅层静态发酵中难以实现分阶段控制 p H值， 因 而选择适宜初始 p H值至关重要。 丑 L 1 8 O O 7o o 6 o 0 5 o 0 从图 3 可以看出， 在 p H 4 5 6 O随着发酵初始 p H值 的上升， 其细菌纤维素产出水平呈逐渐增大的趋势， 当初 始 p H值为 6 0时， 高纤椰果产量达到最高， 其干纤维素产 出水 平 为 1 7 4 8 g L， 比初 始 p H 4 5时 的产 出水平 提 高 了 1 0 5 。结果表明， 由于滤液培养基与对照培养基的组分 不同， 所需的适宜初始 p H值也有所不同， 对于本次试验 中的适宜滤液培养基， 其适宜初始 p H值为 6 0 。 3结论 由于酵母与醋酸菌之间存在共生关系， 利用酵母发酵 滤液作为醋酸菌的高纤椰果发酵培养基， 对高纤椰果产量 的提高具有促进作用。 酵母发酵液的乙醇浓度与滤液培养基 的初始 p H值是影响滤液培养基高纤椰果发酵的重要因 素。在本次试验中， 酵母发酵 1 4 h的乙醇浓度为 2 0 ( v o 1 ) ， 以其滤液为发酵培养基， 其适宜初始 p H值为 6 0 ， 高纤椰 果产量达到最高， 其干纤维素产出水平可达 1 7 4 8 g L， 比 对照 培养基 在适 宜初 始 p H 4 5时 的产 出水平 提高 了 3 7 3 。试验结果可供高纤椰果发酵生产借鉴， 但 以酵母 发酵滤液为培养基的高纤椰果发酵工艺仍需进一步优化。 参考文献： 1 】 黄艳， 李从发， 汪全伟等 红曲椰果液态发酵工艺条件的优化 J 食 品研究与开发， 2 0 0 6 ， 2 7 ( 8 ) ： 1 2 0 ， 1 2 3 2 】 施庆珊 细 菌纤维 素的研 究进展 J 】 生物学杂志 ， 2 0 0 4 ， 2 1 ( 5 ) ： 1 2 1 5 3 1 付莉 细菌 纤维 素 的研 究 进展 J 1 食 品研究 与开 发 ， 2 0 0 4 ， 2 5( 2 ) ： 1 8 2 O 【 4 】 马 霞， 王瑞明， 关风梅， 等 发酵生产细菌纤维素的研究进展【 J 中 国酿造， 2 0 0 2 ( 6 ) ： 5 - 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