山茱萸总皂苷的大孔吸附树脂分离与纯化研究.pdf

药物制剂 山茱萸总皂苷的大孔吸附树脂分离与纯化研究* 李欣孺,赵摇 峰,龙摇 伟,刘培勋 (中国医学科学院、北京协和医学院放射医学研究所,天津摇 300192) 摘摇 要摇 目的摇 利用大孔吸附树脂实现对山茱萸总皂苷的系统分离与纯化,并筛选出适合于山茱萸总皂苷分离 与纯化的大孔吸附树脂型号。 方法摇 从静态吸附和动态吸附两个方面对三种型号的大孔吸附树脂 HPD鄄300、AB鄄8、SA鄄2 型进行综合评价,筛选出效果最佳的型号,并利用它进行山茱萸总皂苷的系统分离与纯化。 结果摇 HPD鄄300 型大孔吸附 树脂对山茱萸总皂苷的分离效果最佳。 得到山茱萸总皂苷的有效部位,并有较好的纯化效果。 结论摇大孔吸附树脂能 有效分离与纯化山茱萸总皂苷的有效部位,而其中 HPD鄄300 型大孔吸附树脂更适合于山茱萸总皂苷的分离与纯化。 关键词摇 山茱萸;总皂苷;大孔吸附树脂;分离;纯化 中图分类号摇 R282. 71;R283. 3摇 摇 摇 文献标识码摇 A摇 摇 摇 文章编号摇 1004鄄0781(2009)06鄄0767鄄04 Study on the Macro鄄porous Resins for Isolation and Purification of Cornus Officinalis Saposins LI Xin鄄ru, ZHAO Feng ,LONG Wei, LIU Pei鄄xun (Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College, Institute of Radiation Medicine, Tianjin 300192 ,China) ABSTRACT摇 Objective摇 To explore the optimal type of macro鄄porous resins for isolating and purifing Cornus officinalis saposins. 摇 Methods摇The comphrehensive evaluation of the optimal type among HPD鄄300 resin、AB鄄8 resin and SA鄄2 resin with both static and dynamic adsorptions was conducted, and the best one screened out was used to purify Cornus officinalis saposins. 摇Results摇It was showed that resin HPD鄄300 had better adsorption properties for Cornu officinalis saponins. 摇 Conclusion摇 The macro鄄porous resins are useful to isolate and purify total saposins in Cornus officinalis. The HPD鄄330 resins is more suitable for purifying Cornus officinalis saposins. KEY WORDS摇 Comus officinalis;Saponins;Macro鄄porous resin;Isolation;Purification 摇 摇 山茱萸(Cornus officinalis Sieb. et Zucc. )为山茱萸 科植物,是我国人民常用的滋补强壮药,其干燥成熟果 肉不仅常作为药用,由于其果肉中含有大量的营养物 质,现在已经被卫生部批准加工成罐头、饮料等多种形 式的保健食品。 山茱萸的果肉中不仅含有大量营养物 质、水溶性皂苷,还有抗肿瘤作用明显的熊果酸等五环 三萜类物质1。 山茱萸中皂苷的提取方法有所报道, 但是系统的筛选同时分离、纯化皂苷和三萜酸类的研 究尚未见报道,笔者优选三种型号的大孔吸附树脂 HPD鄄300、AB鄄8、SA鄄2 型,从静态吸附和动态洗脱两个 方面筛选更合适的大孔吸附树脂,优化皂苷和三萜类 的分离、纯化方法。 大孔吸附树脂是 20 世纪 60 年代初开发出的一类 新型高分子分离材料,是一种大分子聚合物。 大孔吸 收稿日期摇 2008鄄09鄄18摇 摇 摇 修回日期摇 2008鄄12鄄17 基金项目摇 *中国医学科学院放射医学研究所发展基 金资助项目(基金编号:SF0717) 作者简介摇李欣孺(1980-),女,山东龙口人,硕士,从 事抗肿瘤中药化学研究工作。 电话:E鄄mail: ice_fire_polar163. com。 附树脂具有很好的吸附性能,它理化性质稳定,不溶于 酸、碱及有机溶媒,对有机物选择性较好,不受无机盐类 及强离子低分子化合物存在的影响,可以通过物理吸附 从水溶液中有选择地吸附有机物质。 大孔树脂是吸附 性和筛选性原理相结合的分离材料,基于此原理,有机 化合物根据吸附力的不同及相对分子质量的大小,在大 孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而分开。 大孔吸附树 脂技术现在已成为提取分离中草药中水溶性成分的一 种有效方法。 根据大孔吸附树脂中存在的极性基团的 极性强弱与有无分为非极性、中级性、极性、强极性四大 类,笔者选用的3 种型号树脂为非极性和中极性类型。 1摇 仪器与材料摇 EYELA 旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司);离 心沉淀机(上海医用分析仪器厂);DZF鄄6050 真空干燥 箱(河南巩义市英峪予华仪器厂);Beckman DU 800 Spectrophotometer;T6 新世纪紫外可见分光光度计(北 京普析通用仪器有限责任公司);Sartorius 万分之一分 析天平(德国赛多利斯公司);C3860A 超声清洗仪(天 767医药导报 2009 年 6 月第 28 卷第 6 期 津奥特赛恩斯仪器有限公司);紫外灯(上海顾村仪器 厂);实验用玻璃色谱柱(天津大学仪器开发实验室); 山茱萸购于天津安舜大药房,并经中国医学科学院放 射医学研究所天然药物化学教研室周则卫研究员鉴 定,符合中华人民共和国药典2005 年版一部要求及 其他相关标准;大孔吸附树脂:AB鄄8(南开化工厂); HPD鄄300(河北沧州宝恩化工有限公司);SA鄄2(天津欧 瑞生物科技有限公司);其他试剂均为国产分析纯。 2摇 方法与结果摇 2. 1摇 山茱萸总皂苷样品的制备与预实验摇 2. 1. 1摇 样品制备摇山茱萸的有效成分不仅包括水溶 性的皂苷,其脂溶性皂苷元及熊果酸也有较高的药理 活性,为了较全面地筛选其具有药理活性的有效部位, 综合考虑有效部位的化学性质,选用 900 mLL鄄1的乙 醇作为提取溶剂,这样水溶性皂苷的损失很小,同时也 能获得较多的脂溶性成分2,3。 取山茱萸药材 1 kg,8 倍量 90%的乙醇浸泡 4 h 后,回流提取 2 h,同样方法 再重复提取 2 次,合并滤液,旋转蒸发仪减压浓缩至无 醇味,常压 50 益干燥,最后称重得浸膏493 g。 收率为 49. 3%。 2. 1. 2摇 提取浸膏化学成分预实验及结果摇取浸膏适 量,溶于水后,过滤,沉淀用纯化水洗 3 次,干燥。 分别 进行化学成分预实验,结果见表 1。 从实验结果看,水 溶部分含有水溶性皂苷类、多糖类等成分,不含黄酮苷 及酚类物质,而醇溶部分含有脂溶性皂苷类成分。 表 1摇 山茱萸粗提物预实验结果摇 化合物种类实验方法水溶部分结果醇溶部分结果 黄酮(苷)盐酸鄄锌粉- 三氯化铝- 三萜醋苷鄄浓硫酸+ 三氯甲烷鄄浓硫酸-+ 醋酸铅实验+- 多糖(苷)琢鄄萘酚鄄硫酸实验+- 糖脎形成实验+- 多酚、鞣质三氯化铁实验- 明胶实验- 摇 摇 “-冶阴性反应,表示不含有该类成分;“+冶阳性反应,表示 含有或可能含有该类成分 2. 2摇 含量测定方法的建立摇鉴于目前尚无山茱萸皂 苷类成分的对照品,笔者选用结构与其苷元相近的熊 果酸作对照,用比色法计算总皂苷含量4。 标准曲线 绘制:精密称取干燥至恒重的熊果酸标准品 4. 0 mg, 用无水乙醇定容至 50 mL 量瓶中,即得0. 08 mgmL鄄1 的标准品溶液。 精密吸取熊果酸标准品溶液 0. 0, 0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6 mL 至 10 mL 具塞试管中, 水浴蒸干, 冷 却 后, 依 次 加 5% 的 香 草 醛鄄冰 醋 酸 0. 5 mL,高氯酸 0. 8 mL,60 益 水浴 10 min,取出置冰 水中冷却,再加冰醋酸 5 mL,摇匀后于 580 nm 波长下 测定吸光度(A 值)。 以熊果酸的量为横坐标,A 值为 纵坐标绘制标准曲线。 计算得标准曲线和相关系数。 Y=3. 829X+0. 003,r=0. 999 5(图 1)。 图 1摇 熊果酸标准曲线摇 2. 3摇 大孔吸附树脂的预处理摇由于大孔吸附树脂中 残留一些致孔剂、小分子聚合物、原料单体、防腐剂等 有毒物质,同时为了防止在应用过程中这些杂质干扰 样品的分离、鉴定及含量测定,所以要进行预处理,将 杂质用乙醇清洗掉。 将大孔吸附树脂 HPD鄄300、AB鄄 8、SA鄄2 用自来水冲洗 3 次,用无水乙醇浸泡过夜,弃 去浮在液面上的树脂5,6。 然后转移到色谱柱内 (32 cm伊2. 5 cm),用 90% 乙醇慢速回流洗脱,至洗脱 液澄清、蒸干后基本没有残留物,再用大量的纯化水洗 净树脂中的乙醇,湿态下贮存、备用。 2. 4摇 大孔吸附树脂型号的筛选研究摇 2. 4. 1摇 湿态树脂含水量测定摇由于洗好的树脂是在 湿态下保存,每种树脂含水量不同,而各种参数是以干 树脂的重量来对比的,因此为了实验的精确性,需要对 3 种湿态树脂进行含水量测定。 分别称取处理好的 3 种型号湿态树脂各 3. 5 g,红外线充分干燥后,再分别 称质量。 结果见表 2。 摇 摇 摇 摇表 2摇 树脂含水量测定结果摇g 树脂型号湿重干重含水量/ % HPD鄄3003. 501. 7051. 4 AB鄄83. 501. 7849. 1 SA鄄23. 501. 4558. 6 2. 4. 2摇样品液的制备摇称取 20. 0 g 提取浸膏于 250 mL锥形瓶内,加 200 mL 纯化水使充分溶解,再超 声溶解10 min,过滤,即得样品溶液。 沉淀贮存、备用。 2. 4. 3摇 静态吸附实验摇 称取三种湿态树脂各 3. 5 g, 置 50 mL 锥形瓶内,分别精密加入样品液 10 mL。 每 隔 10 min 振摇 20 s,持续 2 h。 静置 24 h 后,过滤,得 吸附后滤液。 过滤后的树脂另置 50 mL 锥形瓶中,精 密加入 50% 乙醇 10 mL,每隔 10 min 振摇 20 s,持续 867Herald of Medicine Vol郾 28 No郾 6 June 2009 2 h,过滤,得洗脱液。 2.4.3.1摇 总皂苷含量测定摇精密吸取上述操作过程中的 样品液、吸附后滤液、洗脱液各 1 mL,加入 25 mL 量瓶 内,纯化水定容至刻度,再精密吸取此溶液 0. 2 mL,按 “2. 2冶项下标准曲线绘制方法“至 10 mL 具塞试管中, 水浴蒸干冶测定总皂苷含量。 2.4. 3. 2 摇实验结果摇按下式计算静态饱和吸附量 (mgg-1干树脂)和静态洗脱率,结果见表 3。 静 态 饱 和 吸 附 量 ( mg g-1干 树 脂 ) = (初始浓度-吸附后浓度)伊吸附液体积 树脂量 静态洗脱率=洗脱液浓度伊洗脱液体积 饱和吸附量 伊100% 结果见表 3,可以看出 3 种树脂的吸附效果相差 不大,但 HPD鄄300 型树脂的饱和静态吸附量最大,其 他两种次之。 这说明和其他两种树脂相比,HPD鄄300 型大孔吸附树脂对山茱萸总皂有相对较好的吸附能 力。 表 3摇 静态吸附实验结果摇 树脂类型 样品液浓度/ (mgmL-1) 吸附后浓度/ (mgmL-1) 饱和吸附量/ (mgg-1) 洗脱量/ (mgg-1) 洗脱率/ % HPD鄄3002.600.6411.510.073.1 AB鄄82.600.8510.26.267.3 SA鄄22.600.8710.38.366.5 2. 4. 4摇 动态吸附实验摇 2.4.4.1摇 样品液制备摇称取山茱萸 90% 乙醇提取浸膏 各 150 g,用 150 mL 纯化水充分溶解后,超声 10 min, 过滤,收集滤液即得。 沉淀贮存、备用。 2.4.4.2摇 上柱与洗脱摇分别称取预处理好的湿态大孔吸 附树脂 HPD鄄300、AB鄄8、SA鄄2 各 30 g(相当于干树脂约 15 g),用纯化水湿法装入色谱柱(规格:25 cm伊2 cm, 带滤板)内,柱体积约 200 mL。 用 2 个柱体积量的纯 化水预洗柱子,待树脂沉积均匀,在树脂表面铺一片滤 纸( 起 缓 冲 洗 脱 溶 剂 的 作 用)。 用 加 样 漏 斗 以 1 mLmin鄄1的速度上柱,样品液加完后,静置 2 h,让 树脂充分吸附总皂苷。 过柱液再上柱吸附一次(流速 1 mLmin鄄1),然后放置过夜。 放置过夜的吸附柱用 1 倍柱体积的纯化水洗脱(流速1 mLmin鄄1),收集整个 吸附过程柱子的洗脱溶液(淤,过柱残余部分),减压 浓缩至约 50 mL。 用 3 倍柱体积量的纯化水洗脱,最 后洗脱液用苯酚鄄硫酸法检测不含多糖,收集洗脱液 (于,水洗脱部分),减压浓缩至约 50 mL。 为了防止溶 剂在更换过程中,由于极性相差太大而柱子内出现大 量气泡,先用 10% 的乙醇溶液 200 mL 洗脱,再换用 50%的乙醇 400 mL 洗脱,收集洗脱液(盂,醇洗脱部 分),减压浓缩至约 50 mL。 2.4.4. 3摇含量测定及实验结果摇取淤、于、盂部分各 1 mL,按“2. 4. 3. 1冶项下“加入 25 mL 量瓶中冶操 作,测定总皂苷含量。 按下式分别计算比上柱量、比吸附量和比洗脱量。 结果见表 4。 比上柱量(%)= 上柱量-过柱残余量 上柱量 伊100% 比吸附量(%)= 上柱量-过柱残余量-水洗脱量 上柱量 伊100% 比洗脱量(%)= 50%乙醇洗脱成分量 树脂量 伊100% 表 4摇 动态吸附实验结果 摇 树脂类型 上柱量/ mg 过柱残余 量/mg 水洗脱 量/mg 醇洗脱 量/mg 比上柱 量/% 比吸附 量/% 比洗脱量/ (mgg鄄1) HPD鄄300390113.2623.44225.3170.9665.1315.02 AB鄄8390157.4934.92153.7459.7451.0310.25 SA鄄2390192.1524.5897.1650.7744.626.48 摇 摇从以上动态吸附实验结果可以看出,HPD鄄300 型 吸附效果明显优于其他 2 种树脂。 综合静态与动态吸 附实验的图表分析结果,选用 HPD鄄300 型树脂进行以 下山茱萸总皂苷的系统分离与纯化实验。 2. 5摇 山茱萸总皂苷的系统分离与纯化摇 2. 5. 1摇 装柱与上样摇称取预处理的湿态 HPD鄄300 型 大孔吸附树脂 350 g, 用纯化水湿法装入色谱柱 (5 cm伊50 cm),树脂沉降稳定后,树脂表面加一小块 脱脂棉作缓冲。 称取 150 g 醇提浸膏,用 300 mL 纯化 水溶解,超声 10 min,用加样漏斗上样,速度约为 2 mLmin鄄1,放置吸附 2 h。 2.5. 2摇 梯度洗脱摇 用大量纯化水洗去糖、无机盐等水 溶性杂质,至水洗脱溶液苯酚鄄硫酸法检测呈阴性。 然 后依次用 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%, 80%,90%(V/ V)的乙醇进行洗脱。 各洗脱部位减压 浓缩,干燥。 按“2. 4. 3. 1冶项下操作测定含量。 计算 10 个洗脱部位中有效部位的总量,以乙醇洗脱浓度为 横坐标,以得到有效部位的总质量为纵坐标,绘制曲 线,见图 2。 图 2摇 不同浓度乙醇洗脱曲线摇 967医药导报 2009 年 6 月第 28 卷第 6 期 2.5. 3摇 水洗脱部位的纯化摇取湿态 HPD鄄300 型大孔 吸附树脂 100 g,用纯化水湿法装柱(3 cm伊40 cm)。 将水洗脱部位用少量水溶解充分,超声 10 min。 以 1 mLmin鄄1的速度上样,上完样后,吸附 2 h。 先纯化 水充分洗脱,苯酚鄄硫酸法检测结果阴性,再用 50% 的 乙醇充分洗脱,四醋酸铅检测不产生沉淀。 减压回收 溶剂,得进一步纯化的水溶部分总皂苷。 2.6摇 薄层色谱分析实验摇 分别用不同的展开剂对得到 的各个部位进行展开,其中只有水(淤)、50% 醇(于)、 60%和70%醇(盂)洗脱部位有明显的成分斑点7 9。 结果总结分析:淤:用 CHCl3CH3OH=6. 53. 5 (2 滴醋酐)展开,紫外灯下观察,显示 4 个斑点,50% 的硫酸鄄甲醇显色后,2 个斑点呈紫色,说明有 2 个皂 苷成分。 用 CHCl3CH3OHH2O=6. 53. 510 展 开,紫外灯下观察,显 5 个荧光斑点,硫酸鄄甲醇显色 后,相应斑点也呈紫色,其余显蓝黑色。 于、盂:用 CHCl3CH3OH=6. 53. 5(2 滴醋酐)展开,无斑点。 CHCl3CH3OH=502. 5 展开后,二者都只有一个斑 点,且 Rf 值相近,显色后出现 2 个淡紫色斑点。 说明 于和盂成分相同。 3摇 讨论摇 提取浸膏的预实验结果证实了“2. 1冶项下提取方 法的合理性,浸膏用水溶解出其中的水溶性皂苷,而得 到的沉淀中含有大量的皂苷元和熊果酸。 经过静态吸 附与动态吸附两种实验的综合评价,筛选出 HPD鄄300 型大孔吸附树脂分离、纯化总皂苷效果较好。 设计实验方面,预期利用一种大孔吸附树脂不仅 能纯化粗提物得到总皂苷,同时能得到苷元和三萜酸 有效部位。 即用水溶解 90% 乙醇提取浸膏,其中水不 溶性成分混悬于水溶液体系中,直接上大孔吸附树脂 色谱柱,这样固体就滞留在树脂柱层表面,而总皂苷则 吸附在树脂上,再用不同浓度的乙醇进行洗脱,得到 2 个有效部位。 但是,水洗脱部位呈粘稠状,经定性鉴 别、含量测定及薄层色谱展开,表明含有大量的皂苷, 且纯度没有变化;10% 40%乙醇洗脱部位为深褐色, 含量测定及定性鉴别表明,基本没有皂苷,说明主要是 色素类杂质;50% 70% 乙醇洗脱部位,基本不溶于 水,性状较好,呈淡黄色粉末,定性鉴别及薄层展开,说 明为皂苷元及三萜酸类成分。 80%,90% 乙醇洗脱部 位只有很少的有效成分,说明前面几个浓度的乙醇基 本把有效成分洗脱彻底。 分析结果认为,可能是由于 上样溶液中有大量