耐热α-淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌抗噬菌体的选育.pdf

耐热 - 淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌抗噬菌体的选育 张建 宁 ( 江苏食品职业技术学院, 江苏淮安223000) 摘要 目的 选育出耐热 - 淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌抗噬菌体菌株。 方法从耐热 - 淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌菌株HA06 的异 常发酵液中分离到了2 种噬菌体, 将其命名为KB 011、 KB 012。以枯草芽孢杆菌HA06 为出发菌株, 采用噬菌体、 紫外线和 M NNG 复合诱变 法选育具有抗性的高产突变株, 并对突变株的遗传稳定性和发酵的酶活力进行了考察。 结果 获得了3 株抗性株, 将其命名为K SB04、 K SB08、 K SB14 ,它们在试验浓度下对噬菌体KB 011、 KB 012 具有明显的抗性, 在整个培养过程中表现正常。而敏感菌株 HA06 的生长则受 到明显抑制, 并产生大量的噬菌体, 培养液中噬菌体的浓度最高可达1012p fu/ m l 以上。抗性株K SB 04 和 K SB14 有较好的遗传稳定性, 在 7 次传代后酶活力仍在3 500 U / m l 以上。 结论 获得了遗传稳定且发酵性能与出发菌相似的2 株抗性株 K SB04 和 K SB14 。 关键词 耐热 - 淀粉酶; 枯草芽孢杆菌; 抗噬菌体菌株; 发酵 中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611(2009)12 - 05372- 03 Breed in g o f Ph age -res istan t M u tan ts of Bacillus subtilis P rodu c ing Th erm ostab le -am y lase ZHANG J ian -n in g ( J iangsu F ood V ocational and T echn ical College , Hua ian , Jiangsu 223000) Abstrac t Objective The a i mw as to breed the phage-resistant m u tan ts w ith Bacillus subtilis HA06. M ethod T w o k inds phages w ere separa ted from the abnorm a l ferm en tation broth of Bacillus subtilis HA06,w h ich w as nam ed as KB 011 and KB012 .W ith Bacillus subtilis HA06 as an original strain,the w ork of B reed ing of P hage-resistan t M u tan ts w as done bythe com pound m u tagenesis m ethod w h ichthe tw o phages,u ltraviolet and M NNGasthe m u tagen s , and also the genetic stabilityof the m utant strains andtheirferm en tation en zym e activity w ereinvestigated . Result 3 h igh p roductive m u tan t strains w ith resistance w ere obtaind ,nam ed K SB04 ,KSB08 and K SB14,w h ich had obviou s resistance on phage KB011 and K B012 ,w h ile the strain HA06 w as inh ibited rem arkably bythe great generated phages w h ich cou ldreachabove 1012p fu/ m l at h ighest leve l inthe cultu re m ed ium.A lso ,the tw o resistant strains K SB 04 and K SB 14 hadthe be tter genetic stability,andtheir enzym e activity w as still at above 3500 U / m l after passage of 7 generations . Conclu sion T he 2re- sistan t strains K SB 04 and K SB14 w ith stable hered ity w ere obtained andtheirferm entation perform ance w as as sam e as that of the original strain. K ey words T herm ostable -am ylase ;Bacillus subtilis ;P hage- resistan t m u tan t ;Ferm en tation ? 作者 简介 张建 宁 ( 1967 -) , 女, 江苏 涟水人 , 硕士 , 讲师 , 从事 微 生物 菌种 选育与 发酵工 艺研 究。 收稿 日期 2009-02-09 枯草芽孢杆菌( Bacillus sub tilis) 分泌的 - 淀粉酶耐热性 较强, 在 - 淀粉酶酶制剂生产中使用较广。但该菌易受噬菌 体的污染而使生产受到影响。近几年, 江苏食品职业技术学 院生物工程系实训中心采用枯草芽孢杆菌菌种HA06 进行的 发酵生产, 其发酵周期短, 产酶率高, 但在2008 年夏秋季常出 现异常现象, 如酶活力下降、 发酵周期延长、 发酵产物提取困 难等。经双层平板法检测证实, 导致这些异常现象发生的主 要原因是噬菌体污染, 选育出抗噬菌体菌株是解决该污染问 题的有效措施之一, 为此, 笔者从枯草芽孢杆菌的异常发酵 液中分 离纯 化了 噬 菌体, 并 开 展了 抗 噬菌 体 菌 株的 选 育 工作。 1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌株和噬菌体。 1.1.1.1 出发 菌株。枯草芽 孢杆菌( Bacillu s sub tilis) 菌 种 HA06 , 江苏 食品 职业 技 术学 院生 物工 程 系微 生 物实 验 室 保存。 1.1.1.2 噬菌体。噬菌体KB011 、 KB 012 , 从江苏食品职业技 术学院生物工程系实训中心枯草芽孢杆菌 HA06 的异常发酵 液中分离获得, 由江苏食品职业技术学院生物工程系微生物 实验室保存。 1.1.2 培养基。 1.1.2.1 肉汤培养基。牛肉膏0 .5 % 、 蛋白胨1 .0% 、 可溶性 淀粉2 .0 % 、 N aC l 0 .5 % 、 酵母膏0 .1 % ,pH 值7.0, 加入琼脂 2 .0% 则为固体培 养基。该 培养基用于细 菌和噬菌体的 保 藏、 扩增及活化等。 1.1.2.2 双 层 琼 脂 培 养 基。可 溶 性 淀 粉 1.0% 、 蛋 白 胨 1 .0% 、 葡萄 糖0 .5% 、 N aC l 0.5 % 、 牛肉 膏0 .5% 、 底层 琼 脂 1 .8% 、 上层琼脂0 .6 % ,pH 值7.0。该培养基用于噬菌体的 分离纯化及菌株对噬菌体的抗性检测。 1.1.2.3 种 子 培 养 基。牛 肉 膏 0 .5 % 、 蛋 白 胨 1% 、 N aC l 0 .5% 、 可溶性淀粉2.0% 、 酵母膏0.1% ,pH 值7.0。在250 m l 三角瓶中的装量为25 m l 。该培养基用于菌株的复筛、 种子 的扩大培养及噬菌体原液的制备。 1.1.2.4 发酵培养基。玉米粉2.0 % 、 黄豆饼粉1 .5% 、 C aC l2 0 .02 % 、 M gSO40.02% 、 N aC l 0.25% 、 K2HPO40.2% 、 柠檬酸钠 0 .2% 、 硫酸铵0.075%( 溶解后加) 、 N a2HPO40.2 % 、 pH 值7.0 。 该培养基用于摇瓶发酵培养, 在250 m l 三角瓶中的装量为25 m l , 在50 L 发酵罐中装量30 L。 1.1.2.5 蛋白胨液。蛋白胨1.0% ,pH 值7.0。该液用于出 发菌株菌悬液的制备和噬菌体原液稀释, 用来对出发菌株诱 变; 用于抗性变株培养液的稀释, 以利于抗性变株分离纯化 和筛选。 1.2 试验方法 1.2.1 噬菌体的分离纯化及原液制备。取异常发酵液离心 (2 400r/ m in,15 m in) , 上清液经微孔滤膜(0.45 m ) 除菌, 即 得含有噬菌体的样液, 然后在双层琼脂平板上进行噬菌体的 分离。用接种针穿刺特定的噬菌斑, 然后将接种针上的噬菌 体移入无菌水中并适当稀释, 再在双层琼脂平板上对其进行 纯化, 将纯化后的噬菌体加入已接菌的种子培养基中进行增 殖培养, 即可得到噬菌体原液1。 1.2.2 抗噬菌体菌株的选育方法。 1.2.2.1 枯草芽孢杆菌 HA 06( 出发菌株 ) 的诱变。出发菌株 的菌悬 液 采用 噬 菌体、 紫 外 线、 M NNG 复合 诱 变法1进 行 诱变。 1.2.2.2 变株的初筛与复筛。对获得的生长状况与出发菌 安徽农业科学,Jou rn al o f Anhu i Agri . Sci .2009,37(12) :5372- 5374 责任编辑 罗芸 责任校对 况玲玲 株相近抗性的变株进行产酶能力的初检、 初筛, 初筛获得的 变株斜面保藏并编号, 并对初筛的变株进行复筛, 从中选出 产酶能力高的变株2 3 株。 1.2.2.3 变株性能的考察。将3 个变株分别接入混有噬菌 体原液的种子培养基、 发酵培养基进行抗性能力、 生长状况、 产酶能力及其稳定性的测定, 最后获得既具有稳定抗性又具 高产酶能力的变株作为目的菌株。 1.2.3 种液的制备。无菌条件下, 取出发菌株与筛选得出 的抗性变株试管斜面1 环菌苔接种于混有噬菌体原液(2 种 噬菌体原液各0.1 m l ,1010pfu/ m l)0 .2 m l 或不混有噬菌体原 液的种子培养基中, 放入种子摇床机,37 、 250r/ m in 下培养 24 36 h。 1.2.4 项目测定。 1.2.4.1 种液中菌体生长量( OD 值) 的测定。取复筛得的 变株与出发菌株种子液, 用蒸馏水稀释种液20 倍, 以未接种 的蒸馏水稀释20 倍的种子培养基作空白, 用721 分光光度计 测定种液在600 nm 处的光密度, 比色杯的光程为1 cm。 1.2.4.2 淀粉酶活力测定。 (1) 菌株产淀粉酶活性的初检。划线分离抗性菌株于肉 汤琼脂培养基平皿上,37 培养2 4 d , 采用碘液染色, 在菌 落周围有透明圈产生, 证明该菌株产淀粉酶。用游标卡尺分 别测量透明圈直径和菌落直径, 根据两者比值大小初步确定 酶活性的高低。取水解圈 D/ d 与出发菌株相近者20 30 株 于筛选平板上划线分离至纯种, 编号并用斜面保存。 (2) 粗酶液制备。摇 瓶复筛 粗酶液 制备。无菌条 件 下, 取初筛得的变株斜面菌种1 环菌苔接种于种子培 养基 中, 放入种子摇床机,37 、250 r/ m in 下培养2024 h。离心 (4 000 r/ m in ,20 m in) 、 收集上清液即为待测粗酶液。种子 液、 摇瓶发酵液与发酵罐发酵液粗酶液制备。无菌条件下, 种子液分别以3 % 接种量接种于不混有和混有加入0.2 m l 噬 菌体原液 (2 种噬菌体原液各0.1 m l ,1010p fu/ m l) 发酵培养基 中摇床培养,37 、 250 r/m in 下培养42 48 h, 离心( 4 000 r/ m in,20 m in) , 收集上清液即为摇瓶发酵液待测粗酶液。将 不混有噬菌体原液制备的种子液500 m l , 接入装罐量为30 L 的50 L 全自动发酵罐,37 培养38 42 h 。发酵12 h 后补 加碳 酸钙 使 整 个 发 酵 过 程 中 碳 酸 钙 的 含 量 大 约 保 持 在 0 .02 % 。离心(4 000 r/ m in,20 m in) , 收集上清液即为待测粗 酶液。 (3) - 淀粉酶活力测定。方法见文献2 。 1.2.4.3 噬菌体效价的测定。采用双层琼脂平板法。 2 结果与分析 2.1 噬 菌体 的分 离 纯化 和 原 液制 备 从 枯 草 芽孢 杆 菌 HA06 的异常发酵液中分离纯化获得了2 种噬菌体, 将其命 名为 KB011 、 KB 012, 它们产生2 种形态不同的噬菌斑。KB 011 的噬菌斑为透明的边缘清晰的圆形噬菌斑, 直径约2 .3 mm, KB 012 的噬菌斑为半透明的边缘不清的圆形噬菌斑, 直径约 1 .9 m m。将它们分别加入已接出发菌的种子培养基中进行 增殖培养, 制备得到效价达1010p fu/ m l 以上的噬菌体原液。 2.2 抗噬菌体菌株的选育 以枯草芽孢杆菌 HA06 为出发 菌株经2 种噬菌体、 紫外线、 M NNG 复合诱变法1诱变获得了 24 株对噬菌体KB 011、 KB 012 具有抗性的变异菌株, 挑选出生 长状况、 产酶能力与出发菌株相近的菌株18 株。这些菌株 在双层琼脂培养基平皿的产酶能力见表1。 表1 菌落及染色圈直径 T ab le 1 Co lon ie s an dsta in in g cy c le d iam e ter 菌种编号 S train num ber 菌落直径m m Co lon y d iam ete r 透明水解圈 直径m m T ran spa ren t hyd ro lysis cycle d iam e ter 水解圈直径 / 菌落直径 H yd ro lysis cycle d ia- m eter/co lon y d iam eter 菌种编号 S tra in num ber 菌落直径m m Co lon y d iam ete r 透明水解圈 直径m m T ran spa ren t hyd ro lysis cycle d iam e ter 水解圈直径/ 菌落直径 H yd rolysis cycle d ia- m e ter/ colony d iam e ter HA 0614.11 0.04922.03 0.790 1.57 0.052 1K SB 09+ P 13.35 0.241 22.09 1.2241.66 0.641 K SB 01+P15.41 0.28421.75 0.8951.42 0.036 4K SB 09+ P 13.35 0.24122.09 1.2241.66 0.641 K SB 02+P14.48 1.23021.35 0.8861.49 0.031 1K SB 10+ P 15.27 0.32124.05 0.3651.58 0.421 K SB 03+P13.32 0.29221.01 0.8321.58 0.614 8K SB 11+ P 14.29 0.21021.24 0.6511.49 0.547 K SB 04+P15.70 0.33123.64 0.7992.09 0.056 0K SB 12+ P 15.78 0.41024.42 0.2101.56 0.021 K SB 05+P12.01 0.48320.54 0.2601.73 0.012 0K SB 13+ P 14.28 0.53125.03 0.0921.67 0.351 K SB 06+P14.05 0.53827.48 0.7271.97 0.024 0K SB 14+ P 12.80 0.54126.13 0.2382.06 0.614 K SB 07+P16.06 0.83122.95 1.9551.44 0.214 0K SB 15+ P 12.18 0.29223.96 0.3211.98 0.368 K SB 08+P12.70 0.84128.39 0.9112.27 0.391 0K SB 16+ P 13.79 0.84128.01 1.232.03 0.614 注: + P 表示在 培养基中加入噬菌体 。下表同。 N o te : + Pindicates phage addedin to m ed ium.The sam e as follow s . 随后对18 株抗性突变高产变异株进行复筛, 获得了3 株高产变异抗株 KSB 04、 KSB 08 、 KSB 14 , 这些抗株在噬菌体存 在的条件下产酶水平达到或超过菌株 HA06 的正常产酶水平 ( 表2) 。 2.3 抗性菌株抗噬菌体能力的检测 定时测定混有噬菌体 原液种子液的菌体生长量和噬菌体效价, 结果表明( 图1、 2) , 所得 的抗 株 KSB 04、 KSB 08、 KSB 14 对 试验 浓度 下 的噬 菌 体 KB 011、 KB 012 具有明 显的抗性, 在整 个培养 过程中 表现 正 常。而敏感菌株 HA06 的生长则受到明显抑制, 并产生大量 的噬菌体, 培养液中噬菌体的浓度最高可达1012p fu/ m l 以上。 2.4 抗噬菌体菌株 的遗传稳定性 在噬菌体存在的 条件 下, 通过摇瓶种子培养和发酵试验, 考察7 次传代后抗株的 种液 OD 值及发酵产酶能力, 结果表明( 表3) , 抗株 KSB08 在 种子 培 养 及发 酵 中出 现 异 常现 象, 遗 传 稳定 性 差。菌 株 KSB 04、 KSB 14 有较好的遗传稳定性, 在7 次传代后酶活力仍 在3 500 U/ m l 以上, 镜检也未发现异常情况, 因此确定选择 KSB 04、 KSB14 作为目的菌株进行斜面保存。 373537 卷12 期 张建宁 耐热 - 淀粉酶产生菌枯草芽孢杆菌抗噬菌体的选育 表2 抗噬菌体菌株的选育结果 T ab le 2 Bree d in g re su lts o f ph age -re s is tin gstra in 菌株 S train s 种子液 OD 值 ODvalu e o f seedliqu id 发酵液淀粉酶活力U / m l Am ylase activ ities of ferm en ta tionliqu id HA 060.822 12381 K SB 06+P0.274 1479 K SB 040.782 32103 K SB 04+P0.785 62091 K SB 080.810 72390 K SB 08+P0.840 33106 K SB 140.810 61971 K SB 14+P0.793 12209 图1 抗性菌株抗噬菌体能力的检测 F ig.1 de te c tion onph age -re s istin g ab ilityo f re s is tan t s tra in s 表3 抗噬菌体菌株的遗传稳定性 T ab le 3 G en e ticstab ilityo f ph age -re s is tin gstra in 菌株 S train s 传代次数 N um be r of gene ration 种液 OD 值 ODvalue of seedliqu id 发酵液淀粉酶活力U / m l Am ylase activ ities o f ferm en tationliqu id HA 0610.80233 694 30.80123 701 50.81313 682 70.82013 717 HA 06+ P10.2803583 30.2157549 50.2207538 70.2154567 K SB 0410.74913 797 30.77463 665 50.78513 509 70.77463 617 K SB 04+P10.80513 512 30.78383 694 50.81013 671 70.79363 846 K SB 0810.83193 911 30.61072 405 50.5816967 70.42101 109 K SB 08+P10.88123 842 30.70012 307 50.48201 157 70.5127948 K SB 1410.79163 711 30.78373 664 50.80613 713 70.74823 703 K SB 14+P10.81313 671 30.80113 598 50.78013 604 70.80193 806 2.5 抗株的发酵生产性试验 在生产环境中噬菌体大量存 在的情况下, 使用抗株KSB 04 、 KSB 14 及敏感株 HA06 , 按以前 报道的3发酵条件, 在50 L 的发酵罐上各进行了连续3 批次 的发酵试验( 表4) 。由表4 可知, 在发酵过程中, 抗株KSB 04 、 KSB 14 与敏感株 HA06 的正常发酵大致相同, 未发现受噬菌 体污染的迹象, 而 HA 06 的发酵有2 批次出现异常, 发酵周期 明显延长, 经检测为受噬菌体污染所致; 从产酶能力上看, 抗 株KSB04 、 KSB 14 与未受噬菌体污染的敏感株 HA06 基 本相 当, 而受噬菌体污染的HA06 的酶活力通常要降低30% 以上。 从遗传稳定性来看, 经多次传代的菌株 KSB04 和KSB 14 在对 噬菌体的抗性及产酶能力上没有变化。 图2 抗性菌株抗噬菌体能力的检测 F ig.2 de te c tion onph age -re s istin g ab ilityof re s is tan t s tra in s 表4 抗噬菌体菌株的发酵生产性试验 T ab le 4 P rodu c tivete s t onfer