微乳闪式提取丹参脂溶性成分研究.pdf

收稿日期 20100628( 006) 基金项目 “ 重大新药创制” 科技重大专项( 2009ZX09301) 、 ( 2009ZX09308) ; 中国中医科学院自主选题项目 ( Z02094) 第一作者 任彦飞， 硕士研究生， 中药新剂型的应用研究， E- mail: r1105 126. com 通讯作者 * 杨华， 研究员， 中药新剂型研究与开发， Tel: 010- 84017310， E-mail: yanghua2796 sina. com 微乳闪式提取丹参脂溶性成分研究 任彦飞， 易红， 高进， 杨华 * ( 中国中医科学院中药研究所， 北京100700) 摘要 目的: 探讨微乳技术与闪式提取结合应用于丹参脂溶性成分提取的适用性。方法: 以丹参酮A的提取率作为 丹参脂溶性成分的指标， 分别比较不同提取方式和不同溶剂对丹参中丹参酮A提取率的影响; 采用正交设计， 对丹参微乳闪 式提取工艺的影响因素进行考察。结果: 以微乳为溶剂， 闪式提取可在数分钟内提取出丹参中 80% 90% 的丹参酮A; 工艺 条件中提取次数和微乳的稀释倍数对丹参酮A的提取率有非常显著影响。结论: 微乳技术结合闪式提取应用于中药丹参有 效成分的提取具有高效、 快速的特点， 应用前景良好。 关键词 闪式提取; 微乳; 丹参; 丹参酮A 中图分类号 R283. 6 文献标识码 A 文章编号 1005- 9903( 2011) 02- 0015- 04 Study on Application of Smashing Tissue Extraction in Extracting Fat- Soluble Compounds of Salvia Miltiorrhiza by Microemulsion REN Yan-fei， YI Hong， GAOJin， YANG Hua* ( Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Traditional Medical Sciences， Beijing 100700， China) Abstract Objective: To study the feasibility of extracting salvia miltiorrhiza by smashing tissue extraction and microemulsion technology. Method: To measure the content of tanshinon Ain salvia miltiorrhiza microemulsion extracting solution by HPLC. Making microemulsion as a solvent to extract salvia miltiorrhiza by smashing tissue ex- traction， heating countercurrent extraction， ultrasonic extraction and compare the extraction rate of tanshinonA. U- sing orthogonal design to analyze on effect factors of the smashing tissue extraction. Result: The extraction rate of tanshinon Ais 80% 90% by smashing tissue extraction and microemulsion technology. Extraction frequency and microemulsion dilution multiple of smashing tissue extraction have very significant impact on the extraction rate of tanshinon A. Conclusion: Combination smashing tissue extraction with microemulsion technology to extract the ac- tive compounds of salvia miltiorrhiza has efficient and fast characteristics and better application prospect. Key words smashing tissue extraction; microemulsion; salvia miltiorrhiza; tanshinon A 闪式提取技术是一种利用闪式提取器对于植物 软、 硬材料快速提取的新型提取技术。可在室温及 溶剂存在下数秒钟内将植物的根、 茎、 叶、 花、 果实等 物料， 经高速粉碎至细微颗粒， 使药材内外化学成分 在高速搅拌、 振动及局部负压渗透等综合外力作用 下迅速达到平衡， 通过过滤达到提取目的 1。有文 献报道 2将闪式提取用于水提取丹参时， 丹参中水 溶性成分丹酚酸 B 的提取率高于回流法， 说明闪式 提取技术具有提取时间短、 温度低、 效率高的特点。 微乳是由油相、 表面活性剂、 助表面活性剂和水 在适当比例下， 自发形成的一种透明或半透明、 热力 学稳 定 的 溶 剂 体 系。 微 乳 的 粒 度 较 小 ( 10 100 nm) ， 具有可增溶不同溶解性能药物成分的特 点， 作者曾利用微乳的这个特性， 将微乳作为溶剂， 51 第 17 卷第 2 期 2011 年 1 月 中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 17， No. 2 Jan. ， 2011 采用加热回流法提取丹参， 结果证明用微乳提取可 以增加丹参中脂溶性成分丹参酮A的提取率， 同 时不影响水溶性成分丹酚酸 B 的溶出 3。本研究 以微乳为溶剂， 采用闪式提取技术进行丹参微乳提 取试验， 比较不同提取方式和不同溶剂对丹参中脂 溶性成分丹参酮A提取率的影响， 考察工艺条件 的主要影响因素， 旨在将微乳与闪式提取的优势相 结合， 在达到快速、 高效的同时实现对丹参脂溶性成 分和水溶性成分的同步提取， 从而获得更优化的提 取工艺。 1仪器与试药 闪式提取器 JHBE- 20A( 河南金鼐科技发展有限 公司) ; 电子天平( BSA224S-CW 赛多利斯科学仪器 有限公司) ; Waters1515- 717 自动进样液相色谱仪， 2487 检测器， Empower2 数据处理系统。 丹参粗粉( 饮片购于北京卫仁饮片厂， 产地四 川， 粉碎过 20 目筛) ; 丹参酮A( 中国药品生物制品 检定所， 批号 110766- 200417) ; 辛癸酸三甘酯( MCT， 浙江建德市千岛精细化工实业有限公司) ， 聚氧乙烯 ( 35) 蓖麻油 ( EL- 35 巴斯夫公司) ; 甲醇 ( 色谱纯， Fisherscientific， +H142A452426 ) ;无 水 乙 醇 ( 20021213， 分析纯， 北京化工厂) ; 纯净水( 娃哈哈 饮用纯净水， 20090224) 。 2方法与结果 2. 1丹参粗粉中丹参酮A的含量测定 4称取 丹参粗粉 0. 3 g， 按照中国药典 ( 一部) 2005 年版 丹参项下丹参酮A方法测定， 结果试验所用丹参 样品中丹参酮A的质量分数为 0. 20% 。 2. 2丹参提取液中丹参酮A的含量测定方法 5 色谱 条 件DiamonsiL C18( 2) 色谱柱 ( 4. 6 mm 250 mm， 5 m) ; 流动相甲醇-水( 80 20) ; 流速 1 mL min 1， 检测波长 270 nm， 柱温 35 。 对照品溶液的制备精密称取丹参酮A对照 品 10 mg， 置 50 mL 棕色量瓶中， 加甲醇至刻度， 摇 匀， 即 得 对 照 品 溶 液 (每 mL 含 丹 参 酮 A 204. 6 g) ; 精密量取对照品溶液1 mL， 置 25 mL 棕色量瓶中， 加甲醇至刻度， 摇匀， 即得对照品溶液 ( 每 mL 含丹参酮A8. 184 g) 。 线性关系考察精密吸取丹参酮A对照品溶 液， 加甲醇配制成 2. 046， 4. 092， 8. 184， 12. 276， 16. 368 mg L 1的丹参酮 A溶液， 按照上述色谱条 件测定。以峰面积为纵坐标， 进样量( ng) 为横坐标， 得线性回归方程为 Y = 5 587X 8 871; r = 0. 999 9。 表明进样量在 40. 92 327. 36 ng 峰面积呈良好线性 关系。 供试品的制备精密量取微乳提取液 1 mL， 置 10 mL 量瓶中， 加甲醇至刻度， 摇匀， 0. 45 m 滤膜 滤过， 取续滤液， 分别即得。 测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品 溶液各 20 L， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。 2. 3微乳液的制备取 MCT、 EL- 35、 无水乙醇适量 搅拌至均匀， 边搅拌边加水至全量， 混匀， 制成略带 有蓝色乳光的澄清微乳液， 为微乳原液。取微乳原 液分别加水稀释 10 倍、 20 倍， 即得微乳 10 倍、 20 倍 稀释液。 2. 4不同提取方法对微乳提取丹参中丹参酮A 提取率的影响以微乳 10 倍稀释液为溶剂， 分别采 用闪式提取、 回流提取、 超声提取等 3 种方式对丹参 进行提取， 比较不同提取方法对微乳提取丹参中丹 参酮A提取率的影响。 闪式提取: 取丹参粗粉 8 g， 精密称定， 置锥形瓶 中， 加入 80 mL 溶剂闪式提取 3 次， 每次 2 min， ( 每 次提取保持电压表指数为 100 V) 。合并提取液， 滤 过， 即得闪式提取液。 回流提取: 取丹参粗粉 8g， 精密称定， 置圆底烧 瓶中， 加入 80 mL 溶剂回流提取 3 次， 每次 1 h， 合并 提取液， 滤过， 得回流提取液。 超声提取: 取丹参粗粉 8 g， 精密称定， 置锥形瓶 中， 加 入 80 mL 溶剂超 声提取 3 次 ( 45 KHz， 500 W) ， 每次 0. 5 h， 合并提取液， 滤过， 得超声提取液。 取上述 3 种抽取液， HPLC 测定丹参酮A含 量， 计算提取率。另取提取液适量， 水浴蒸干， 105 烘干 3 h， 放冷后称重， 计算出膏率。结果见表 1。 表 1不同方法微乳提取丹参中丹参酮 A的提取率 ( n = 3) 提取 方法 加热 提取总时间 /min 出膏率1) /% 丹参酮A提 取率2)/% 闪式否644. 9284. 04 回流是18045. 4184. 02 超声否9044. 1068. 85 注: 1)微乳提取液的出膏率为减去辅料的加入量计算得出，2)以 丹参饮片中含丹参酮A0. 20% 为 100% 计算提取率。 表 1 结果可见， 采用微乳提取丹参， 闪式提取与 回流提取的丹参酮A提取率相似， 但闪式提取不 需加热， 提取时间仅 6 min， 远低于回流提取 3 h。超 61 第 17 卷第 2 期 2011 年 1 月 中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae Vol. 17， No. 2 Jan. ， 2011 声提取的丹参酮A提取率较低。3 种方式的出膏 率相似， 基本不受提取方式的影响。 2. 5闪式提取中不同提取溶剂对丹参酮A提取 率的影响分别以表 2 中溶剂闪式提取， 测定丹参 酮A的提取率和出膏率。结果见表 2。 表 2不同溶剂闪式提取丹参中丹参酮 A的提取率( n = 3) 提取溶剂出膏率 /% 丹参酮A/% 微乳( 稀释 10 倍)44. 9284. 04 95% 乙醇 10. 6391. 97 50% 乙醇 40. 9744. 25 胶体溶液( EL- 35 水溶液)38. 3951. 50 水44. 287. 89 由表 2 结果可见: 由于丹参酮A的脂溶性较 强， 以 95% 乙醇闪式提取的提取率最高( 91. 97% ) ， 水的提取率最低( 7. 89% ) 。微乳闪式提取的提取率 达到 84% 以上， 与 95% 乙醇提取率相差不多， 优于 50% 乙醇( 44. 25% ) 和胶体溶液( 51. 5% ) ， 说明微 乳体系作为溶剂采用闪式提取可以提高丹参药材脂 溶性成分的提取率。同时微乳提取的出膏率与水基 本相同， 说明水溶性成分也同时提取出来。胶体溶 液中表面活性剂的种类与用量与微乳相同， 但丹参 酮A的提取率比微乳相差较多， 说明微乳对脂溶 性成分的增溶作用并不是单纯的表面活性剂的作 用， 也进一步说明微乳闪提丹参具有明显优势。 2. 6微乳闪式提取丹参中脂溶性成分的影响因素 在前期微乳提取丹参的试验中发现， 微乳用量可 显著影响丹参酮A的提取效率， 因此将微乳稀释 倍数列为考察因素; 文献记载 6影响闪式提取的因 素主要是溶剂、 提取次数、 提取时间、 固液比等， 本试 验将固液比设为 1 10， 采用 L9( 34) 正交表进行试 验， 以丹参酮A含量为指标， 考察以下因素对微乳 液闪式提取丹参的影响。因素水平表见表 3。正交 试验结果见表 4， 丹参酮A提取率的方差分析见表 5。 表 3微乳闪式提取工艺因素水平 水平 A 微乳稀释倍数 B 提取时间 /min C 提取次数 /次 1原液11 21022 32033 表 4丹参微乳液闪式提取正交试验结果 % No.ABCD丹参酮A提取率 1111156. 00 2122295. 51 3133394. 36 4212358. 29 5223184. 00 6231228. 75 7313269. 75 8321321. 47 9332146. 44 K1 245. 87184. 04106. 22186. 44 K2 171. 04200. 98200. 24194. 01 K3 137. 66169. 55248. 11174. 12 R108. 2131. 43141. 8919. 89 表 5丹参酮A提取率的方差分析 方差来源SSfMSFP A2 047. 021 023. 530. 5 0. 05 B165. 0282. 52. 5 C3 473. 821 763. 951. 7 0. 05 误差( D)67. 22 33. 6 注: F0. 05( 2， 2)= 19. 00。 由表 4， 5 可知， C 因素( 提取次数) 和 A 因素( 微 乳稀释倍数) 对结果有极显著性影响; B 因素( 提取 时间) 对结果无显著性影响。即: 微乳稀释倍数越 小， 丹参酮A提取率越高; 提取次数在 2 次以上较 好。如果使用微乳原液提取 2 次， 丹参酮A的提 取率则与用 95% 乙醇提取率持平。 3讨论 试验结果证明， 以微乳为溶剂采用闪式提取器 提取丹参 6 min， 丹参酮A的提取率可达到 80 90% 左 右。根 据 文 献 记 载 和 作 者 以 往 的 研 究 结 果 2- 3， 丹酚酸 B 的提取率也可达到 80% 以上。此 方法具有提取率高， 提取时间短， 保护热敏成分、 节 约能源等优点， 为微乳提取丹参提供了一种新方法。 微乳液闪式提取丹参的影响因素试验数据表明 微乳浓度越高， 丹参酮A提取量越大， 当使用微乳 原液时， 提取 2 次， 共用 4 min， 丹参酮A提取量可 达到 95% 以上。这是由于丹参酮A的脂溶性较 强， 对微乳的稀释倍数比较敏感。这个规律与微乳 回流提取法结果一致， 是由微乳的特性所决定的。 ( 下转第 20 页) 71 任彦飞， 等: 微乳闪式提取丹参脂溶性成分研究 表 2药对共煎液含量测定结果( n =2) mg L 1 黄连 厚朴和厚朴酚厚朴酚总含量 3 111. 512. 524. 0 2 17. 87. 315. 1 1 113. 122. 335. 4 1 212. 320. 034. 3 1 315. 412. 227. 6 1 58. 010. 318. 3 图 2药对煎煮液中和厚朴酚、 厚朴酚及二者总含量 在 1 1时含量最大， 和厚朴酚在 1 3时含量最大， 将 两者加起来得到的总含量在 1 1时最高， 2 1时最 低。说明黄连中的生物碱成分对酸性的和厚朴酚及 厚朴酚的溶出存在一定程度的影响。 3讨论 目前对酸碱药对研究最多的是四逆汤中的附子 与甘草， 研究表明附子与甘草配伍能降低附子毒性， 附子所含毒性成分乌头生物碱能随甘草剂量的增加 而降低 4。本试验表明， 黄连、 厚朴不同配伍比例对 厚朴酚类成分的溶出存在影响， 至于对小檗碱类成 分的影响有待进一步的深入研究。本研究的结果提 示我们酸碱药对的使用应充分考虑到酸、 碱成分的 互相影响， 找到最佳的配伍比例， 以达到各有效成分 获得最大的溶出