应用代谢通量法分析花生四烯酸的合成过程.pdf

第 2 l卷第 2期 2 0 0 7 年 4月 高校化学工程学报 J o u r na l of Ch e mi c a l En g i n e e r i n g o f Ch i n e s e Un i v e r s i t i e s No2 ) 1 2l Ap r 2 0 07 文章编号 ：1 0 0 3 9 0 1 5 ( 2 0 0 7 ) 0 2 0 3 1 6 0 6 应用代谢通量法分析花生四烯酸的合成过程 金明杰， 黄和， 张昆， 闫婕， 高振 ( 南京工业大学 制药与生命科学学院， 江苏 南京 2 1 0 0 0 9 ) 摘 要：代谢通量分布分析 已经成为研 究发酵过程特性的有效方法。今建立了花生四烯酸( 从 ) 在高山被孢霉 ME 一 1 ( Mo r t i e r e l l a a lp i n a ME - 1 ) 体内合成的代谢通量模型， 求解不同氮源浓度下发酵各时期的碳流分布。充足氮源发酵 时，指数生长期、减速期、稳定期流向A A的碳流分别占总碳流的 3 2 8 ，8 8 0 ，6 9 7 。而通过限制性氮源发酵并 在 9 6 h 补加 0 0 5 的N a N O 3 成功地引导了发酵碳流迁移，将各时期流向A A的碳流提高至 3 9 5 ，1 9 2 1 ，3 9 2 9 ， 并最终实现 A A产量从 l _ 3 g L 提高到 3 5 g L 一。这些结果表明限制性氮源发酵并在稳定期补加低浓度的氮源能显著 提高 A A产量 。 关键词：代谢通量分析；花生四烯酸；高山被孢霉；发酵；合成 中图分类号：T Q9 2 0 1 ；Q5 9 1 9 文献标 识码 ：A M e t a bo l i c Fl ux Ana l y s i s o n Ar a c hi do n i c Ac i d Fe r me nt a t i o n J I N Mi n g - j i e ， H U A N G H e ， Z H A NG K u n ， Y A N J i e ， G AO Z h e n ( C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e a n d P h a r m a ceu t i c a l E n g i n e e r in g ， Na n j in g U n i v e r s i t y o f T e c h n o l o g y , Na n j in g 2 1 0 0 0 9 ， C h in a ) Ab s t r a c t ： An a l y s i s o f flu x di s t r i b u t i on s i n me t a b o l i c n e t wo r k s h a s b e c o me an i mp o r t an t a p p r o a c h f o r u n d e r s t an di n g t h e f e r me n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e p r o c e s s A mo d e l o f me t a b o l i c flu x an alys i s o f ara c hi d o n i c a c i d( AA )s y n t h e s i s i n Mo r t i e r e l l a a lpi n a ME l Was e s t a b l i s h e d and c arb o n fl u x d i s t r i b u t i o n s we r e e s t i ma t e d i n d i f lf e r e n t f e r me n t a t i o n p h ase s wi t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i on s o f N s o u r c e Du r i n g e x p o n e n t i a1d e c e l e r a t i n g an d s t a t i o n a r y p h as e ，c arb on f l u x e s t o AA are 3 2 8 ，8 8 0 ，6 9 7 ，r e s p e c t i v e l y ,wi t h S U f f i c i e n t N s o u r c e b r o t h b ase d o n t h e flu x o f g l u c o s e u p t a k e ，a n d t h o s e a r e i n c r e a s e d t o 3 9 5 ，l 9 2l an d 3 9 2 9 ，r e s p e c t i v e l y ,b y r e g u l a t i n g t h e s h i fts o f c arb on flu x e s vi a f e r me n t a t i o n wi t h l i mi t e d N s o u r c e b r o t h an d a d d i n g O 0 5 Na NO3 a t 96 hE ve n t u a l l y AA y i e l d i n c r e a s e d f r o m 1 3 g L t O 3 5 g - L Th e s e r e s u l t s s u g g e s t a wa y t o i mp r o v e AA f e r me n t ati o n ，t h at i S ，f e r me n t ati o n wi t h l i mi t e d N s ou r c e b r o t h a n d a d d i n g l ow c o n c e n t r a t i on N s ou r c e d u r i n g s t ati on a r y p h ase Ke y wo r ds ： me t a b o l i c flu x an aly s i s ； ara c h i d o ni c a c i d； Mo r t i e r e l l a a l pi n a ； f e r me n t ati o n ； s y n t h e s i s l 前 言 花生四烯酸( A r a c h i d o n i c Ac i d ，简称 A A，即 5 ， 8 ， 1 1 ， 1 4 二十碳四烯酸) 属于 ( i) 6系列长链多不饱和脂 肪酸，具有多种生理活性，因此具有广泛的应用【 ” 。围绕微生物发酵法生产 A A，国内外开展了多方面的 工作，主要集中在培养基的优化【 、菌种的筛选【 。 和关键酶 的研究，取得了一定的成果，但对于多不饱 和脂肪酸在总油脂中含量难以控制，饱和、单不饱和脂肪酸含量较高【 等重要问题一直没有得到解决。 近年来代谢工程在国内外的兴起为微生物代谢网络研究及 目标产物合成提供了有效手 ， 。本文应 用代谢通量法在脂肪酸代谢网络层次上深入分析 A A合成过程，通过调控发酵条件引导碳流流入 A A合 成。 收稿日期：2 0 0 6 0 3 0 8 修订 日期：2 0 0 6 0 8 0 8 基金项 目：国家自然科学基金( 2 0 5 7 6 0 5 4 ) ：江苏省自然科学基金( B K2 0 0 5 1 l 4 ) ：江苏省博士后科研资助计划。 作者简介： 金明杰( 1 9 8 l ) 男，r r ,r r A南京工业大学硕士生。通讯联系人：黄和E m a i l ：h u a n g h n j u t e d u c a 维普资讯 第2 1 卷第2 期 金明杰等：应用代谢通量法分析花生四烯酸的合成过程 3 1 7 2 A A发酵代谢机理分析及代谢通量模型的建立 2 1 代谢机理分析 高 山被孢霉( Mo r t i e r e l l a a lp i n a) 为 A A的高产菌株 。在其胞 内碳流有 四个去 向( 见图 1 ) ： ( 1 )合成生物质，包括糖类、蛋白质、核酸等大分子，本文中提到的生物质不包含脂类。 ( 2 )通过糖酵解及 T C A循环完全氧化分解 ，为各种生命活动提供 A T P和 NA D H。 ( 3 )生成 乙酰辅酶 A( A c C o A ) ，进 而合成脂肪酸 。 f 4 )进入胞液中的丙酮酸一草酰乙酸一苹果酸一丙酮酸的“ 转氢酶循环” 【 。 2 2 代谢通量模型的建立 细胞内大多数代谢物库有着非常高的周转，甚至在细胞所经历的环境受到强烈干扰之后，不同代谢 物库的浓度也会迅速调整到新的水平，其调整速度要比细胞生长和环境变化快得多，这意味着中间代谢 物的生成与消耗基本持平，即符合拟稳态假设【 。另外，在高山被孢霉菌体内，用于合成脂肪酸特别是 多不饱S i l l 肪酸的 N A DP H主要由苹果酸酶( ma l i c e n z y m e ) 脱羧作用提供，苹果酸酶的活性在脂肪酸合成 过程 中至关重 l 】 川 。 2 2 ， 1 稳定期代谢通量模型的建立 I )基于 以上分析做如下假设： ( 1 )从葡萄糖到乙酰辅酶 A的代谢途径中间产物符合拟稳态假设。 r 2 )用于脂肪酸合成 的还 原力 N AD P H 由苹果酸酶脱 I I )以 C - mo l 为基础( 即 C 6 Hl 2 0 6 用 C H2 0表示) ， ( 1 )经过 E MP + T C A循环完全氧化的碳流： G 。 P y 。 A。 c。 A 。、 、呻Bi O ma S s J 。 J A -c oA 。 Ma i cE me l 1 6 ：0 1 8 ： 0En l o n g a s e Ar a c h id o n i cAc id5 ,8 ， 1 l ， 1 4 2 0 ： 4 (AA ) ( o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n ) ( c e l l m a i n t e n a n c e ) 维普资讯 高校化学工程学报 2 0 0 7 - - 4 月 化学计量反应式( 4 ) ( 1 1 ) 中，C 1 6 - C 2 2脂肪酸这些中间产物的积累量不为零，拟稳态假设不适用，因 此这些产物必须进行实验测量。现把( 4 ) ( 1 1 ) 式作为一个方程 X ： r x ： - 0 5 x A c C o A 一 口 NA D P H - b NA D H一 7 A T P d 0 2 = 0( C x表示各类脂 肪酸 的统一化 学计量式 ， 表示碳原 子个数1 对方程( 1 ) ，( 2 ) ，( 3 ) ， ) ，( 1 2 ) ，( 1 3 ) 各中间代谢物按拟稳态假设可得各速率间具有如下计量关系： A c C o Ad A c C o A 】 d t =r 3 -0 5 x r x =0 N A D Hd N A DH 】 d t =2 r l r 2 +r 3 6 r x 2 =0 A T P ：d A T P 】 d t =0 6 7 7 r l r 2 一 3 7 r x +p o l 2 一 l 3 =0 N A D P H：d N A D P H 】 d r r 2 +， 3 一a r x =0 写成矩阵形式可表示为： A I 0 0 2 1 0 6 6 71 0 1 1 0 5 x 1 6 1 7 1 一口 0 0 1 0 p o-1 0 0 矩阵 A的秩为 4 ，须确定的速率变量共 6个，则方程 自由度为 2 ，测出两个速率即可完全确定代谢 网络中的通量分布。本文中选择葡萄糖和各脂肪酸作为已知参量。在 A A发酵实验中通过离线分析可以 测得不同时间段的糖、总油脂含量及总油脂中各脂肪酸的组成，通过对其数值微分即可得葡萄糖的消耗 速率及脂肪酸的合成速率。 2 2 2 指数生长期，减速期代谢通量模型的建立 菌体在指数生长及减速期 ，碳流去 向比稳定期多了一个 方面 ，即菌 体的生 长( 包括蛋 白质、碳水化合 物、核酸大分子的合成) 。由于生长期细胞内部代谢的复杂性，加上代谢途径不明确，本文通过测得菌体 ( 不含油脂) 碳元素含量，做碳元素平衡来求解进入菌体合成的碳流通量： x c =d ( J l c J 4 0 为比生长速率， c 为菌体的含碳量； 为除去油脂的菌体浓度： G l c 】 朋 f 表示用于菌体合成的葡萄糖分流浓度) 此式加上稳定期代谢通量模型便构成了指数生长期、减速期代谢通量模型。 上文给出了不同时期 A A合成的代谢通量模型，利用该模型可以求得实验条件下代谢途径通量的分 布、变化，从而可以推知影响碳流分布的关键因素，探讨 A A积累机理。 3 材料及方法 3 1 菌种 高山被孢霉 ME 1 ( Mo r t i e r e l l a a l p i n a ME 1 ) ，南京工业大学代谢工程实验室保藏。 3 2 培养基 种子培养基( g L ) ：葡萄糖 6 0 0 ， 酵母膏 5 0 ， KH 2 P O 4 3 0 ，p H 6 0 。 发酵培养基： 充足氮源发酵培养( C N = I 8 ： g L ) ： 葡萄糖 6 0 0 ， 酵母膏 5 0 ， K H 2 P O 4 3 0 ， Mg S O 4 1 0 ， Na NO 3 6 0 ， p H 6 0 。 限制性氮源发酵培养( C N = 2 9 g L ) ： 葡萄糖 6 0 0 ， 酵母膏 5 0 ， K H 2 P O 4 3 0 ， Mg S O 4 1 0，Na NO3 3 0，p H 6 0。 3 3 发酵工艺 将 2 5 0 mL三角瓶中活化的种子液接入 5 L发酵罐发酵。 发酵条件： 温度 2 5 ， 搅拌转速 2 5 0 r mi n ， 装液量 3 L ，通气量 2 0 L mi n - ，p H 6 0 。 氮源补加实验：限制性氮源发酵时在 9 6 h补加 0 0 5 的N a NO 3 。 九 维普资讯 第 2 1 卷第2 期 金明杰等：应用代谢通量法分析花生四烯酸的合成过程 3 1 9 3 4 分析方法 糖浓度的测定：S B A生物传感分析仪测定。 菌丝体干重的测定：将培养物抽滤，蒸馏水洗涤 3次。抽干后 6 0 C烘干至恒重，称重。 菌油的提取：索氏提取法提取粗菌油。脂肪酸测定：参见文献【 1 1 】 。 菌体碳、氮元素的测定：利用 E A1 1 1 2元素分析仪测得菌体( 不含油脂) 中的碳含量为 4 1 ， 氮含量为 5 。 发酵液氮元素的恒算：发酵液氮浓度= 发酵液起始氮浓度一菌体干重x 5 发酵液碳氮 比：C N = 发酵液中碳浓度 发酵液中氮浓度 4 结果与讨论 发酵实验结果如图 2 ( 图中菌体量为去 除油脂后的 及表 1 。 为了清楚地分析 A A 合成机理及不同时 期碳流的分布、迁移情况 ，根据菌体生长及 脂肪酸合成的不 同时期分为三个阶段 ：指数 生长期( 2 4 7 2 h ) 、减速期( 7 2 9 6 h ) 和稳定期 ( 充足氮源： 9 6 1 2 0 h ， 限制性氮源： 9 6 1 6 8 h ) 。 对各个时期数据 分别用各 自的模型进 行计算分析可得不同反应的代谢速率，将流 向整个代谢网络的碳通量看作 1 0 0 ，则归一 化后得到的碳 通量分布如 图 3 、 图 4 、图 5 。 图中斜杠隔开 的三四个 数字依次代表 的时 期是指数生长期、减速期、稳定期补加氮 源后( 9 6 1 4 4 h ) 。p o值取 2 5 ，在计算代谢 方程( 2 ) 的碳流通量时把消耗的 NA D H 和 A T P折算成完全通过 E MP + T C A循环消耗的 bD 2 量 g 罟 8 8 皇 【 ， t h 图 2 发酵过程中菌体生长及油脂合成随时间变化 曲线 F i g 2 T i me C O U IS C o fb io ma s s a n d f a t r y a c i d s s y n t h e s i s i n f e r me n t a t i o n 一 一g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n wi th S U f fic i e 呲 N- s o u r c e 一 0一 u c o s e c o n c e n t r a t i o n wit h l im i t e d N s o u r c e 一 一b i o ma s s c o n c e n t r a t i o n wi t h S U 历 c i e n t N s o u r c e 一 一b i o ma s s c o n c e n t r a t i o n wit h l i mi t e d N- s o u r c e 一 一l i p i d s c o n c e n t r a t i o n w s u 历c i e n t N- s o u r c e A l i p i d s c o n c e n t r a t i o n wi t h l i mi t e d N s o u r c e 一 g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n a f te r a d d i n g N- s o u r c e 一 口一 l i p i d s c o n c e n t r a t i o n a ft e r a d d i n g Ns o u r c e 碳流： 0 6 1 7 C H 2 O + NA D P H = 0 。图 5中，箭头上方数字代表的是充足氮源发酵；下方数字代表的是限制 性氮源及补加氮源发酵。 表 1 发酵液氯浓度及各脂肪酸在总油脂 中的含量 Co n c e n t r a t i o n P e r c e n t a g e o f v a r i o u s fa t t y a c i d s i n l i p i d s T j me h o f N g L - Cl 6 ： 0 Cl 8 ： 0 Cl 8 ： l Cl 8 ：2 Cl 8 ： 3 C2 0 ： 3 C2 0：4 C2 2 ： 0 2 4 1 0 6 2 7 0 6 0 3 5 0 l 0 0 7 0 30 l 1 0 0 7 2 0-3 5 3 0 1 l 0 0 28 0 l 0 0 3 0 20 l 3 0 3 0 S u f f i c i e n t N s o u r c e 9 6 0 2 7 2 8 _3 8 3 2 6 0 7 0 3 2 63 l 7 0 3 l l 2 0 0 2 7 2 7 _3 7 0 2 60 4 0 2 0 30 2 4 3 3 5 2 4 0 5 9 2 0 0 5 0 3 8 0 l 2 0 8 0 20 l 2 0 0 7 2 0 0 5 2 34 9 0 3 2 0 l 1 0 3 0 40 l 5 0 2 l L i mi t e d N- s o u r c e 9 6 0 0l 2 7 l 7 1 2 6 5 8 5 2 0 5 2 2 0 1 2 l l 6 8 0 0l l 5 5 4 0 l 7 6 5 0 1 0 5 0 4 5 0 3 0 9 6 h a d din g Na NO3 l 4 4 00 9 l 5 7 3 0 l 6 7 4 0 0 2 0 5 0 1 4 0 把流向脂肪酸合成的乙酰 C o A通量看作 1 0 0 ，则流向各脂肪酸的通量分布如图 6 、图 7 。图中用两 个数相加表示的，前一个数字代表从前一个脂肪酸流下来的碳通量，后一个表示从乙酰辅酶 A流入的碳 通量；+ + 表示这个反应除了葡萄糖流入的碳流量外还利用了少许先前以脂肪酸形式积累的碳流。 4 1 充足氮源发酵碳流分布探讨 由图 3可知，充足氮源发酵各时期碳流大部分流向了生物质合成和为生命活动提供能量的 E MP+ l_ I l 簧lu 8I l o u p l d I 一 s B go 【 H 维普资讯 高 校化学工程学报 2 0 0 7 年4 月 T C A 循环，而用 于脂 3 7 s， 4 4 9， 3】 4 AD P H 3 3 9 8 0 5 7 8 2 DP H 肪酸合成的碳流各个 J 8 _ 5 5 时期分 别 只 占总 碳流 B i。 。n a s 。 3 7 9 2 1 7 4 5 0 G 1 C 22 2 9 0 2 4 6 7 1 6 2 5 L i p B ； 。 a s ： ： ：! ： ! G 。c , 6 4 4 4 。 8 4 3 6 8 L 3 | p j 。 的 2 2 -9 o o0 ， 2 4 _6 7 1 14 2 104 3 03 335 43 53 3 9 80 6 1 l5 5-3 5 1 1 4 z -uq ) j ) 1 6 2 5 。 这 主 要 是 由 l J L 2 2 于氮源充足时 E MP+E m T c A E T c A T C A 循 环 中酶 活较 图3 充 足氮 源发 酵 各时 期碳 通量 分布 图4 限 制 性氮 源发 酵各时 期 及流 加氮 源 碳通 量分 布 高 ，从而使 其周 转较 F i g 3 F l u x d i s t r i b u t i o n s o f e x p o n e n t ia l p h a s e ， F i g 4 F I u x d i s t r i b u t i 0 n s o f e x pon e n t i a l p h a s e ， 快 ，呼吸作 用 旺盛 ，d e c e le r a t i n g p h a s e a n d s t a t i 0 n a r y p h a s e w i t h d e c e l e r a t i n g p h a s e ， s t a t i o n a r y p h a s e a n d a ft e r a d d i n g ， 士J -目 下 、 田1_ s u ffi c i e n t N 。 s o u r c e ( G 1 C ： g l u c o s e ) N a N O 3 w i t h l i m it e d N s o u r c e ( G 1 C ： g l u c o s e ) 致使大 量 的碳流 用 于 生命活动而非脂肪酸合成。因此导致最终发酵结果脂肪酸含量较低，占细胞干重的2 0 2 ( 见图 2 ) 。 另外 ，从图 6可 以看 出，发酵各 时期 C 1 6 一C1 8延长反应及 C 1 8 ： 1 - * C 1 8 ： 2脱氢 反应一直起着关键的 限制碳流的作 用， 致使大量碳流在 C1 6和 C1 8 ： 1 积 累。 从而使得最终 发酵结果 AA在总油脂中的含量偏低 ， 只有 2 4 3 。这可能是由于氮源浓度过高抑制了这两步反应关键酶的活性。 4 2 限制氮源浓度引导发酵碳流迁移的探讨 图 4表明通过限制氮源浓度使得碳流明显地从指数生长期的大量流入 生 物 质 的 合 成 ( 3 0 3 9 ) 迁 移 至 减 速 期 、 稳 定 期 的 脂 肪 酸 合 成 ( 2 3 6 4 - - + 4 4 8 4 - - - , 3 6 8 3 ) 。 这是 由于氮源浓度 在引导碳流迁移过程 中起着 3 2 8 8 8 0 6 9 7 Gl C 395 1 9 21 3 07 5 3 9-2 9 图5 各时期流入 A A的碳通量 F i g 5 Ca r b o n fl u x e s t o AA i“ d i ff e r e n t p h a s e s 至关重要的作用。减速期随着限制性氮源浓度的下降，细胞内N H4 + 浓度下降导致了三羧酸循环减慢，细 胞代谢产生的大量乙酰 C o A不再进入三羧酸循环， 而借助柠檬酸通过三羧酸转运体系转运至胞液中用于 脂肪酸的合成【 们 。从而使得最终发酵结果脂肪酸含量提高至 2 8 8 ( 见图2 ) 。 Ac C l o A 8 9 1 6 8 8 I 3 3 Acl C 矾 2 4-37 2 ， “ “ l2 16 C f 5 9 2 9 + 7 _4 1 6 5 8 8 + 8 2 3 l 6 4 9 7 + 8 12 4 2 3 3 + 5 2 9 1 5 8 1 5 + 7 2 7 T 7 5 5 3 H+1 0 8 3 7 5 1 2 ”+1 0 7 0 5l _6 8 7 1 _ 3 7 4 3 4 0 8 H， 、 + ： 3 1 4 3 2 3 5 7 0 I 4 2 8 7 H， 、 l i p i d s i n e x p o n e n t i a l p h as e ， d e c e l e r i n g p h a s e an d s tat i o n a r y 4 7 6 2 + + 8 N 2 4 8+ 0 2 8 1 82+ 0 2 I 3 0 8 6 4 7 3 2 8 5 7 4 ” 2 0 3 0 4 7 3 2 + + 8 5 7 4 ” 8 5 1 4 + J c 3 ， + + + 粥 1 6 6 9 4 2 8 5 I 8 3 4 8 9 7 6 7 2 0 ： 4 由图 7可以看出限制性氮源发酵各时期流向脂肪酸合成的碳流分布变化：指数生长期流入脂肪酸合 成的碳流有 2 4 1 9 在 C 1 6处积累，2 9 ， 1 6 在 C 1 8 ： 1 处积累；到了减速期 C 1 6积累量增大到4 6 0 0 ，而 在 C1 8 ： 1处没有积累；稳定期 C 1 6 - * C1 8这一步截流作用解除，并且在生长期积累的饱和、单不饱和脂 肪酸也在这个时期有一定程度地向A A转化，使得此时流入脂肪酸合成碳流的 8 3 4 8 流入 A A合成。这 维普资讯 第 2 1 卷第 2期 金 明杰等：应用代谢通量法分析 花生四烯酸的合成 过程 3 2 1 可能是由于减数期、稳定期氮源浓度的下降( 见表 1 ) 使得 C1 6 - “ C 1 8延长反应及 C1 8 ： 1 C 1 8 ： 2脱氢反应 抑制作用解除，碳流大量迁移至 A A的合成，使得最终发酵结果 A A在总油脂中的含量提高至 4 5 0 。 但由于限制性氮源发酵稳定期随着氮源的耗尽，用于合成 N A DP H 的“ 转氢酶循环” 关键酶苹果 酸酶活性下 降，“ 转氢酶循环” 通量相应减小【 l 例 ，细胞 内 NA D P H 含量减少 ，在一 定程 度上抑 制了碳流大 量流 向脂肪酸 的合成 ，也抑制 了流入脂肪酸合成 的碳流大幅度流 向 AA 合成 以及饱和 、单 不饱和脂肪酸 向 A A 的转 化。此时 J A 少量氮源【 l o J 或苹 果酸【 l 】 便 能再 次激活苹果酸酶活性 ，增加此循环 的通量 ，解除 还原力 N A D P H 的限制 ，从而增加 流向脂 肪酸合成 的碳 流 以及提高流入 A A 的碳流 比例 、加大饱和 、单 不饱和脂肪酸 向 AA的转化 。因此 ，限制性氮源 发酵 9 6 h补加氮源后有 3 4 0 的碳流迁移至脂肪酸合成 ， 同时也使得流入脂肪酸合成碳流的 9 7 6 7 都流向了A A的合成。最终使得发酵结果中脂肪酸在细胞干重 中的含量提高到 2 9 4 ，A A在总油脂中的含 量提高至 5 0 1 。 另外由图5可以更明显地整体上看出限制氮源浓度以及 9 6 h补加氮源对引导发酵碳流迁移至AA合 成的显著作 用：充足氮源发酵各 时期流 入 A A 的碳流只有 3 2 8 ，8 8 0 ，6 9 7 ，而通过引导后的碳流 各时期提高至 3 9 5 ，1 9 2 1 ，3 9 2 9 。最终实现 AA产 量从 1 3 g L 提高到 3 5 g L 。 5 结 论 通过建立 花生 四烯酸合成 的代谢通 量模型并应用此模型对 高山被孢 霉在充足氮源发酵 各时期 的碳流 分布 分析发现流入 脂肪酸合成的碳流各 时期分别只 占总碳流 的 2 2 9 0 ， 2 4 6 7 ，1 6 2 5 ，并且大量碳流 在 C 1 6和 C1 8 ： 1 处积累。通过限制氮源浓度引导发酵碳流迁移以及在稳定期补加氮源巩固、强化这种迁 移 ，成功地将减速 期和 稳定期流入脂肪酸合成 的碳流提 高至 4 4 8 4 和 4 0 2 3 ，并解除 了碳流在 C1 6和 C1 8 ： 1 处 的积 累。 使 得脂 肪酸在细胞干重 中的含量从 2 0 2 提高至 2 9 4 ， A A 在总油脂 中的含量从 2 4 l 3 提高至 5 0 1 ，最终实现 A A产量从 1 3 g L 一提高到 3 5 g L 一。 参考文献： 1 】 WANG Z h i mi n g ( 志 明) T h e p r o d u c t i o n a n d a p p l i c a t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d( 花 生 四烯 酸 生产及应 用) J 】 Ch i n a F o o d Ad d i t i v e s ( 中国食 品添加剂) ， 2 0 0 1 ， ( 1 ) ： 3 O 3 3 2 】 Z H O U P e n g p e n g( 周蓬蓬) ， Y u L o n g o j i a n g( 余龙江) ， wu Y u a n x i ( 吴元喜) e t a L F e r me n ta t i o n c o n d i t i o n s f o r a r a c h i d o n i c a c id p r o d u c t io n b y Mo r t ie r e l l a a lp i n a( 高 山被孢霉产花生 四烯酸发酵条件 的研 究) J 】 - I n d u s t r i a l Mi c r o b i o l o g y ( I业微生物) ， 2 0 0 3 ， 3 3 ( 2 ) ： 4 I - 4 5 3 】 S a k u r a d a n i E ， Hi r a n o Y K a ma d a N e t a 1 I mp r o v e me n t o f a r a c h i d o n ic a c i d p r odu c t i o n b y mu t a n t s w i t I l l o w e r n 3 d e s a t u r a t i o n a c t i v i t y d e r i v e d f r o m Mo r t i e r e l l a a lp i n a 1 S - 4 J 】 l Ap p l i e d Mi c r o b i o l o g y a n d Bi o t e c h n o l o g y ， 2 0 0 4 ， 6 6 ( 3 ) ： 2 4 3 2 4 8 4 】 Wy n n J P ， R a t l e d g e C E v i d e n c e t h a t t h e r a t e - l i mi t i n g s t e p for t h e b i o s y n t h e s i s o f a r a c h i d o n i c a c i d i n Mo r t i e n e l l a a lp i n a i s a t t h e l e v e l o f t h e 1 8 ： 3 t o 2 0 ： 3 e l o n g a s e J 】 _ Mi c r o b i o l o g y ， 2 0 0 0 ， 1 4 6 ( 9 ) ： 2 3 2 5 2 3 3 1 5 】 G ONG Gu o - h o n g( 贡 国鸿) ， S HA NG Y u n( 尚耘) ， G AO Xia n g ( 高翔) e t a 1 P r o d u c t i o n o f AA o i l b y mi c r o b i a l f e r me n t a t i o n ( 微生物 发酵 法生产 花生四烯酸油脂) J 】 Ch i n a Oi l s ( 国油脂 ) ， 2 0 0 2 ， 2 7 ( 1 ) ： 4 3 4 4 6 】 E r o s h i n V K， De d y u k h i n a E G S a t r o u t d i n o v A D e t a 1 Gr o wt h C o u p l e d l i p i d s ynt h e s i s i n Mo r t i e r e l l a口 i n a L P M 3 0 1 ， a p r o d u c e r o f a r a c h i d o n i c a c i d J 】 - Mi c r o b i o l o g y ， 2 0 0 2 ， 7 1 ( 2 ) ： 1 6 9 1 7 2 7 B a i l e y J E T o wa r d a s c i e n c e o f me t a bol i c e n g i n e e r i n g J 】 S c i e n c e ， 1 9 9 1 ， 2 5 2 ( 5 0 1 3 ) ： 1 6 6 8 1 6 7