野生荞麦籽粒中芦丁降解酶的分离纯化.pdf

第 2 9卷第 3期 2 0 1 1年 9月 Vo 1 2 9 No 3 S e p2 01l d o i ：1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 0 0 0 2 6 5 0 2 0 1 1 0 3 0 1 7 野 生荞 麦籽粒 中芦 丁降解酶 的分 离纯化 唐 宇 ，邵继荣 ，罗庆林 ，郑亚迪 ，孙俊 秀 ( I 四川农业大学生命科学与理 学院，四川 雅安 6 2 5 0 1 4 ； 2 四) J I 烹饪高等专科 学校 ，成都 6 1 0 1 0 0 ) 摘要 ：从野生荞麦种金荞麦籽粒 中提取 出芦丁降解酶， 具有将 芦丁 降解为槲皮 素 的作用 。该 粗酶 液用葡聚 糖凝胶 柱 G - 1 0 0和 D E AE阴离子交换柱分离纯化后 ， 最终酶 的比活性 由 5 9 2 U m g提高到 6 7 1 4 U mg ， 纯化倍数和 回收 率分别 为 1 1 3倍和 3 5 。所得酶液经 S D S P A GE检 测酶 分子 量大小 为 6 0 k D a左 右。对酶 液反应 条件进 行研 究， 发现酶的最适温度为 4 O ， 最适 p H 值为 5 0 。在工业 生产上可借助芦丁 降解酶 以酶解法取代酸解法生产槲皮 素 。 关键词 ：野生荞 麦；芦丁降解酶 ； 槲皮 素；芦丁 中图 分 类 号 ：Q5 9 9 文 献 标 志码 ：A 文 章 编 号 ：1 0 0 0 2 6 5 0 ( 2 0 ) 0 3 0 3 9 1 0 6 Pu r i f i c a t i o n o f Rut i n De g r a d i n g Enz y m e f r o m W i l d Bu c k whe a t Ke r ne l s TAN G YU ，SH AO di r o n g ，L U O Qi n g I i n ，Z HE N G Y a d i ，SU N d u n x i u (1 Co l l e ge of Bi ol og y a n d Sc i e nc e，Si c hua n Agr i c ul t ur al Uni v e r s i t y，Ya a n 6 25 01 4，Si c hu a n，Chi na 2 S i c h u a n Hi g h e r I n s t i t u t e o f Cu i s i n e ，Ch e n g d u 6 1 0 1 0 0 ，Ch i n a ) Ab s t r a c t ：The r u t i n d e gr a di n g e n z y me w h i c h wa s e x t r a c t e d f r om s e e d s o f Fa go pyr um c ymo s u m ， o ne o f wi l d bu c k whe a t s pe c i e s ，c ou l d e f f e c t i ve l y d e g r a d e r ut i n i n t o qu e r c e t i n The r u t i n d e g r a di ng e n z y me wa s pu r i f i e d wi t h Se p ha de x G一 1 0 0 a nd DEAE c e l l u l o s e 一 3 2 a ni on e xc ha n ge c o l u m n The e n z yme wa s pu r i f i e d t o l 1 3 - f o l d wi t h 3 5 r e c o v e r y，a nd t h e s pe c i f i c a c t i v i t y i nc r e a s e d f r o m 5 9 2 U rag t o 6 7 1 4 U rag S DS PAGE a n a l y s i s r e v e a l e d a s i n g l e p r o t e i n b a n d c o r r e s p o n d i n g t o a mo l e c ul a r m a s s o f 6 0 KDa M a x i mum e n z y me a c t i vi t y wa s o bt a i ne d a t 4 0 a nd pH 5 0 Ba s e d o n t h e r e s u l t s i n t hi s s t u d y，i t c a n be c on c l ud e d t ha t t he r u t i n d e g r a d i ng e n z y m e ha s gr e a t po t e n t i a l t o r e p l a c e t he c l a s s i c a l a c i d hy d r ol y t i c m e t ho d t o p r o du c e q ue r c e t i n i n i nd us t r i a l a p pl i c a t i on Ke y wo r ds ：wi l d bu c k whe a t ；r ut i n d e gr a di n g e n z y me；q ue r c e t i n；r u t i n 我 国的西南部 有 丰 富 的 野生 荞 麦 资 源 ， 其 中金 荞麦、 细柄野荞麦 、 齿翅野荞麦等野生种不仅资源量 大 ， 而且含 有 丰富 的药用成 分 芦 丁口 。研究 表 明， 芦丁的药效是通过体 内代谢生成槲皮素而产生 的。在清 除体 内 自由基 ， 抗 氧 化 活性 l 3 和抗 脂 质 过 氧化 方面槲 皮 素要 远 大 于芦 丁_ 4 。在成 骨 细 胞 代 谢方 面槲皮 素 的作 用也 明显 高于 芦丁 。同时槲皮 素对 丝裂 霉 素 C诱 导 的 DNA 损 伤 有保 护 效 应 l 7 。 因此 ， 槲皮 素在 药效 作 用 和市 场 价 格 上 都远 远 高 于 芦 丁 。 目前 人们是 从 植 物 原 料 中直 接 提 取 芦 丁 ， 然 后 通过 酸水解 的方 法 转 化 为槲 皮 素 ， 此 方 法 虽 然 可 以得到纯度较高 的槲皮 素， 但提取 流程冗 长， 能耗 大 ， 且大量的废液易污染环境 。而荞麦籽粒中存在 芦丁降解酶l 8 ， 在一定条件下， 可将芦丁降解成槲 皮素 、 芸香糖等物质 。因此 ， 对野生荞麦中芦丁降解 酶分 离纯化 、 酶学 性质 进行 研究 ， 以利 用野生 荞麦 为 收 稿 日期 ： 2 0 1 10 62 0 基金项 目： 荞麦野生种质 资源 的保护和利用研究 四川 省科技厅 重点攻关 课题 ( 0 4 N G0 0 1 0 1 5 ) ； 苦荞异 黄酮代谢途 径 关键酶基因的克隆 四川省科技厅重点攻关课题 ( 0 4 NG 0 0 1 0 1 5 ， 2 o 0 6 Z 0 8 0 1 2 ) 。 责任作者 ： 邵继荣 ( E - ma i l ：s h a o j r O 0 7 1 6 3 c o rn) ， 学叫 大 业A 农 _ 星 S m 3 9 2 四J I l 农业大学学报 第 2 9卷 原料 ， 通过其 中的芦 丁转化酶将 芦 丁转化 为槲皮 素 ， 从而获得一条高效、 经济、 环保的槲皮素生产途径是 本研究 之 目的 。 1 材料和方 法 1 1材料 本 实验所 用 的植 物材 料为 蓼科 ( P 0 z g o n n c P 口 e ) 养麦属 ( F a g o p y r u m Mi l 1 ) 中的野 生 荞 麦 种 金 养麦 ( F a g o p y r u m c y mo s u m) 的籽 粒 ， 采 自四川 I 普格 县 。 1 2主要试 剂 芦丁 ( 芸 香苷 ) 标 准 品 ， 成都 科龙化 工试 剂厂 ， 纯 度 9 5 。槲皮素标 准品， 美国新 泽西制药公 司， 纯 度 9 9 。S e p h a d e x G 1 0 0凝 胶 柱 ( 1 5 c m 5 0 c m) ， 美国法玛西亚 制药 公司。D E AE c e l l u l o s e 一 3 2 阴离 子交换柱 ( 1 2 c m5 0 c m) ， 英 国 沃特 曼公 司 。 聚 酰胺薄膜 1 0 c m1 0 c m ， 武 汉药科新 技术 开发有 限公司。 1 3 圭要仪器 UV 一 2 1 0 2 C型紫外分光光度计 ， 尤尼柯 ( 上海) 仪器有限公 司。HZ Q - F 1 0 0全温振荡培养箱 ， 上海 仪器设备有限公司。Ag i l e n t 1 1 0 0高效液相色谱仪 ( 4 0 2 5 0 mm， 5 m) ， 美 国安捷伦科技有限公 司。 T GL - 1 6 M 低温高速离心机， 上海乔跃 电子有 限公 司 。D Y C Z 一 2 4 D型垂 直 板 电泳 槽 ， 北 京 中仪 器 材公 司。 1 4 实验 方法 1 4 1 金荞麦 中芦丁降解酶的提取 取金 荞麦 干燥 籽 粒 粉碎 ， 过 6 O目筛 ， 称 取 干 粉 5 0 g ， 加 人 6 0 0 mL 0 0 2 mo l L p H 5 0的醋酸缓 冲 液 和 1 mmo l L E D TA， 在 冰 浴 中搅 拌 提 取 1 h ， 过 滤 ， 滤液在 4离 心沉 淀 ( 3 0 0 0 r rai n )3 0 mi n 。弃 去下层沉淀 ， 给上清液中逐渐加人硫酸铵( 边加边搅 拌) 使达到 8 0 的饱和度 ， 在 4静置过夜， 再经过 低温高速离心机 1 0 0 0 0 r mi n离心 3 0 rai n ， 得到的 沉淀用 0 0 2 mo l L p H 5 0的醋酸缓冲液溶解 ， 放 入透 析袋在 4条 件 下 蒸馏 水 透 析 ， 每 2 h换 1次 蒸 馏水 ， 共 换 5次蒸馏 水 。收集酶 液 ， 经 聚 乙二 醇 1 0 0 0 0浓缩制得芦丁降解酶 的粗酶液 。4冰箱保 存待用。 1 4 2 金荞麦中芦丁降解酶的纯化 1 4 2 1 交 联 葡 聚糖 凝 胶 柱 ( S e p h a d e x O - 1 0 0 ) 纯 化 使用 S e p h a d e x G- l O O柱对芦 丁降解酶粗酶液 进行 初步 纯化 。加 样前 用 p H 5 0 HAc 缓冲 液平衡 过夜 ， 然后 取粗酶 液 1 mL轻轻 加人到 S e p h a d e x G - 1 0 0柱床表面上 ， 置于 4下 ， 用 p H 5 0 HAc 缓 冲 液洗 脱 ， 流 速 控 制 在 1 3 1 6滴 mi n ， 收 集 分 离 物 质 ， 浓缩 备用 。 1 4 2 2 DE AE c e l l u l o s e 一 3 2阴离子交换柱进一步 纯化 取 经过 初分 离 的酶液 1 mL加 入 到 DE AE c e l l u l o s e 一 3 2阴 离 子 柱 中 ， 用 p H 5 0 HA e缓 冲 液 与 0 5 mo l L的 N a C 1 溶液梯 度洗脱 ， 缓 冲液梯度 用梯 度混 合 仪控 制 。流 速控 制 在 1 5 1 8滴 rai n ， 收 集 分离产 物 ， 浓缩 备用 。 1 4 3 芦 丁、 槲 皮素标 准 聚酰胺 薄层 层析 检测 ( TLC 法 ) 分别 取 配制好 的芦 丁 和槲 皮 素标 准 液 ， 用 毛细 管于聚酰胺薄层点样， 上样量为 5 L 。展层剂为乙 醇 ： 水 一5：1 ， 展 层 时 间 为 2 0 rai n ， 展 距 为 6 8 c m， 显色剂为 1 F e C 1 。 乙醇溶液， 展层结果如图 1 。 1 槲 皮素标 准品 ； 2 芦丁标准品 。 1 Qu e r c e t i n s t a n d a r d s u b s t a n c e ；2 Ru t i n s t a n d a r d s u bs t a nc e 图 1 聚酰胺薄层层 析 Pi g u r e 1 Th i n l a y e r c hr o ma t o g r a m o f r u t i n a n d q u e r c e t i n 根据芦丁、 槲皮素标准品的 TL C可以定性检测 是否有槲皮素的生成 ， 以间接判断芦丁降解酶有无 活性 。 1 4 4芦丁 降解酶 活性 测 定 1 4 4 1 标准曲线的绘制 分别配制 l mg mL的标准品芦丁和槲皮素 溶液 1 0 0 mL， 取 3 mL此标准溶液置于紫外分光光 度计 中扫描 波长 ， 找最 大吸 收波长 。 紫外分光光度法标准曲线绘制： 分别取芦丁 和槲皮素标准液 0 、 0 2 、 0 4 、 0 6 、 0 8 mL定容 至 5 mL测吸光值 ， 以吸光度为横坐标 ， 以浓度为纵坐标 第 3 期 唐 宇( 等 ) ： 野生荞麦籽粒 中芦丁降解酶 的分离纯化 3 9 3 绘 制标 准 曲线 。 HP L C标准 曲线 绘制 ： 分 别 取 0 2 、 0 4 、 0 6 、 0 8和 1 mL槲 皮 素 标 准 液 定 容 至 1 mL， 再 取 1 0 “ L上样 。 甲醇 一0 4 磷 酸水溶 液 ( 5 0： 5 0 ) 为 流动 相 ， 流速 1 0 mL mi n ， 检 测波 长 为 3 5 5 n m， 柱 温 2 5 ， 进行梯 度洗 脱 。 以峰 面积 为横坐 标 ， 浓度为 纵坐 标 绘制标 准 曲线 。 1 4 4 2 HP L C测定芦丁降解酶活性 取粗 酶液 、 过 S e p h a d e x G一 1 0 0柱酶 液 和过 DE AE c e l l u l o s e 一 3 2柱 的酶 液各 0 1 mL， 分 别加 入 到 3 mL 0 0 1 mg mL芦丁 溶液 中 ， 于 4 O水 浴 下反 应 3 0 mi n ， 用 9 5 的 乙醇终止 酶活 ， 3 0 0 0 r mi n离心 5 mi n ， 上清液 留用 。再 从 上 清液 中取 出 1 O L上样 ， 以甲醇 一0 4 磷 酸水 溶液 ( 5 0： 5 0 ) 为流动 相 ， 流速 1 0 mL mi n ， 检 测波长 为 3 5 5 n m， 柱 温 2 5 ， 进 行 梯度洗脱。根据标准曲线计算出芦丁降解酶活性 。 酶活单 位定 义 ： 在 特定 条 件 下 ， 1 mi n内生 成 1 too l 槲皮素所需 的酶量 ， 称为一个酶活单位 ( U) 。 公式 如下 ： 单位活性( u m L ) =塑 反应液 总体积 总活性( U) 一单位活性 酶原液总体积 1 4 5酶反 应条件 的研 究 1 4 5 1 芦丁降解酶反应 的最适温度 在底 物浓度 为 1 0 mg mL下 ， 各取 0 1 mL芦 丁溶液， 加入 0 1 mL酶液， 迅 速混匀， 分别 于 2 0 、 3 O 、 4 O 、 5 O 、 6 0 、 7 O 、 8 O 下 反 应 3 0 rai n ， 然 后 加 入 0 3 mL 9 5 乙 醇 终 止 反 应 ， 离 心 ( 3 0 0 0 r mi n ) 5 rai n ， 取上 清液 ， 于 3 7 0 n m 下 检 测 吸 光 度 。根 据 槲 皮素的标准拟合曲线 ， 计算出槲皮素的生成量。 1 4 5 2 芦丁降解酶反应的最适 p H值 首先分 别配制 0 0 2 mo l L p H 3 0 、 4 0 、 5 0 、 6 0 、 7 0的醋酸缓 冲液 ， 用各种不 同 p H 值 的缓冲 液溶解底物芦丁， 使其终浓度为 1 0 mg mL。接着 分别吸取 0 1 mL芦丁溶液和 0 1 mL酶液 ， 迅速混 匀 。在 4 0 下 反 应 3 0 rai n 。然 后 加 入 0 3 mL 9 5 乙醇终 止反 应 ， 离 心 ( 3 0 0 0 r rai n ) 5 rai n ， 取上 清液 ， 于 3 7 0 n m 下检测 吸光度 。根据槲皮 素的标 准拟合 曲线 ， 计算出槲皮素的生成量。 1 4 6蛋 白质相 对分 子量 的测定 采 用 S D S一 聚 丙 烯 酞 胺 电 泳 凝 胶 电 泳 法 】 叩 ( S DS - P AGE ) 测定 芦 丁 降 解 酶蛋 白质 相 对 分 子 量 。 蛋 白质 分 子量 的确定 ： 以 S D S - P AGE电泳 凝 胶上 已 知分子量的标准蛋 白质为依据 ， 利用迁移率和蛋 白 质分 子量 的对数 之 间 的直 线 关 系 绘 出标 准 曲线 ， 通 过待测蛋 白质的迁移率便可在标准曲线上得 出其分 子 量 。 2结 果 与 分 析 2 1 芦丁 、 槲皮 素标 准 曲线绘 制 2 1 1 芦丁 、 槲 皮 素紫外 分光 光度 法标准 曲线 经 紫外分 光 光度 计 扫 描 发 现芦 丁 、 槲 皮 素有 两 个 最大 吸收 波 ， 波 长 为 2 5 5 r i m 和 3 7 0 n m。在 3 7 0 n m 波 长 下 测 定 浓度 梯 度 槲 皮 素 ， 以槲 皮 素 浓 度 为 横 坐标 ， 吸 光 度 A 为 纵 坐标 ， 线 性 拟 合 方 程 为 一 3 0 5 2 z 一0 0 0 2 6 ( r 一0 9 9 8 9 ) ， 标准曲线如图 2 。 0 00 0 5 0 01 0 001 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0 3 0 浓度 C o n c e n t r a t i o n ( mg mL - ) 图 2 紫外分光光度法测定槲皮素的标准曲线 Fi g ur e 2 The s t a n da r d c u r v e o f r u t i n 2 1 2 芦 丁、 槲 皮 素标 准品 HP L C图谱 根据 1 2 4 1方 法所 示 检 测 芦 丁 和槲 皮 素 ， 在 此条 件下芦 丁 的保 留时 间是 4 9 8 9 ， 槲 皮 素 的保 留 时间是 1 1 5 0 3 ， 芦丁和槲皮素在此条件下能分离开 来 ( 如 图 3 ) 。 同时配 制 系列浓 度 的槲 皮 素标 准 液 ， 在 相 同条 件 下测 定其含 量 。以峰 面 积 为横 坐 标 ， 槲 皮 素浓 度 为 纵 坐标 。O r i g i n 8 0作 图 ， 线 性 拟 合 方 程 为 y = 3 8 0 5 x +0 0 2 7 ( r 一 0 9 9 9 7 ) 。根 据 浓 度 与 峰 面 积 的标准曲线， 可得出反应体系中槲皮素的生产量 。 2 2芦 丁降解 酶提 取 、 纯化及 酶活 性测定 结果 2 2 1 芦丁 降解 酶的提 取及 纯化 2 2 。 1 1 S e p h a d e x G 一 1 0 0葡聚糖 凝胶 柱 从 金荞 麦粉 中提 取得 到 白色絮状 芦 丁降解酶 粗 酶液 ， 取 出 1 mL酶 液 加入 到 S e p h a d e x G 一 1 0 0葡 聚 糖凝胶柱里 ， 如 1 2 2 1方法洗脱 。洗 脱液 在 2 8 0 n m处测定吸光度 。以管数( 3 mL 管) 为横坐标 ， 吸 9 8 7 6 5 4 3 2 l O 0 O O 0 O n 0 3 9 4 四川 I 农业大学学报 第 2 9卷 光度 为纵 坐标 ， 峰图见 图 5 。 g 篓 之 篓 善 山 Qu e r c e t i n O 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 保留时间 Re t e n t i o n t i me rai n 图 3 HP L C检 测芦丁、 槲皮素标准品的保 留时间 Fi g ur e 3 HPLC a n al y s i s o f r ut i n a n d q ue r c e t i n 趟 趸 8 藉 矗 峰 面积 P e a k a r e a f mA U m i n ) 图 4 HP L C测定槲 皮素 的标准 曲线 Fi g u r e 4 Th e s t a nd a r d c u r v e o f qu e r c e t i n by HPLC 管数 T u b e s 图 5 S e p h a d e x C J - I O 0凝胶柱洗脱 曲线 Fi g u r e 5 El u t i o n pr o fil e o f t he r u t i n- d e g r a di ng e nz y me f r o m Fa g op y r u m c y mo s u m o n Se ph a de x G- 1 0 0 分别 收集各 峰洗脱 液 ， 装 入透析 袋 ， 放 入盛有 聚 乙二 醇 1 0 0 0 0的培 养 皿 中， 浓 缩 1 5 mi n左 右 ， 然 后取 出备用 。以 1 mg mL芦 丁作 为底 物 ， 在 4 O 酶解 。产物 用聚酰 胺薄膜 TL C检测 活性 ， 经 检测 2 号峰洗脱酶液有明显活性 。该酶液暂命名为 2号酶 液 。 2 2 1 2 DE A E c e l l u l o s e 一 3 2阴离子交 换柱 取 2 号 浓缩酶 液 1 mL加 入到 D E AE c e l l u l o s e - 3 2阴离 子交换 柱里 ， 如 1 2 2 2 方 法梯度 洗 ， 在 2 8 0 n l T l 处测定吸光度。以管数 ( 3 mL 管) 为横坐标， 吸 光度 为纵坐 标 ， 峰 图见 图 6 。 _耋 墨 一 0 2 0 4 0 6 0 8 O 1 0 0 管数 Tu b e s 图 6 D E A E c e l l u l o s e - 3 2离子交换柱 洗脱 曲线 Fi g u r e 6 El u t i o n pr o fil e o f t he r u t i n- d e g r ad i n g e nz y me f r o m Fa g o p yr u m c y m o s u m o n DEAE c e l l u l os e- 3 2 分别收集各峰洗脱液 ， 装入透析袋 ， 放入盛有聚 乙二醇一1 0 0 0 0的培养皿 中， 浓缩 1 5 mi n左右 ， 然 后 取 出备 用 。 以 1 mg mL芦 丁作 为底 物 ， 在 4 0 酶解。产物用聚酰胺薄膜 TL C检测活性， 结果 I号 峰有活性 。该酶液暂命名为 1 号酶液。 2 2 2 芦 丁降解酶 蛋 白质 分 子量 分别取粗酶液、 2号酶 液( 过葡聚糖凝 胶柱酶 液) 和 1号酶液( 过阴离 子交换柱酶液) 3 0 L电泳 检 测蛋 白质分 子量 大小 ， 结 果见 图 7 。 1 、 2和 3 都 表现 出共 有 的条 带 ， 与蛋 白质 ma k e r 比较， 其大小约为 6 0 k D a 。与 T S u z u k i 等人报 道的 3 一黄酮醇 葡萄糖 苷 酶口 妇 基本相 符 。 一 2 2 3 芦丁 降解酶 活性 将粗酶液 、 2号酶液和 1号酶液通过 HP L C分 别测定其酶活性。由峰面积与槲皮素浓度的标准曲 线得 知样 品转化成 槲皮 素浓度 C q ， 再 根据 酶活 定义 公式 计算 出酶活性 。结 果如表 1 。 从表 1中可看 出 ， 芦 丁 降解 酶 粗 酶 液经 过 葡 聚 糖凝胶柱和 D E AE c e l l u l o s e 一 3 2阴离子交换柱纯化 后 ， 其 比活性 由5 9 2 U mg 提高到6 7 1 3 5 U mg ， O 0 O O 0 0 O 0 加 舳 o 加 加 o 0 盎 时 电0 s q q 第 3 期 唐宇( 等) ： 野生荞麦籽粒 中芦丁降解酶的分离纯化 表 1 芦丁降解酶活性 Tab l e 1 En z y m a t i c a c t i v i t y o f t h e r u t i n de g r a di ng e nz yme s 1 代表粗酶液 ； 2 代表 2号酶液 ； 3 代表 1号酶液。 1 Cr u de e nz yme；2 No 2 e nz yme ；3 No 1 e nz yme 图 7 S DS - P AGE凝 胶 电泳 图 Fi g ur e 7 M o l e c u l a r we i g ht o f r u t i n d e g r a d i n g e n z y m e s i n po l ya c r y l ami d e g e l S DS e l e c t r o pho r e s i s 提高 了 1 1 倍 ， 回收率为 3 5 。 2 2 4芦 丁降解 酶反应 条件 2 2 4 1 芦 丁降解 酶反 应 的最适 温度 在 0 1 mL芦 丁 溶 液 中加 入 0 1 mL酶 液分 别 于 2 0 、 3 O 、 4 0 、 5 O 、 6 0 、 7 O 、 8 O下 反 应 3 0 mi n ， 槲 皮 素 的生成 量 的变化见 图 8 。 蓬 喜 O 2 0 4 0 60 8 0 1 0 0 温度 Te mp e r a t u r e C 图 8 温 度 与 芦 丁 转 化 成 槲 皮 素 的 关 系 Fi g u r e 8 Ef f e c t s of d i f f e r e nt t e m p e r a t ur e s o n t h e r u t i n- de g r a di ng e nz y m e a c t i v i t y f r o m Fa g o py r u m c y m o s u m 如 图 8所 示 ， 由槲 皮 素 的 生 成 量 浓 度 可 知 ， 在 2 0 4 0之间 ， 芦丁降解酶的活性逐渐增大 。在 4 0 时， 酶反应活性达到最大 。以后酶活逐渐降低 ， 在 6 0时 仍然 有 活 性 ， 当 温度 达 8 O时 酶才 基 本 失 活 。所 以芦 丁 降解酶最 适 温度为 4 0 2 2 4 2 芦 丁 降解酶 反应 的最适 p H 值 在 p H 3 0 、 4 0 、 5 0 、 6 0 、 7 0的醋 酸缓 冲液 配 制 的芦 丁液 中 ， 加 入 酶液 在 4 0下 反 应 3 0 mi n后 槲 皮素 生成量 的变化如 图 9 。 藿 喜 p H值 p H v a l u e 图 9 p H与芦 丁转化成槲皮 素的关系 Fi gu r e 9 Ef f e c t s o f di f f e r e nt p H o n t he r ut i n - d e gr a di n g e n z y m e ac t i v i t y f r o m Fa g o py r u m c y m o s um 如 图 9所 示 ， 由槲 皮 素 的 生 成 量 浓 度 可 知 ， 在 p H值 3 0 5 0之 间， 芦丁降解酶 活性逐渐增 大， 在 p H 5 0时酶 活性达 到 最大 ， 以后 酶 活逐 渐 降低 。 因此， 芦丁降解酶最适 p H值为 5 0 。 3讨 论 芦丁降解 酶是 日本学者 T Ya s u d a 1 9 9 2年首 次发 现并从 苦荞 籽 粒 中 提取 和纯 化 出来 ， 它 主要 分 布在 荞麦 子 叶和种 皮 中 ， 随 着籽 粒 的萌 芽 而逐 渐 减 少 j 。芦丁降解 酶经 检测属一种高 活性 天然糖苷 酶 ， 具 有专 一性 ， 主要 作用 于芦 丁而对 其他 黄酮 不起 作用。在水溶液中芦丁降解酶可将芦丁分解为槲皮 素 和芸 香糖 。T Ya s u d a发现 芦 丁 降解 酶有 两 种 同 工 酶 ， 分子 量在 7 0 k Da左 右_ 1 。2 0 0 2年 ， T S u z u k i l_ 1 从成 熟 苦荞种 子 中提取 和纯 化 出 了 3 黄 酮 醇 一 葡萄糖 苷 酶 ， 也 对 酶 学 性 质 进 行 了 研 究 ， 发 现 与 T Ya s u d a 提取的芦丁降解酶非 常相 似， 但分子量 a O 2 O 0 O 0 4 加 M 加 加 o 3 9 6 四川 I 农业大学 学报 第 2 9 卷 为 6 0 k D a左右。A B a u mg e r t e l 等口 。 从 甜荞 中提 取黄酮醇3 一异二糖苷酶， 它以芦丁为底物 ， 最适 温度为 3 O， 最适 p H值 4 8 。 本研究 从金 养麦 籽 粒 中提 出 的芦 丁 降解 酶 ， 经 过葡 聚糖凝 胶 柱 和 D E AE c e l l u l o s e 一 3 2阴 离子 交 换 柱纯 化 后 ， 其 比活 性 由 5 9 2 U mg提 高 到 6 7 1 3 5 U mg ， 提 高 了 1 l 倍 ， 回收率 为 3 5 。其分 子量 为 6 0 k Da 左 右 ， 与 T S u z u k i 等口 1 报 道 的 3 一黄 酮 醇 葡萄糖苷酶基本相符。在本实验中芦丁降解酶的最 适温度为 4 0， 当温度大于 6 0时芦丁降解酶才 开始 缓慢失 活 ， 说 明该 酶 具有 较 强 的 耐温 性 。芦 丁 降解酶的最适 p H值为 5 0 ， 其活性随 p H变化而有 所改变 。 在传统意义上， 由于芦丁降解酶的存在， 在食 品 加工过程中会造成芦 丁的降解 ， 降低 了养麦 的食用 价值 。但合理运用芦丁降解酶来生成槲皮素 ， 无形 中提高了其药用价值 ， 从 而使荞麦 的价值得到广泛 提升 。我 国是荞 麦 主产 国之一 ， 也 是 野 生荞 麦 资 源 非 常丰 富的国家之 一 。含有 丰 富芦 丁的 苦荞麦 和野 生荞 麦为槲 皮素 生产 提供 了丰富 的资源 。在工 业化 生产槲皮素工艺中， 利用芦丁降解 酶将荞麦 中的芦 丁降解为槲皮素不失为一种高效 、 快捷 、 环保途径， 值得 进一 步探讨 。 参考文献 ： E l i P e n g D C， Ta n g Y， S u n J X，e t a 1 C o mp a r i s o n o f fl a v o n o i d s c o n t e n t b e t we e n t a r t a r y b uc k wh e a t a n d s e v e r a l wi l d bu c k whe a t s p e c i e s Pr o c e e d i n g s o f t h e i n t e r n a t i o n a l f or u m o n t a r 一 2 3 I- 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3 t a r y b u c k wh e a t i n d u s t r ia l e c o n o my c Ch i n a a g r i c u l t u r a l s c i e n c e a n d t e c h n o l o g y p r e s s 2 0 0 6：1 37 1 4 2 Ta n g Y，S u n J X，P e n g D C，e t a 1 Pr e l i mi n a r y s t ud y n u t ri t i o na l q u a l i t y o f s e e d s o f f i v e b u c kwh e a t s p e c i e s P r o c e e d i n gs o f t h e 1 0 E h i n t e r n a t i o n a l s y mp o s i u m o n b u c k wh e a t C No r t h we s t A a nd F U n i v e r s i t y p r e s s 2 0 0 7：4 6 9 4 7 2 苏俊锋 ，郭长 江，韦京豫 ，等槲皮素体 内外抗氧化作 用和 比较研究 J 中国应用生理学杂志，2 0 0 2 ，1 8 ( 4 ) l 3 8 2 3 8 6 金越 ，吕勇 ， 韩 国柱 ， 等槲皮素及异槲皮素、 芦丁抗 自由基 活性 的比较研究 J 中草药 ， 2 0 0 7 ，3 8 ( 3 ) ：4 0 8 4 1 2 J i a n g P，Bu r c z y ns k i F，Ca mp be l l C，e t a 1 Ru t i n a n d fla - v o n oid c o n t e nt s i n t h r e e b u c k wh e a t s p e c i e s Fa g o p yr u m P s c 一 l e n t u m ，Ft a t ar i c u m ，a n d F h o mo t r o p i c u m a n d t h e i r p r o t e c t i v e e f f e c t s a g a i n s t l i p i d p e r o x i d a t i o n口 F o o d Re s e a r c h I n t e r n a t i o n a l ，2 0 07 ：4 0 ( 3 0 ) ：3 5 6 3 6 4 杨亚军 ，杨中林 ，王冬春 ，等芦 丁与槲 皮素对成骨 细胞 代 谢影响 的比较研究口 中药材 ， 2 0 0 6 ；2 9 ( 5 ) ： 4 6 7 4 7 0 Un d e g e r U