羊肚菌胞外多糖抗肿瘤作用的研究.pdf

553营养卫生食品科学2008, Vol. 29, No. 09 羊肚菌胞外多糖抗肿瘤作用的研究 陈 彦 1,2，潘 见1，周丽伟3，张利平2，杨 毅1 (1.合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009； 2.安徽大学生命科学学院，安徽省中药研究与开发重点实验室，安徽 合肥 230039； 3.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽 合肥 230036) 摘 要：目的：研究羊肚菌胞外多糖(EPM)对 S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用与免疫功能的影响。方法：将昆明种小 鼠接种 S180腹水瘤后随机分组，灌胃给予 200、400 mg/kg 剂量的 EPM，以灌胃生理盐水和环磷酰胺为空白对照 组和阳性对照组，研究 EPM 对荷瘤小鼠的抑瘤率、存活期和免疫功能的影响；通过与肿瘤细胞共培养，观察 EPM 对肿瘤细胞增殖的影响。结果：EPM 能够显著提高荷瘤小鼠的脾脏指数、T- 淋巴细胞百分率和巨噬细胞吞噬率； 2 个剂量的EPM 对肿瘤 S180的抑制率分别为49.04% 和 64.42%，并且可以显著延长荷瘤小鼠的存活时间；体外实验 发现羊肚菌多糖 EPM 具有直接杀死 S180肿瘤细胞的作用，最高抑制率为 46.3%，结论：MEP 具有显著的抗肿瘤活 性和增强免疫功能。 关键词：羊肚菌；胞外多糖；抗肿瘤；免疫功能 Antitumor Activity of Extracellular Polysaccharides from Morchella esculenta CHEN Yan1,2，PAN Jian1，ZHOU Li-wei3，ZHANG Li-ping2，YANG Yi1 (1.Engineering Research Center of Bio-process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China； 2.School of Life Science, Anhui University, Key Laboratory of Chinese Traditional Medicine Research and Development of Anhui Province, Hefei 230039, China； 3.College of Tea and Food Science Technology, Anhui Agricultural University, He fei 230036, China) Abstract ： Objective: To study the antitumor effects of extracellular polysaccharides from Morchella esculenta (EPM) and the immunological function on S180 tumor-bearing mice. Method: EPM was intragastrically given to S180-bearing mice at the dose of 200 mg/kg and 400 mg/kg. Normal sodium and cyclophosphamide were taken as blank control and positive control respectively. The tumor weight, immunologic organ weights and life span of S180-bearing mice were measured. S180 tumor cells were incubated with various concentrations of EPM for 24 h, and antiproliferative activities against tumor cells were determined by MTT assay. Result: EPM significantly increases the spleen index, percent of T-lymphocyte, macrophage phagocytic index and prolongs survival time of S180-bearing mice.The inhibiting tumor rates at the low and high does are 49.04% and 64.42% respectively. EPM can kill S180 tumor cells directly in vitro, with the highest inhibiting rate 46.3% at the dose of 50g/well.Conclusion: EPM has significant antitumor effects and improves immunological function. Key words：Morchella esculenta；extracellular polysaccharide；antitumor；immunological function 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)09-0553-04 收稿日期：2008-05-28 基金项目：教育部科技创新工程重大项目培育基金(7074027)；安徽省自然科学基金项目(070413143) 作者简介：陈彦(1963-)，男，教授，博士，主要从事食品生物技术研究。E-mail：chenyan600 羊肚菌(Morchella esculenta) 又名羊肚蘑、羊肚 菜 、 羊 雀 菌 、 编 笠 菌 等 ， 隶 属 子 囊 菌 亚 门 (Ascomycotina)、盘菌纲(Discormycetes)、盘菌目 (Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)、羊肚菌属 (Morchella)，因其菌盖表面呈许多小凹坑，外观极似 羊肚而得名1。作为一种珍稀食药用真菌，羊肚菌不仅 美味可口，而且营养丰富，药用价值极高，富含多糖、 酶类、氨基酸、吡喃酮抗生素、脂肪酸类等成份，在 抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老和提高免疫活性等 方面具有显著功效1-2。 羊肚菌多糖是羊肚菌的主要活性成分，目前的研究 主要集中在羊肚菌多糖的发酵提取及组成结构分析3-7， 宋淑敏等8报道羊肚菌 EF-11 液对抑制小鼠肉瘤 S180生长 有明显的抑制作用，但国内外尚缺少对其抗肿瘤作用的 2008, Vol. 29, No. 09食品科学营养卫生554 1材料与方法 1.1材料与试剂 羊肚菌菌种(Morchella esculenta 5.0381) 中科院微 生物所菌种保存中心；实验动物为昆明种小鼠(雄性， 体重 22 2g，清洁级，雄性) 安徽医学研究所动物 实验中心(批准号皖医动准字第 03 号)；S180肿瘤细胞株 中国科学院上海细胞库。 注射用环磷酰胺(Cy) 江苏恒瑞医药股份有限公 司；RPMI-1640 培养基和噻唑兰(MTT) 美国 Gibco 公 司；5- 氟尿嘧啶(5-Fu) 上海旭东海普药业有限公司； DEAE-Sepharose F.F 层析填料 瑞典 Pharmacia 公司。 1.2仪器与设备 ZHWY-2102C 全温摇床 上海智城分析仪器有限公 司；CO-150 二氧化碳培养箱 美国 NBS 公司；DG5032 酶联免疫检测仪 南京华东电子集团医疗装备有限责任 公司；CKX41 倒置显微镜 日本 Olympus 公司；MLS- 3750 全自动灭菌器 日本 Sanyo 公司；UV-2100 分光 光度计 尤尼柯上海仪器有限公司。 1.3方法 1.3.1羊肚菌胞外多糖 EPM 的制备9 羊肚菌菌种接种液体发酵培养基，摇床培养至菌丝 充满培养基。离心分离得菌丝体和发酵液，发酵液 50 旋转蒸发浓缩至 1/3 体积，加入 3 倍体积的 95% 乙醇， 置于 4 冰箱过夜沉淀。醇沉液离心( 2 8 0 0 r / m i n ， 15min)，收集沉淀。沉淀加适量蒸馏水溶解，流水透 析 2d，透析液冷冻干燥即得羊肚菌发酵液粗多糖。将 粗多糖过 DEAE-Sepharose F.F 层析柱(2.6 50cm)，用 pH7.2，0.02mol/L PBS 配制的 1mol/L NaCl 进行洗脱，苯 酚 - 硫酸法跟踪检测，收集糖峰，透析、冻干得到羊 肚菌胞外多糖 EPM。 1.3.2羊肚菌胞外多糖 EPM 对肿瘤细胞增殖的影响 将复苏后生长良好的 S180细胞(1 108个 /L)接种于 96 孔培养板，每孔 100l，加入一定浓度的待测样品， 空白对照加 RPMI1640 培养液，阳性空白加每孔 0.1g 的 5- 氟尿嘧啶(5-Fu)，然后于 5% CO2、37、充分湿化 的条件下培养 24h，加入 MTT，于酶标仪上于 570nm 波长处测吸光度，计算抑制率10。 1.3.3羊肚菌胞外多糖 EPM 体内抗肿瘤作用 实验小白鼠随机分 5 组(给药组、正常对照组、阴 性对照组、阳性对照组)，每组 10 只，其中给药组以 多糖灌胃，剂量为高糖组 400mg/kg、低糖组 200mg/kg。 另外三组以生理盐水灌胃，连续 6w。第 3w 时，抽取 接种 7d、肿瘤生长旺盛、无溃破且健康良好的瘤源放 入无菌试管中，用无菌生理盐水稀释成 5 106个 /ml 的 瘤细胞悬液。除正常对照组外，于每鼠左后肢皮下注 射 0.2ml，阳性对照组给药环磷酰胺(Cy 组)20mg/kg。6w 后，颈椎脱臼处死小鼠，剥取瘤块，称重。另取三 组小鼠做生存时间实验，给药组每天灌胃多糖 0.2ml，剂 量分别为 400、200mg/kg。另一组给予等量生理盐水。 2w后，分别腹腔注射0.2ml(5106个/ml)的瘤细胞悬液。 继续灌胃，记录小鼠死亡时间。 肿瘤抑制率(%)= (C T)/C 100 式中，C 为对照组平均瘤重；T 为实验组平均瘤重。 1.3.4羊肚菌胞外多糖 EPM 对小鼠免疫器官的影响 实验 6w 处死小鼠后，摘取胸腺和脾脏，分别计算 胸腺指数(mg胸腺重/10g体重)和脾脏指数(mg脾脏重/10g 体重) 。 1.3.5巨噬细胞吞噬实验 在实验前 1d，给小白鼠腹腔注射 6% 淀粉肉汤(含 台盼蓝)1ml。实验时，腹腔注射 1% 鸡红细胞悬液 1ml， 轻按小白鼠腹部，使悬液分散。20min 后，颈椎脱臼 法处死小鼠，吸取腹腔液置显微镜下观察。 1.3.6统计方法 数据均以 X SD 表示，采用 SPSS10.0 软件对数据 作统计学处理(t 检验)，单因素方差分析和相关性分析。 2结果与分析 2.1羊肚菌胞外多糖 EPM 的分离纯化 羊肚菌发酵液经提取和 DEAE-Sepharose F.F 柱层析 分离得到羊肚菌胞外多糖 EPM(见图 1)，苯酚 - 硫酸法检 测 MEP 总糖含量为 89.12%，考马斯亮蓝法测的其蛋白 含量为 7.64%，初步确定 EPM 为蛋白 - 多糖复合物。 详细研究.本实验对羊肚菌胞外多糖(从发酵液中提取)的 抗肿瘤活性及免疫功能进行了研究，旨在为羊肚菌多糖 的进一步开发利用奠定基础。 2.2羊肚菌胞外多糖 EMP 对 S180肿瘤细胞增殖的影响 羊肚菌多糖 EMP 与 S180细胞共同培养 24h 后，结果 如表 1 可知，EPM 在各剂量下对 S180细胞的生长均有明 显的抑制作用，并随剂量的增大，抑制作用增强。最 大抑制率 46.3% 已接近 5-Fu(53.2%)。 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 吸光度 洗脱体积(ml) 图1 EPM的DEAE-Sepharose F.F柱层析图谱 Fig.1 Eluention curve of EPM on DEAE-Sepharose F.F column chromatography 555营养卫生食品科学2008, Vol. 29, No. 09 2.3羊肚菌胞外多糖 EMP 对 S180肉瘤的抑制作用 将小鼠颈椎脱臼处死后，小心分离实体瘤,在剥离 瘤体的时候发现，模型组瘤块较大，且不易与组织分 离，而多糖组瘤块较小，边缘清晰，色泽较均一，且 易 分 离 。 2.4羊肚菌胞外多糖 EMP 对荷瘤小鼠免疫功能的影响 2.4.1羊肚菌胞外多糖EMP 对荷瘤小鼠免疫器官的影响 肿大倾向，但并无统计学意义。EPM 能显著增加小鼠 胸腺的重量，抑制脾脏肿大，延长生存时间。 2.4.2羊肚菌胞外多糖 EMP 对荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬 率和 T- 淋巴细胞的影响 3结 论 作为广谱性的免疫调节促进剂，真菌多糖具有药理 活性广泛，毒副作用低等特点，其中一些已作为癌症 的辅助治疗剂或抗病毒药应用于临床。近年来，研究 开发新型真菌多糖抗肿瘤药物引起了人们极大关注。本 实验中，羊肚菌胞外多糖 EMP 高、低二个剂量均能显 著抑制肿瘤的生长，抑瘤率分别为 64.42% 和 49.04%， 最高抑瘤率接近阳性对照组 Cy(66.35%)，与宋淑敏等8 报道羊肚菌 EF-11 多糖(其抑瘤率为 36.6%)比较，EMP 对 小鼠肉瘤 S180抑制率有显著提高，表明 EMP 为羊肚菌抗 肿瘤作用的主要活性成分。 大量药理学实验研究表明，许多真菌来源的多糖具 有一定的抗肿瘤活性，其作用机制被认为主要与增强机 体的免疫细胞功能有关，而不是直接抑制瘤细胞的生 长，如红缘层孔菌多糖10、香菇多糖12、猪苓多糖13 等。但也有研究发现一些多糖对肿瘤细胞有直接的细胞 毒活性，在体外可直接杀死癌细胞，齐春会等11的研 究表明六味地黄多糖CA4-3B和P-3体外对L1210和H-60 肿瘤细胞具有抑制作用，糙皮侧耳糖蛋白14、茯苓多 糖15等均表现出体外抗肿瘤活性。本实验发现羊肚菌胞 外多糖 EPM 可在体外直接杀死 S180肿瘤细胞，并随剂量 表 1 羊肚菌胞外多糖 EMP体外对 S180细胞增殖的影响 Table 1 Effects of EPM on S180 proliferation in vitro 抑制率(%) 53.2 46.3 42.6 39.1 0.150 50.5 表3 羊肚菌胞外多糖EMP对荷瘤小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响 (n=10) Table 3 Effects of EPM on thymus index and spleen index of S180 tumor-bearing mice (n=10) 组别 5 FuMEP 由表 2 可知，在实验剂量下，EPM 对 S180的抑制 率为 64.42% 和 49.04%，高低剂量均能显著抑制肿瘤的 生长, 与模型组比较均有极显著差异，且呈现剂量效应 关系，其中高剂量组的抑制率接近 Cy。Cy 组的抑瘤效 果最好，但对小鼠的有很大的副作用，实验中观察到 小鼠萎靡不振，毛色零乱，体重增长缓慢。从存活时 间来看，与模型组相比，低糖组表现出了显著性差异 （p 0.05） ，高糖组表现出极显著性差异(p 0.01)。 由表 3 可知，肿瘤对照组和 Cy 组的胸腺指数明显 低于正常对照组，这与 Cy 损害集体免疫功能的结论一 致。EPM 两个剂量组的胸腺指数都明显高于肿瘤对照 组，其中，高剂量组达到了极显著差异(p 0.01)。模 型组小鼠出现脾肿大特征，多糖组和 Cy 组似有抑制脾 组别 剂量(mg/kgd) 胸腺指数(mg/10g) 脾脏指数(mg/10g) 模型 9.81 2.14 58.83 5.08 Cy 20 8.79 1.65 52.42 3.42 高糖 400 20.24 4.35* 55.56 4.16 低糖 200 12.54 2.76* 52.71 5.80 正常 19.11 3.50* 49.14 4.27 注：与模型组比较，*p 0.05；*p 0.01。 由表 4 可知，与模型组比较，正常组小鼠巨噬细 胞吞噬率和 T- 淋巴细胞的百分率均呈极显著性差异(p 0.01)，Cy 明显抑制了巨噬细胞的吞噬率和 T- 细胞阳性 率。EMP 对 S180小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响，肿瘤 对照组(模型组)与 Cy 组的巨噬细胞吞噬率均显著低于正 常对照组；与肿瘤对照组相比，EMP 两个剂量组巨噬 细胞吞噬率均明显升高，高糖组的 T 淋巴细胞百分率显 著高于模型组，说明 EMP 能够刺激 T 淋巴细胞的转化。 组别 剂量(mg/kg d) 瘤重(g) 抑瘤率(%) 存活期(d) 模型 1.04 0.28 8.75 1.28 高糖 400 0.37 0.11* 64.42 15.63 1.41* 低糖 200 0.53 0.10* 49.04 11.00 2.27* Cy 20 0.35 0.09* 66.35 注：与模型组比较，*p 0.05；*p 0.01。 表 2 羊肚菌胞外多糖 EMP 对 S180荷瘤小鼠的抑瘤作用(n=10) Table 2 Antitumor effects of EPM on S180 tumor-bearing mice in vitro (n=10) 组别 剂量(mg/kgd) 巨噬细胞吞噬率 （%） T- 淋巴细胞(%) 模型 9.81 2.14 40.83 7.08 Cy 20 10.84 2.03 35.70 3.63 高糖 400 20.20 3.35* 52.71 5.80* 低糖 200 12.54 2.76* 42.56 4.16 正常 19.11 3.50* 59.14 4.27* 注：与模型组比较，*p 0.05；*p 0.01。 表 4 羊肚菌多糖对荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬率和T淋巴细胞的影响 (n=10) Table 4 Effects on macrophage phagocytic index and T- lymphocytes of S180 tumor-bearing mice (n=10) 2008, Vol. 29, No. 09食品科学营养卫生556 的增大而有剂量效应关系，提示 EPM 可能是具有免 疫调节和直接抑瘤双重作用的活性多糖，其确切机制还 有待进一步深入研究。 参考文献： 1李娟, 王臻, 姚良同, 等. 羊肚菌多糖研究进展J. 微生物学杂志, 2005, 25(4): 89-91. 2ROHE M, SCHRAGE K. 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