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研究报告 中 国 酿 造 2009年 第6期 总第207期 31 利用玉米秸秆水解液厌氧发酵产丁二酸的研究 黄秀梅,李 建,陈可泉,左 鹏,姜 岷 3 (南京工业大学 制药与生命科学学院 材料化学工程国家重点实验室,江苏 南京210009) 收稿日期: 2009202209 基金项目:国家自然科学基金资助项目(20606017) 作者简介:黄秀梅(19842 ) , 女,江苏兴化人,在读硕士研究生,研究方向为生物化工;姜 岷 3,通讯作者。 制在50 左右较为适宜。重叠区长度至少为15bp20bp, 总引物长度一般为40mer50mer。本文重叠引物中重叠区 设计了21bp,加上待拼接的Ppdc和ldh本身的引物,重叠引 物长度为46bp,有利于重叠延伸反应的完全进行。 Taq酶是PCR中最常用的耐热DNA聚合酶,具有5 3的聚合活性和外切活性,但缺乏3 5的外切校正活性。 因此, Taq酶的错配率可随DNA拷贝数的倍增呈线性积 累 9。为了使构建的融合基因高效表达 ,本实验在扩增 Ppdc和ldh时使用了高保真的Pfu DNA聚合酶,可有效地 降低错配率。 本实验在构建融合基因Ppdc2ldh时,为了保证后续表 达的融合蛋白活性不受影响,设计的2条重叠引物的重叠 区序列与2基因片段的3或5末端序列相同,既未改变启 动子与起始密码子之间的距离。 参考文献: 1 OHARA H, OKUYAMA H, SAWA Y, et al . Development of industrial production of high molecular weight poly2L2lactate from renewable re2 sources J . J Chem Soc Japan, Chem Ind Chem, 2001, 6: 3232324. 2 M IRASOL F. Lactic acid prices falter as competition toughens J . Chem Market Rep, 1999, 3: 91299. 3李 剑,唐 赟,梁凤来,等. D2 乳酸脱氢酶基因克隆及其表达J . 微生物学报, 2004, 44(4) : 49224951 4 BERNARD N, FERAI N F, G ARMY N D, et al . 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Nucleic Acid Res, 1992, 20 (17) : 456724573. 摘 要:对玉米秸秆水解液发酵产丁二酸进行了研究。玉米秸秆水解液中含有对菌体生长不利的物质,通过不同的脱毒方法处理 玉米秸秆水解液,考察了脱毒前后抑制物以及总糖含量的变化,结果表明,活性炭和Ca (OH)2同时使用的脱毒效果最好;抑制物 糠醛及羟甲基糠醛(HMF)的去除率分别为91111%、89183% ,而总糖损失率仅为5157%。用脱毒后的玉米秸秆水解液作为碳源发 酵产丁二酸,其产量可达到66123g/L,收率为67128% ,分别比未经脱毒时提高24181g/L, 25130%。 关 键 词:玉米秸秆;脱毒;丁二酸;发酵 中图分类号: TQ921 文献标识码:A 文章编号: 0254- 5071 (2009) 06- 0031- 04 Succi n ic acid produced by anaerobic fermentation from corn stalk hydrolysate HUANG Xiumei, L IJian, CHEN Kequan, ZUO Peng, JI ANGMin (State Key Laboratory ofM aterials2O riented Chem ical Engineering, College of Life Science and Phar macy, Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, Jiangsu, China) Abstract: Succinic acid producted by anaerobic fer mentation using corn stalk hydrolysate as carbon source was studied. However, the hydrolysate contained, in addition to sugars, several compounds that are toxic to microorganis ms .In order to i mprove the fer mentability of the hydrolysate, sev2 eral procedureswere evaluated for detoxication of the hydrolysate.The concentration of inhibitors and total sugar in the corn stalk hydrolysate were investigated.The results showed that activated charcoal conbinated with Ca(OH)2treat mentwas the effective method for removing the inhibitors . By this treat ment, 91111% of furfural and 89183% of hydroxymethylfurfuralwere removed from the hydrolysate, while the lossof total sugarwason2 ly 5157%.The concentration of succinic acid reached 66123g/L with the yield of 67128% from the detoxified corn stalk hydrolysate, which were 24181g/L, 25130% higher than thatwith the initial hydtolysate, respectively . Key words: corn stalk; detoxification; succinic acid; fer mentation 丁二酸(俗名琥珀酸)是生物炼制产品工程中优质的碳四平台化合物,被广泛应用于农业、 食品、 医药、 塑料、 化妆 32 2009 No. 6 SerialNo. 207 China B rew ing Research Report 品、 纺织和电镀等行业中。传统的生产方法是石化法,存在 污染大、 成本高等缺点,严重抑制了丁二酸作为大宗化学品 的发展潜力。随着生物工程技术的迅速发展和成熟,生物 转化法生产丁二酸由于其高效率、 环保性及原料的可再生 性而引起许多研究者的注意 122 ,而降低原料成本是目前 研究的热点。 我国有丰富的植物纤维资源(如农作物秸秆、 林产 品加工业下脚料等 ) , 每年仅农作物玉米秸秆一项就超过 117亿t 3 。玉米秸秆的主要成分是纤维素、 半纤维素及木 质素,是一种潜在的廉价生物质资源,目前我国玉米秸秆 利用率较低。玉米秸秆经过酸水解和酶水解可转化为葡 萄糖、 木糖等混合糖,同时还会形成糠醛、 羟甲基糠醛 (HMF)、 乙酸等对菌体有害的抑制物 425 。丁二酸生产菌 株(Actinobacillus succinogenesCG MCC1716)可以利用多种 单糖厌氧发酵制备丁二酸 6 ,因此利用玉米秸秆水解液作 为碳源制备丁二酸,将有效减少丁二酸发酵对淀粉原料的 依赖性,同时可降低原料成本。 本实验对玉米秸秆水解液作为碳源发酵制备丁二酸 进行了初步研究,通过考察不同脱毒方法对水解液中抑制 物的去除情况,找出一种有效的脱毒方法,提高了利用玉 米秸秆水解液发酵制备丁二酸的产量及收率。 1材料与方法 111原料 玉米秸秆水解液组分:总糖326180g/L (其中葡萄糖 180112g/L、 木糖92120g/L、 阿拉伯糖44161g/L) ,少量糠醛 及HMF(分别为1135g/L、0159g/L)。 112生产菌株 产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenesNJ113): 本实验室自主筛选。 113培养基 11311种子培养基 葡萄糖10g/L (分消 ) , 酵母膏5g/L, NaHCO310g/L, NaH2PO42H2O 916g/L, K2HPO43H2O 1515g/L, pH 710, 121 灭菌15min。 11312发酵培养基 混合糖液50g/L100g/L (分消 ) , 酵母膏10g/L,玉米 浆15g/L,富马酸二纳1g/L, K2HPO43g/L,NaCl 1g/L,MgCl2 012g/L, CaCl2012g/L,NaH2PO42H2O 116g/L,Na2HPO43H2O 0131g/L, pH 710, 121 灭菌15min。 114培养方法 种子培养: 100mL血清瓶,装液量50mL,接种量2% , 于37、180r/min摇床中培养11h。 血清瓶发酵培养:接种量3% ,摇床转速180r/min,在 37 培养。 3L发酵罐(BioFlo 110 fermenter; NBS)培养:装液量 115L,接种量7% ,于37、 搅拌转速200r/min、 通气量 015L /min条件下培养。 115分析方法 11511总糖含量的测定 采用DNS法 7 测定玉米秸秆水解液中的总糖含量。 11512菌体密度的测定 紫外可见分光光度计( Spectrumlab 752S)于波长 660 nm (OD660)处测定吸光度值。 11513糠醛、HMF的测定 采用高效液相色谱法 8 测定玉米秸秆水解液中的糠 醛及HMF含量。 11514有机酸含量的测定 采用高效液相色谱法 9 测定发酵液中丁二酸及副产 物甲酸、 乙酸的含量。 11515总糖损失率 总糖损失率= G/G0100% 式中: G为经脱毒后的玉米秸秆水解液中总糖含量; G0为未经脱毒 的玉米秸秆水解液中总糖含量。 2结果与讨论 211玉米秸秆水解液中抑制物对发酵过程的影响 分别以葡萄糖和玉米秸秆水解液作为碳源厌氧发酵制 备丁二酸,初始糖浓度均为100g/L,整个发酵过程见图1。 图1葡萄糖(A)、 玉米秸秆水解液(B)作为碳源的发酵结果 Figure11Results of fermentation with glucose(A )and corn stalk hydrolysate (B) as carbon source 研究报告 中 国 酿 造 2009年 第6期 总第207期 33 由图1结果可知,与葡萄糖作为碳源相比,玉米秸秆 水解液作为碳源的整个发酵过程菌体延滞期较长,最大菌 浓度(OD660)为6182,发酵周期延长至70h,发酵结束时残 糖较多,丁二酸收率仅为41198% (收率=丁二酸浓度/初 始糖浓度 100% ) ,降低了29167%。 玉米秸秆水解液的制备过程包括酸水解和酶水解2 个过程,其中酸水解主要作用于半纤维素,水解后生成的 戊糖、 己糖易与其他组分发生复杂的反应产生糠醛、HMF 等有害物质 10 ,从而影响糖液的质量。根据文献报道 4 , 在乙醇发酵过程中,糠醛浓度超过110g/L时对乙醇的产 量有明显的抑制作用;MARTI NEZ A等 11 指出 HMF浓度 超过019g/L时会影响乙醇的产量,并且各种抑制物之间 具有协同作用。因此,以此水解液作为碳源发酵制备丁二 酸产量低的原因可能是糠醛、HMF的含量较高,抑制了菌 体生长及丁二酸的形成。 212抑制物对菌株生长及丁二酸产量的影响 21211不同糠醛含量的影响 将高浓度糠醛溶液过滤除菌后,按不同体积添加量加 入培养基中,糠醛含量范围为0g/L118g/L,考察糠醛含 量变化对菌体生长及丁二酸产量的影响,结果见图2。 图2糠醛(A)、HMF (B)含量对发酵的影响 Figure 21Effects of furfural concentration (A) and hydroxymethylfurfural concentration (B) on fer mentation 由图2A可以看出,随着培养基中糠醛浓度的提高, 对菌体生长、 产物合成的抑制作用显著增强。糠醛含量为 112g/L时,与未添加的相比,菌体量及丁二酸产量分别下 降66118%、66168%;而培养基中糠醛含量达到115g/L时, 菌体生长完全被抑制。 21212不同HMF含量的影响 将高浓度HMF溶液过滤除菌后,按不同体积添加量 加入培养基中,其中HMF浓度范围为0g/L112g/L,考察 HMF含量变化对菌体生长及丁二酸产量的影响,结果(图 2B) 可以看出,当培养基中HMF含量为018g/L时,菌体量 及丁二酸产量分别比未添加的下降66143%、69125%; HMF含量达到112g/L时,菌体生长完全被抑制。 培养基中糠醛或者HMF的含量超过一定浓度时, 均会对菌体生长、 产物合成产生抑制作用。而玉米秸秆 水解液中糠醛及HMF的含量分别达到1135g/L、0159g/L, 因此,应对玉米秸秆水解液进行处理,以减少水解液中抑 制物的含量。 213不同脱毒方法对玉米秸秆水解液中抑制物及总糖含 量的影响 常用的脱毒方法主要有活性炭吸附法、Ca (OH)2中 和法、 真空蒸发法和离子交换树脂吸附法等 12 。其中离 子交换吸附法存在投资大、 周期长等缺点,真空蒸发法只 能除去沸点低的物质,而活性炭吸附法可降低水解液的色 素,除去一部分乙酸和糠醛;过量的Ca(OH)2可除去大部 分有害物质,且对总糖浓度影响不大。因此,实验选择活 性炭和Ca(OH)2对玉米秸秆水解液进行脱毒处理。 采用3种方法对玉米秸秆水解液进行脱毒处理以减 少有害物质。(A)加入Ca (OH)2固体将水解液的pH值 调为610,然后抽滤; (B)加入018%的活性炭, 30反应 30min后抽滤; (C)结合方法A、B对水解液进行脱毒处 理。总糖损失及抑制物的去除情况见附表。 附表 不同脱毒方法对总糖浓度及抑制物含量的影响 Attached table.Effects of treatmentmethods on the loss of sugar and the removalof inhibitors 脱毒方法 总糖/ (g L - 1) 总糖损失 率/% 糠醛/ (g L - 1) HMF/ (g L - 1) A315170314001740130 B321171115601960142 C308162515701120106 未脱毒32618011350159 由附表可知,活性炭和Ca (OH)2单独使用时,总糖 损失率较低,但是抑制物的去除效果均不是很好。而2 种方法结合使用时糠醛及HMF的去除率达到最高,分 别为91111%、89183% ,总糖损失率仅为5157%。因此,活 性炭和Ca(OH)2结合使用时对玉米秸秆水解液的脱毒效 果最好。 214不同脱毒处理方法对发酵结果的影响 分别以方法A、B、C得到的糖液作为碳源进行摇瓶发 酵,初始糖浓度选择50g/L、80g/L、100g/L,结果见图3。 34 2009 No. 6 SerialNo. 207 China B rew ing Research Report 图3不同脱毒方法对丁二酸产量的影响 Figure 31Effects of different detoxified methods on succinic acid concentration 从图3可以看出,经脱毒的玉米秸秆水解液的发酵结 果明显比未经脱毒的好,其中活性炭和Ca (OH)2联合脱 毒的效果最好。初始糖浓度为50g/L时,由于培养基中糠 醛及HMF的含量较少,脱毒与未脱毒的丁二酸产量变化 不明显;初始糖浓度为100g/L时,培养基中糠醛及HMF 的含量较高,未脱毒的丁二酸产量为44157g/L,而活性炭 和Ca(OH)2联合脱毒的丁二酸产量为65145g/L,收率为 67114% ,比未经脱毒的提高22188%。 215联合脱毒的玉米秸秆水解液作为碳源发酵产丁二酸 用活性炭和Ca(OH)2联合脱毒的玉米秸秆水解液 作为碳源在3L发酵罐上进行丁二酸发酵实验,总糖初 始浓度为100g/L,A1succinogenesNJ113合成丁二酸的过 程见图4。 图4经联合脱毒的玉米秸秆水解液的发酵结果 Figure 41Results of fer mentation from detoxified corn stalk hydrolysate 与未脱毒的玉米秸秆水解液的发酵结果相比,此时菌 体延滞期较短,最大菌体量达到9162,残糖量仅为6125g/L, 丁二酸产量和收率为66123g/L、67128% ,分别比未经脱毒 的提高24181g/L、25130%。此结果表明,由于玉米秸秆水 解液中糠醛及HMF的减少,降低了培养基中抑制物的 含量,从而解除其对菌体生长及产物合成的抑制作用,提 高了以玉米秸秆水解液作为碳源发酵制备丁二酸的产量 及收率。 3结论 培养基中糠醛或HMF的含量超过一定浓度时,均会对 菌体生长及产物合成产生抑制作用。通过采用不同方法对 玉米秸秆水解液进行脱毒处理,发现活性炭和Ca (OH)2 联合脱毒的效果最好,抑制物糠醛及HMF的去除率分别 达到91111%、89183% ,而总糖损失率仅为5157%。以脱毒 后的水解液作为碳源进行3 L罐发酵实验,初始糖浓度为 100g/L时,菌体生长延滞期较短,丁二酸产量及收率达到 66123g/L、67128%,分别比未经脱毒的提高24181g/L、25130%。 因此,以玉米秸秆水解液作为碳源发酵制备丁二酸是可行 的,并可降低发酵法制备丁二酸的生产成本,为丁二酸的 工业化生产奠定基础。 参考文献: 1 ZEIKUS J G, JA I N M K, ELANKOVAN P. 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