小麦种子纯度的分子标记检测方法.pdf

麦类作物学报 2009 ,29(1) :128 Journal of Triticeae Crops 小麦种子纯度的分子标记检测方法 3 王立新,常利芳,李宏博,葛玲玲,信爱华,高世庆,季 伟,孙 辉,赵昌平 (北京市农林科学院,北京杂交小麦工程技术研究中心,北京100097) 摘 要:为了探索一种准确评价小麦品种种子纯度的技术体系,在比对了400个小麦品种的SSR、EST2SSR 和AFLP2SCAR指纹以及对上千份种子进行纯度检测的基础上,提出了检测种子纯度的策略 : (1) 联合使用SSR、 EST2SSR和AFLP2SCAR标记检测种子纯度,并推荐了7对SSR引物、5对EST2SSR引物和3对AFLP2SCAR引 物为检测种子纯度的核心引物 ;(2) 在待测品种的种子之间比对核心分子标记位点的带型,当某(些)个体与多数个 体之间 3位点的带型不同时,方可判定为杂株。此外,本文还就如何提高种子纯度检测的工作效率、 降低检测成 本,提出了合理利用核心引物和合理混合DNA样品的方法。 关键词:普通小麦;种子纯度;分子标记 中图分类号:S512. 1 ; S330 文献标识码: A 文章编号:100921041(2009)0120001208 Method of Wheat Seeds Purity Testing by Molecular Markers WANGLi2xin , CHANGLi2fang, LI Hong2bo, GE Ling2ling, XIN Ai2hua , GAO Shi2qing, JI Wei, SUN Hui, ZHAO Chang2ping (Beijing Engineering and Technique Research Center for Hybrid Wheat , Beijing 100097 , China) Abstract : Seed purity is an important criterion of wheat (Triticum aestivumL. ) seed quality. A precise testing method can estimate seed quality accurately. After comparing DNA fingerprints of 400 cultivars and testing seed purity for more then 1 000 wheat cultivars , we recommended a method to test wheat seed purity using molecular markers , including seven pairs of SSR primers , five pairs of EST2SSR primers and three pairs of AFLP2SCAR primers as core primers. According to differences of DNA pattern of core marker loci and genetic similarity between 400 cultivars , three or more than three differences of DNA pat2 tern of core marker loci among individuals of tested sample could be an index to differentiate wrong seed from tested cultivar. To save money and time in the test , here , reasonable primers using and DNA sample mixture were recommended. The result will be benefit for the test of wheat seed purity. Key words : Common wheat ; Seed purity ; Molecular marker 种子纯度是评价小麦种子质量的重要指标之 一,国家标准规定小麦良种的纯度应达到99 % 1 。 目前我国采用的小麦种子纯度检测方法分为组织化 学鉴定法、 幼苗鉴定法、 田间鉴定法和籽粒醇溶蛋白 鉴定法 2 。这些方法在小麦种子纯度和品种一致 性的检测中起着重要作用,但是这些方法都有一定 的缺陷或局限性。组织化学法是凭借苯酚和氢氧化 钠与种子各组织发生的颜色反应,根据种子间颖果 和种皮着色差异区别杂株的种子,而小麦品种之间 种子组织对染料的反应差异不大,很难以此鉴定种 子纯度。幼苗鉴定法是根据幼苗叶鞘颜色辨别杂 株,而幼苗叶鞘颜色只有紫色和绿色两种,如果杂株 与测试品种幼苗叶鞘颜色一致,则无法辨别杂株。 田间鉴定法是根据国标 植物新品种特异性、 一致性 和稳定性测试指南 普通小麦( GB/ T 19557. 22 2004) 3 ,对测试品种全生育期2556个重要表型 和农艺性状进行一致性测试,需要一定面积的田间 试验,试验周期较长。又因有些农艺性状为数量性 状,株间差异往往为连续数据,而且容易受环境因素 影响,降低了测试结果的准确性。籽粒醇溶蛋白鉴 3收稿日期:2008207207 修回日期:2008210215 基金项目:北京市农业育种基础研究创新平台项目( YZPT012 06) 。 作者简介:王立新(1953 - ) ,女,研究员,主要从事小麦分子遗传育种研究。E2mail : wanglx53 263. net 通讯作者:赵昌平(1962 - ) ,男,研究员,主要从事杂交小麦遗传育种研究。E2mail : BJ HWC2003 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 定法是依靠凝胶电泳技术展现品种间的醇溶蛋白亚 基带型的差异而判断种子纯度。与前三种方法相 比,此法分辨率较高,检测速度快。但因醇溶蛋白的 所有组分在一块凝胶中电泳分离,没有足够的空间 展示所有组分,使该技术灵敏度大打折扣。类似问 题也存在于其他作物种子纯度的检测中。鉴于这种 状况,采用分子标记检测种子纯度的研究在玉米4、 甜菜5、 大豆6、 番茄7、 小麦8、 水稻9等各种作物 上陆续开展。 在用于种子纯度检测的分子标记中,SSR(Sim2 ple sequence repeats) 6 , 8210和 AFLP ( Amplified fragment length polymorphism) 4 标记最为常用, 其次是RAPD ( Randomly amplified polymorphic DNA )标记 11 。以往的研究中,研究者只是采用 一种分子标记从事种子纯度检测的研究,而每种分 子标记均具有某些缺陷。例如,农作物的SSR在基 因组中占50 %70 % ,每个品种的SSR位点中约 1 %5 %为非纯位点,由于该标记灵敏度高,检测种 子纯度时,很容易检测到非纯位点而干扰检测结果。 AFLP标记的主要缺陷是成本较高,实验步骤较多, 所需时间较长。RAPD标记的分析方法虽然经济快 速,却因重复性较差,必须做重复实验才能获得准确 的结果。此外,种子纯度的检测极易受到品种本身 DNA非纯位点的干扰。在一个品种的单株之间,可 以检测到两种基因型及两种基因型杂合子的位点被 称为DNA非纯位点。该位点的两种基因型分别来 自父母本,是父母本的杂合子在后代中分离所致。 由于非纯位点在单株之间也呈现出带型差异,有些 采用分子标记检测品种一致性的研究,将品种的种 子纯度与DNA位点纯合度混为一谈,混淆了两种 不同性质的现象5 ,12214。基于此,本文提出了联合 使用SSR、EST2SSR ( Expressed sequence tags2 simple sequence repeats)和AFLP2SCAR (Ampli2 fied fragmentlength polymorphism2sequence characterized amplified region)标记检测种子纯度 的策略,并推荐了15对核心引物;确立了判断杂株 的标准,提出了区别杂株和DNA非纯位点的方法; 并对提高检测工作效率、 降低检测成本、 合理利用核 心引物和合理混合DNA样品提出了建议。 1 材料与方法 1. 1 材料 本研究所用小麦品种400个,其中,2005 - 2006 年度和2006 - 2007年度国家冬小麦区域试验品种 280个,国家级审定品种120个,分别来自于北京、 河北、 河南、 山西、 山东、 陕西、 江苏、 四川、 安徽、 云南 和甘肃。共使用了SSR引物63对、EST2SSR引物 21对、 本中心开发的AFLP2SCAR引物21对15。 1. 2 方法 1. 2. 1 DNA提取 采用简化CTAB法16提取小麦品种DNA。 1. 2. 2 PCR反应 PCR反应体系为10L ,含有10buffer 1. 0 L , 10 molL - 1 dNTP 0. 2L ,模板DNA (10 ng/L)3. 0L ,引物(1. 25molL - 1) 2. 0 L , Taq DNA聚合酶(2 U/L) 0. 25L ,超纯水3. 55 L。10buffer、dNTP和Taq DNA聚合酶为北京 鼎国生物技术有限责任公司的产品。PCR反应程 序为94 预变性5 min ,94DNA变性30 s ,退火 1 min(表5) ,72 延伸30 s ,循环 34或44次,72 延伸5 min ,4 保存。 1. 2. 3 PCR产物的分离 10L的PCR产物中加入2L上样缓冲液, 在94 变性5 min后,取5L加入6 %聚丙烯酰胺 变性凝胶中,以2 000V电压电泳。凝胶染色为简化 硝酸银染色法16。 1. 2. 4 DNA指纹遗传相似系数的计算 遗传相似系数GSij= 2Nij/ ( Ni+Nj ) , N ij为两 品种相同带型的DNA位点数目,Ni、Nj分别为两 品种相比对的DNA位点总数。 1. 2. 5 小麦品种农艺性状考察 按国标 植物新品种特异性、 一致性和稳定性测 试指南 普通小麦 的标准考察遗传相似系数 8. 0 的品种的株高、 株型、 叶形、 穗型、 芒性、 粒色、 粒质、 抽穗期以及主要产量性状,每个品种考察50株。 2 结果与分析 2. 1 判断杂株的标准 利用分子标记检测种子纯度,是通过比对待检 品种种子间分子标记的异同来鉴别杂株的。因此, 需要确定比对多少个DNA位点,以及几个位点不 同便可确认为杂株。笔者采用1521个PIC值 (Polymorphism information content ,多态性信息 量)大于0. 7的SSR核心标记,对280个国家冬小 麦区域试验品种以及120个国家级审定品种进行了 SSR分析,比对了上述400个品种1521个SSR 标记位点的带型,其中所有位点带型相同的品种14 对,1个位点不同的13对,2个位点不同的11对,3 个位点不同的15对,4个位点不同的品种未作统 计。随后,为以上53对品种又比对了50100个 2麦 类 作 物 学 报 第29卷 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. DNA位点,其中除SSR标记外还采用了EST2SSR 和AFLP2SCAR标记,根据比对结果计算遗传相似 系数,结果表明,品种间遗传相似系数(GS)随着品 种间核心标记差异的增加而降低(表 1) 。 表1 53对品种的遗传相似系数(GS) Table 1 G enetic similarity of 53 pairs of cultivars 两品种间带型不 同的位点数目 Loci number of different DNA pattern between two cultivars 品种(对) Cultivars (pair of cultivars) GS平均数 Average of GS GS范围 Range of GS GS0.90 的品种(对) Pair of cultivars withGS0. 90 GS = 0.910. 97 的品种(对) Pair of cultivars withGS= 0. 910.97 GS0. 98 的品种(对) Pair of cultivars with GS0.98 3150. 810. 660. 951410 2110. 890. 760. 98731 1130. 920. 840. 99562 0140. 980. 931. 00059 表2 GS0. 98的品种的农艺性状表现 Table 2 Agronomic characters of cultivars withGS0. 98 品种名称 Cultivar 遗传相似系数 Genetic similarity 株高 Plant height (cm) 穗长 Spike length (cm) 穗型 Spike model 芒 性 Awn 小穗数 Spikelet number 穗粒数 Grain number per spike 千粒重 10002grain weight 丰优3号 Fengyou 30. 9971. 09. 6棒状Stick长Long21. 348. 4- 安麦5号 Anmai 571. 99. 5棒状Stick长Long20. 948. 5- 沧麦119 Cangmai 1190. 9974. 19. 9纺锤Spindle长Long20. 434. 237. 2 科麦1号 Kemai 172. 89. 9纺锤Spindle长Long19. 338. 138. 8 西峰20 Xifeng 200. 98107. 79. 4纺锤Spindle长Long20. 143. 338. 0 宁麦5号 Ningmai 5105. 79. 0纺锤Spindle长Long19. 640. 737. 0 石03Y119 Shi 03Y1191. 0072. 810. 0纺锤Spindle短Short21. 456. 030. 8 石4185 Shi 418575. 79. 9纺锤Spindle短Short20. 652. 531. 2 品种名称 Cultivar 粒质 Grain texture 粒色 Grain color 粒型 Grain shape 株型 Plant shape 苗期Seedling成株Adult lant 叶型 Leaf 长度 Length 宽度 Width 抽穗期 (日/月) Heading date (day/ month) 丰优3号 Fengyou 3硬质Hard红Red长圆Long直立Endlong紧凑Compact中Middle宽Wide4/ 5 安麦5号 Anmai 5硬质Hard红Red长圆Long直立Endlong紧凑Compact中Middle宽Wide4/ 5 沧麦119 Cangmai 119硬质Hard红Red卵形Egg半直立Endlong紧凑Compact长Long中Middle3/ 5 科麦1号 Kemai 1硬质Hard红Red卵形Egg半直立Endlong紧凑Compact长Long中Middle3/ 5 西峰20 Xifeng 20硬质Hard白White卵形Egg半匍匐Grovel半松散Relax中Middle中Middle2/ 5 宁麦5号 Ningmai 5硬质Hard白White卵形Egg半匍匐Grovel半松散Relax中Middle中Middle2/ 5 石03Y119 Shi 03Y119硬质Hard红Red卵形Egg半直立Endlong紧凑Compact中Middle中Middle30/ 4 石4185 Shi 4185硬质Hard红Red卵形Egg半直立Endlong紧凑Compact中Middle中Middle30/ 4 比较了400个品种之间的DNA指纹遗传相似 系数(GS)和主要农艺性状,GS0. 90的品种间多 个性状存在显著差异,GS在0. 910. 97之间的品 种间相同性状较多,相似性较高,GS0. 98的品种 间只有微弱差异或没有显著差异(表 2) 。国标 植 物新品种特异性、 一致性和稳定性测试指南 普通小 麦 规定:“测试品种质量性状有一个性状或数量性 状有两个及两个以上性状与近似品种达到差异,即 可判定测试品种与近似品种具有特异性” 。据此,当 两品种的GS0. 90时,则两品种互为不同品种。表 1表明,两品种间3个核心标记带型不同的15对品 种中,GS多小于0. 90。其中小于0. 70的2对,小 于0. 80的4对,小于0. 90的8对,1对的GS= 0. 92。GS为0. 92的品种为洛旱7号和洛旱9号, 两品种千粒重分别为38 g和45 g ,抽穗期相差1 d , 洛旱7号的株型为紧凑型,洛旱9号略松散。两品 种千粒重差异显著、 株型和抽穗期略有差异,可以判 定互为特异。由此证明,表1中品种间3个核心标 记带型不同的15对品种间均互为特异。为此,采用 少于或等于21个核心标记检测某品种种子纯度时, 如某个体的3个或3个以上DNA位点与多数个体 不同,该个体则被视为杂株。 表1品种间12个核心标记带型不同的品种 24对,3对品种的GS0. 98 ,9对品种的GS在0. 91 3第1期 王立新等:小麦种子纯度的分子标记检测方法 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 0. 98。通过农艺性状和表型比较,多数GS0. 98 的品种间无特异性,GS= 0. 910. 97的各对品种 中,也有极为相像的品种。例如良星99和984121 的GS为0. 94 ,两品种的株高略有差异,其他农艺性 状无显著差异(表 3) 。所以,采用少于或等于21个 核心标记检测某品种种子纯度时,该品种某(些)个 体的12个标记与多数个体不同,尚不能判定为杂 株。只有在个体之间比对至少30个高PIC值的分 子标记,当某(些)个体与多数个体之间 3位点的 带型不同时,方可判定为杂株。 表3 良星99和984121农艺性状对比 Table 3 Comparison between wheat cultivars Liangxing 99 and 984121 品种 Cultiver 苗期 Seedling 株型 Plant model 叶型 Leaf 长度 Length 宽度 Width 成株期 Adult plant 株型 Plant model 叶型 Leaf 长度 Length 宽度 Width 旗叶 Flag leaf 叶色 Leaf color 株高 Plant height (cm) 良星99 Liangxing 99 半直 Endlong 长 Long 中等 Middle 半松散 Relax 中等 Middle 宽 Wide 直挺 Endlong 深绿 Dark green 72. 8 984121 半直 Endlong 长 Long 中等 Middle 半松散 Relax 中等 Middle 宽 Wide 直挺 Endlong 深绿 Dark green 76. 7 品种 Cultiver 抽穗期(日/月) Heading date (day/ month) 穗型 Spike model 芒性 Awn 穗长 Spike length (cm) 每穗 小穗数 Spikelet number 每穗粒数 Grain number per spike 粒型 Grain model 粒色 Grain color 粒质 Grain texture 良星99 Liangxing 99 1/ 5 纺锤 Spindle 长 Long 10. 019. 948. 60 椭圆 Sllipse 白 White 硬质 Hard 9841211/ 5 纺锤 Spindle 长 Long 9. 520. 152. 50 椭圆 Sllipse 白 White 硬质 Hard 表4 用于种子纯度检测的分子标记 Table 4 Molecular markers for testing wheat seed purity 引物名称 Primer 引物类型 Primer category 染色体位置 Chromosomal location 检测位点数 Loci number PIC 退火温度 Annealing temperature 引物序列 Primer sequence 53 cf d65SSR1BL/ 1DL/ 2DS40. 7065 AGACGATGAGAAGGAAGCC ACCTCCCTTGTTTTTGGGATT wms339SSR2AS20. 8250 AATTTTCTTCCTCACTTATT AAACGAACAACCACTCAATC barc91SSR4DL10. 80 Touch down 6555 TTCCCATAACGCCGATAGTAGC GTTTAATATTAGCTTCAAGATCAT cf d29SSR5DL10. 85 Touch down 6555 GGTTGTCAGGCAGGATATTTG TATTGATAGATCAGGGCGCA wms334SSR6DS20. 7650 AATTTCAAAAAGGAGAGAG AAACATGTGTTTTTAGCTATC cf d21SSR1D/ 7D40. 65 Touch down 6555 CCTCCATGTAGGCGGAAATA TGTGTCCCATTCACTAACCG wmc388SSR 5AL/ 7AS/ 3AL/ 3AL 40. 63 Touch down 6555 TGTGCGGAATGATTCAATCTGT GGCCATTAGACTGCAATGGTTT swes131EST2SSR1A10. 77 Touch down 6555 GGTGATGCGGCAACAATGG CACTCAGGTGGAACAAAC ksum62EST2SSR4B10. 78 Touch down 6555 GGAGAGGATAGGCACAGGAC GAGAGCAGAGGGAGCTATGG cwem40EST2SSR5A10. 71 Touch down 6050 TAGCACCAGGCTTGACCAGT GGACCAAAGCCAAAAACAAA cnl138EST2SSR6A10. 85 Touch down 6555 ACAACCGCAAACACAGCATG CTGCAATACTTGTGAGCTTTC wes209EST2SSR7B10. 63 Touch down 6555 AAGTCCACATTTCAACCCTG GTTTCACCTCTAGCCTACCC bhw5SCAR1B10. 5060 AGGCAGCCCACATGAATAA TGGACAGCACCTCACAACT bhw120SCAR4A30. 5060 TGCCAACCATTCTCTGCTC GGCTGTTTGTCCCTGTGTTA bhw171SCAR 未定位 Unknown 40. 5058 CTGGCTGCTCTAACCAAAC GCACCGTTGAGAATGCTA 4麦 类 作 物 学 报 第29卷 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 2. 2 小麦种子纯度检测中核心分子标记的筛选 SSR标记具有多态性高、 重复性稳定、 试验成 本低廉等优点,但因SSR为基因序列之外的DNA , 少数品种间的核心SSR标记没有差异,增加EST2 SSR和AFLP2SCAR标记之后却检测到了品种间 的差异。EST2SSR为基 因表 达 区的 重复 序 列 DNA ,AFLP2SCAR标记为非重复序列DNA ,其中 也有EST 15 ,为此,选择三种标记中PIC值高的标 记作为检测种子纯度的核心标记,可更加有效地检 测种子纯度。本研究比较了PIC值较高的63对 SSR引物、21对EST2SSR引物和21对AFLP2 SCAR引物与400个小麦品种的扩增产物,根据多 态性高、 带型清晰、 分布于不同染色体的原则,筛选 出7对SSR引物、5对EST2SSR引 物和3对 AFLP2SCAR引物为检测种子纯度的核心引物(表 4) ,以上引物均具有较高的PIC值,并且带型清晰 (图1图3) ,重复性稳定,检测DNA位点31个, 可以满足检测种子纯度的需要。 图1 SSR引物cf d65的带型 Fig. 1 Pattern ofSSRprimercf d65 图2 EST2SSR引物ksum62的带型 Fig. 2 Pattern of EST2SSR primerksum62 2. 3 检测种子纯度的快捷方法 2. 3. 1 混合DNA样品 国标 农作物种子检验规程 真实性和品种纯度 鉴定( GB/ T 3543. 521995)规定,种子纯度检测需 以100粒种子为样品,为了减少试验成本,笔者首先 将100粒种子的DNA合并为若干混合样本,检测 样本之间DNA位点的一致性,对于某位点表现出 杂合带型的样本,用该位点的分子标记检测样本中 各个个体的一致性,找出与多数个体带型不同的 个体。 图3 AFLP2SCAR引物bhw120的带型 Fig. 3 Pattern of SCAR primerbhw120 5第1期 王立新等:小麦种子纯度的分子标记检测方法 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 为了确定混合样本中个体DNA份数,将北农6 号和燕大1817两个品种的种胚粒数按100、9 1、82、73、64、55、46、37、28、19、0 10的比例混合提取DNA ,分别记作样1样11 , 用两品种间具有多态性的5对SSR引物(表5) ,对 11个样本进行PCR扩增,在6 %的聚丙烯酰胺变性 凝胶上分离PCR产物,每对引物所扩增的多数产物 表现为两品种的杂合带型(图 4) 。但随着两品种在 各个样本中比例的改变,其PCR产物中两品种的带 纹清晰度也随之逐渐加强或减弱(表5和图 4) 。结 果表明,在一个样本中只要某品种所占比例达到 20 % ,两品种间多态性的位点的带型将表现为两品 种的杂合带型。所以,当检测到测试品种和杂株的 多态性位点时,只有混合样本中的杂株达到20 % 时,杂株的带型才能清晰可见。据此认为5粒种胚 的DNA合并为1个混合样本最为合理。只要该样 本中有1个杂株,当检测到测试品种和杂株的多态 性位点时,因杂株与测试品种的带型不同,该样本此 位点的带型将表现为测试品种与杂株的杂合带型, 再用此位点的分子标记检测5个单株,便可找出与 另4株带型不同的单株。 例如,在对郑麦005进行种子纯度检测时,笔者 以每5份DNA等体积混合的方法,将100份DNA 样品混合成20个DNA样本。用表5中分子标记 检测20个样本的一致性,样本1的4个位点显示出 杂合带型,如图5a所显示的SSR位点Xbarc91。 在该位点上,样本1表现为杂合带型,为此,用 barc91检测了样本1中的5个个体,说明第1个个 体的带型与其他个体不同(图 5b) 。在另3个位点 上,个体1也与其他个体不同,因此确认第1个个体 为杂株。按上述方法将100粒种子的DNA合并为 20个混合样本,使工作量减少了4/ 5 ,即使发现一些 样本的部分位点为杂合带型,也只需要采用这些位 点的分子标记检测有问题样本的个体,远比对100 粒种子进行检测节省时间和成本。 表5 11个样本的带纹清晰程度 Table 5 DNA band clarity of 11 samples 引物 Primer 品种 Cultivar 样本编号 No. of sample 1234567891011 barc121北农6号 Beinong 6CCCCCCCWWBN 燕大1817 Yanda 1817NWCCCCCCCCC barc32北农6号 Beinong 6CCCCCCCWBNN 燕大1817 Yanda 1817NNWCCCCCCCC gwm294北农6号 Beinong 6CCC-CCCWBNN 燕大1817 Yanda 1817NNB-CCCCCCC gdm72北农6号 Beinong 6CCCWWWWBBNN 燕大1817 Yanda 1817NNBWWWWWCCC gwm639北农6号 Beinong 6CCCWWWBBBNN 燕大1817 Yanda 1817NWCCCCCCCCC C:清晰,W:减弱,B :模糊,N :无带纹, - :无数据。 C: clear , W: weak , B : blurring , N : no band , - : No data. a : SSR位点Xbarc121的带型;b: SSR位点X gwm639的带型;111 :两个品种的种胚粒数按100、91、82、73、64、55、4 6、37、28、19、010比例混合的11个样品。 a : Electrophoretogram of SSRXbarc121 ; b : Electrophoretogram of SSRX gwm639 ; 111Embryo DNA samples of two cultivars mixed by the ratio of 100、91、82、73、64、55、46、37、28、19、010. 图4 北农6号和燕大1817混合DNA样本的SSR带型 Fig. 4 SSR patterns of mixed DNA samples from Beinong 6 and Yanda 1817 2. 3. 2 鉴别杂株的首选引物 表4中共列出15对引物,其中cf d65、cf d21、 wmc388和bhw171均可检测4个位点,bhw120可 以检测3个位点,共19个位点。在进行种子纯度检 6麦 类 作 物 学 报 第29卷 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 测时,可先用这5对引物,如19个位点的结果仍不 能确定杂株,再采用表5中其他引物。本研究曾采 用SSR引 物wmc388、cf d21和SCAR引 物 bhw120 ,检测了扬麦13混合样的11个DNA位点, 发现混合样本1的wmc3882c、bhw1202a位点和 cf d212b、d位点为杂合带型,用3对引物检测了混 合样1中的5个个体,证明4号个体的wmc3882c 位点、bhw1202a位点和cf d212b、d位点的带型与其 他个体不同,11个位点中4个位点的带型与多数个 体不同,被判定为杂株(图 5) 。近两年,在检测小麦 种子纯度时,笔者仅采用了表5中引物cf d65、 cf d21、wmc388、bhw171和bhw120 ,完成了绝大多 数品种的纯度检测,例如对扬麦13的检测仅用了其 中3对引物。因此,将这5对多位点引物作为小麦 种子纯度检测的首先引物,既提高检测效率又降低 了检测成本。 a : 20个DNA混合样本的带型,120为样本编号。b :样本1中5个个体的带型,15为个体编号。 a : Patterns of SSR locusXbarc91 of 20 mixed DNA samples. 120 are numbers of 20 samples. b : Patterns of SSR locusXbarc91 of 5 in2 dividuals. 15 are numbers of individuals. 图5 郑麦005种子纯度检测时SSR位点Xbarc91的带型 Fig. 5 Patterns of SSRlocusXbarc91 for wheat cultivar Zhengmai 005 seeds purity testing a :wmc388 c位点的带型;b:bhw120 a、b位点的带型,箭头所指为b位点;c :cf d21 b、c位点的带型,箭头所指为b位点;d:cf d21 d位点的 带型;110 :扬麦13的10个个体。 a : SSR locuswmc388 c; b: SCAR locibhw120 a and b. The upper band is locusbhw120 b; c: SSR locicf d21 b and c. The upper band is locuscf d21 b; d: SSR locicf d21 d. 110 : 10 individuals of Yangmai 13. 图6 扬麦13四个位点的DNA标记带型 Fig. 6 DNA patterns of four loci in wheat cultivar Yangmai 13 3 结论与讨论 随着分子标记分析技术不断简化和有关仪器、 试剂的国产化,其试验成本大幅度下降,完成1个品 种纯度检测的试验成本仅需500元左右,测试时间 56 d。与醇溶蛋白法相比,测试时间多1 d ,成本 不相上下,但分子标记遍布小麦整个基因组,多态性 高、 数量丰富;分析技术灵敏度高,可以区别具有1 bp之差的带型,因此检测结果的可靠性高于醇溶 蛋白。 种子纯度检测除用于检测商用种子的质量以 外,进行DNA指纹分析的种子或DNA样品也需要 进行纯度检测。DNA指纹反应了一个品种若干特 异性分子标记的基因型,一旦待测品种中混入杂株, 便将杂株的基因型带入待测品种的群体,如不剔除 杂株,很可能造成指纹的错误。目前用于DNA指 纹分析的取样方法主要为两种:一种是随机取几粒 待测品种的种子,提取混合DNA ;另一种只随机取 1粒待测品种的种子,提取该单株的DNA。本研究 结果表明,在一个含有2个品种的样本中,只要某品 种所占比例 20 % ,两品种间多态性的位点将表现 为两品种的杂合带型。有些引物还可以扩增出含量 7第1期 王立新等:小麦种子纯度的分子标记检测方法 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 仅10 %的异源DNA ,例如上面提到的SSR引物 barc121和gwm639 ,可呈现出北农6号和燕大 1817以91混合样中燕大1817的带型。如果随 机取的几粒种子中有1个杂株,将影响待测品种与 杂株间多态性位点DNA带型的判断。而只取1粒 种子,又难免取到杂株的种子,造成DNA指纹的更 大错误。为此在进行DNA指纹分析之前,必须检 测种子纯度,利用剔除杂株之后的DNA样品才能 构建正确的DNA指纹。实验人员可随机取1520 粒待分析品种的种子,按本文的方法剔除杂株或错 误的DNA样品。 品种的DNA位点不纯和种子混杂是性质不同 的两种现象。DNA非纯位点是因双亲的杂合位点 在后代中不断分离所形成的,而种子不纯是因为引 入了杂株。在检测小麦种子纯度时不应将两种现象 混为一谈,如果将DNA位点不纯所造成的株间带 型差异归于种子混杂,将会增加被测品种种子混杂 的比例,甚至将没有杂株的品种误判为种子混杂。 非纯位点在不同单株间有三种DNA带型,一种为 母本型,另一种为父本型,第三种为父母本的杂合 子,具有父母本带型的个体之比一般符合11或接 近11 ,第三种基因型的个体所占比例较小。当单 株的某位点呈现为两种带型以及两种带型的杂合带 型时,可判定该位点为非纯位点。虽然非纯位点也 可造成的株间差异,但并非少数或个别个体与多数 个体在多位点不同,而是两种基因型以11或接近 11的比例分布于群体中,采用本文判定杂株的方 法,可以有效地将两种现象加以区别。 综上所述,用分子标记检测小麦种子纯度的方 法如下:将待测的种子浸种发芽后,分别提取每粒种 子的DNA ,获得100份DNA样品。每5份DNA 等体积混合,分别编号为:15、610、1115 96100。采用5对首选引物,检测每个样本DNA 位点一致性,如某混合样的某位点呈现杂合带型,说 明样本内的个体间带型不同,需用该位点的分子标 记检测样本中各个个体,确定与多数个体带型不同 的个体。当某个体3个或3个以上位点的DNA带 型与其他个体不同时,可判定为杂株。如果仅12 个位点的带型出现异常,必须采用表5中其他引物 增加检测位点加以确认。在增加的位点中再次发现 异常带型,使其异常带型的位点 3 ,方可判定为 杂株。 本研究结果证明,采用分子标记检测小麦种子 纯度是在基因组水平上检测品种的一致性,与形态 标记和生化标记相比,具有准确、 快速、 经济的优势。 归纳本研究的结果为三点 : (1) 提出了联合使用 SSR、EST2SSR和AFLP2SCAR标记检测种子纯度 的策略,并推荐了7对SSR引物、5对EST2SSR引 物和3对AFLP2SCAR引物为检测种子纯度的核 心引物 ;(2) 提出了杂株判断标准,既在待测品种的 种子之间,比对核心分子标记位