课件：蛋白质讲解.ppt

,第三章 蛋白质 Proteins,生物化学,一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的分子大小与形状 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 四、蛋白质分离纯的一般原则 五、蛋白质混合物的分离方法 六、蛋白质含量的测定与纯度鉴定,第六节 蛋白质的分离纯化 p290,蛋白质与氨基酸相似，也具有两性电离的性质。蛋白质的多肽链含有末端氨基和羧基，一些侧链上含有可解离的基团，有的可以接受氢离子，有的可以电离出氢离子，因此蛋白质具有酸碱两性电离的性质。它的两性电离比氨基酸复杂。 对某一蛋白质而言，在某一pH下，当它所带正负电荷相等的时候，该溶液的pH就称为该蛋白质的等电点。 蛋白质的等电点的大小与蛋白质的氨基酸组成有关。,一、蛋白质的两性电离和等电点,蛋白质溶液有许多高分子溶液的性质，如：扩散慢、易沉降、 粘度大、不能透过半透膜，在水溶液中可形成亲水的胶体，具有丁达尔现象。 蛋白质胶体溶液的稳定因素：水化膜、带电荷。当破坏这两个因素时，蛋白质中从溶液中析出而产生沉淀。,二、蛋白质的高分子性质,使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀，方法有：,1. 盐析：在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸胺、氯化钠、硫酸钠等，使蛋白质从溶液中析出，称为蛋白质的盐析。而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。 盐析的机理：破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。 盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。,三、蛋白质的沉淀作用,2.有机溶剂沉淀法：在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。 有机溶剂沉淀法的机理：破坏蛋白质的水化膜。 有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。,3.重金属盐沉淀（条件：pH 稍大于pI为宜）：在蛋白质溶液中加入重金属盐溶液，会使蛋白质沉淀。 重金属沉淀法的机理：重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。 重金属沉淀蛋白质会使蛋白质产生变性，长期从事重金属作业的人应多吃高蛋白食品，以防止重金属离子被机体吸收后造成对机体的损害。,三、蛋白质的沉淀作用,4.生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI） 生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物碱试剂沉淀蛋白质的机理：在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 “柿石症”的产生就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的单宁酸，使肠胃中的蛋白质凝固变性而成为不能被消化的“柿石”。,5.弱酸或弱碱沉淀法：用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。 弱酸或弱碱沉淀法机理：破坏蛋白质表面净电荷。,1.蛋白质变性的概念：天然蛋白质受物理或化学因素的影响后，使其失去原有的生物活性，并伴随着物理化学性质的改变，这种作用称为蛋白质的变性。,2.使蛋白质变性的因素 1）物理因素：高温、高压、射线等 2）化学因素：强酸、强碱、重金属盐、去污剂等,3.变性的本质： 分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧密有序的 状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。,四、蛋白质的变性作用、结絮和凝固,4.蛋白质变性后的表现： 1）生物学活性消失 2）理化性质改变：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增 加，侧链反应增强，对酶的作用敏感，易被水解。,五、蛋白质的颜色反应,蛋白质的颜色反应主要与其定性、定量测定有关： 1.茚三酮反应：2.双缩脲反应：3.酚试剂反应：,六、蛋白质的紫外吸收特征,蛋白质溶液能在近紫外区（280nm处）有光吸收： 色（Trp）酪（Tyr）苯丙（Phe）。,蛋白质的变性作用、结絮和凝固,纯化的实质：增加制品的纯度或比活性,五、蛋白质的分离纯化的一般原则,1、粗分级（rough fractionation) 一般用选择性沉淀法。 （NH4）2SO4分级沉淀法（盐析） 等电点选择性沉淀法 有机溶剂分级沉淀法 热处理选择性沉淀法 生物碱或三氯乙酸选择性沉淀法,五、蛋白质的分离纯化的一般原则,2、细分级（fine fractionation) 透析除盐 sephdex G-25凝胶过滤除盐 层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水层析（反相HPLC） 电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳等）、盘状电泳、等电聚焦、双向电泳 密度梯度离心,根据分子大小 根据蛋白质的溶解度 根据电荷差异 选择性吸附分离（物理吸附） 根据配体特性异性分离（亲和层析）,六、 分离纯化蛋白质的主要方法 p301,测分子量的方法： 化学组成法测定最低分子量 SDS-PAGE法 凝胶过滤法 渗透压法 扩散系数法 沉降系数法和沉降平衡法,(一）、蛋白质的大小与形状,1. 根据分子组成测定最小分子量 p291 如肌红蛋白含0.335%的铁 Fe分子量 55.8 最小M Fe(%) = 0.335 =16700 (实为16900马心) 牛血清白蛋白含Trp0.58% 最低M=35200，实际为69000，含2个Trp,*100,测分子量的方法,2、 葡聚糖凝胶过滤法分析蛋白质分子量 p297-298,测分子量的方法,交联葡聚糖（Sephadex）; 聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P ，） 琼脂糖凝胶（Sepharose，Bio-Gel A）,柱床体积 Vt=Vo+Vi 洗脱体积 Ve=Vo+kdVi,当kd=0时，Ve=Vo，溶质全从Vo出来， 无分配。 当kd=1时，Ve=Vo+Vi，溶质全进筛子，各物质尽管有分配，但各物质不能分开。 当0kd1时，Ve=Vo+kdVi,各溶质具不同分配，得以分离,p298,交联葡聚糖（Sephadex）,3 .据pr的渗透压 p292,用一半透膜将pr溶液与纯水隔开，当渗透达平衡时，测定其渗透压，计算分子量：,C：浓度（克/升） R：气体常数（0.082升/大气压/克分子/K开氏温度） T：绝对温度（开氏温度） ：以大气压表示的渗透压,测分子量的方法,半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）。,施以一定的压力使小分子溶质通过一半透膜，而按半透膜的筛孔大小截留相应的蛋白质分子,4.SDSPAGE p298 （十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳）,测分子量的方法,极性头部,非极性尾巴,SDS 是一种表面活性剂,sodium dodecyl sulfate,Stryer (1995) Biochemistry (4e) p.275,沉降的速度与颗粒的重量、密度和形状有关。离心后按其沉降的速度不同，彼此分开形成区带。再进行光学定位，针刺或冰冻切片采样分析,蔗糖密度梯度 聚蔗糖密度梯度,测分子量的方法,5. 沉降分析法,蔗糖 浓度 0.25M 1.00M 2.00M 0.50M 加液层,由于颜色的显著不同，可以非常容易地识别螺旋藻光合作用色素：样品层上部为黄色的胡萝卜素层，下部是绿色的叶绿素层，蔗糖浓度为0.25 M的区带最上端是少量的天蓝色(淡蓝色)的游离状态的异藻蓝蛋白，0.25 M层的大部分为蓝色的藻蓝蛋白,是自藻胆体脱落下来的藻蓝蛋白的“杆”的片段，有时可延伸分布至0.5M层的上端。1M层是蓝紫色的藻胆体层。,p295 ,沉降系数: 把10-13秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位，或沉降系数单位，用S（大写）表示。,1、等电点沉淀 P305 在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大 在pI时，分子电荷为零，蛋白质分子间的静电排斥消失，从而蛋白质出现聚集沉淀 2、蛋白质的盐溶与盐析 P305 盐溶：低盐浓度时，蛋白质溶解度，称盐溶。 盐析：高盐浓度时，使pr溶解度析出，称盐析。 盐析多用溶解度大的中性盐，如(NH4)2SO4、NaCl、MgCl2、NH4Cl、KCl等的饱和溶液,(二）、根据溶解度差异的分离：选择性沉淀法,1、电泳和等电聚焦法： 普通电泳、等电聚焦、双向电泳、脉冲电泳、毛细管电泳 从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳 从装置上分：圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。 从支持物分：自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、凝胶电泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等）,（三） 根据电荷性质的差异: P307-312,等电聚焦电泳法可测定蛋白质pI,2D gel in proteomics,2、离子交换层析法：P310 离子交换纤维素： 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖：,交联葡聚糖离子交换剂,P310 表7-6,阴离子,阳离子,极 性：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键） 最广泛最有效：羟基磷灰石（hydroxyapatite)，即结晶磷酸钙Ca10（PO4）6（OH）2，可分离蛋白质、核酸，与DNA的亲和力最高。 非极性：苯基琼脂糖、辛基琼脂糖（范德华力、疏水作用） 根据疏水性的差异：疏水层析和反相HPLC,（四）根据选择性吸附的差异：吸附层析法,亲和层析(affinity chromatography)：是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，也即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。 免疫亲和层析 凝集素亲和层析 金属螯和层析 染料配体层析,（五） 配体亲和力的差异 ： 亲和层析,亲和层析,七、蛋白制品的含量分析、纯度鉴定 与活性分析 p315,（一）、含量分析 总蛋白含量分析：凯氏定氮法、Folin-酚法（Lowry法）、双缩脲法、考马斯亮蓝法、紫外吸收法 特定蛋白组分的含量分析： 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot),（二）纯度鉴定（均一性） 基本手段：电泳分析：单条带。 N端测定：n亚基蛋白有1-n个N端aa。 选用手段：沉降分析、溶解度分析、 结晶分