厚朴中清除氧自由基主要有效成分的确定.doc

厚朴中清除氧自由基主要有效成分的确定第25卷第2期2005年3月河北大学(自然科学版)JournalofHebeiUniversity(NaturalScienceEdition)V01.25NO.2Mar.2005厚朴中清除氧自由基主要有效成分的确定郝庆红一,陈冠华,冯雅琪一,田益玲(1.河北农业大学生命科学学院,河北保定071001;2.河北农业大学食品科技学院,河北保定071001)摘要:采用荧光分光光度法测定了厚朴中的2种药效成分厚朴酚与和厚朴酚对羟自由基和过氧化氢的清除作用,对羟自由基的半数清除率分别为0.081mg/L和0.091mg/L;对过氧化氢的半数清除率分别为2.357mg/L和2,772mg/L.计算结果表明:这2种成分在厚朴中的质量分数仅占4.64%,但它们对这2种活性氧的清除作用却在厚朴相应清除作用中占到56.70%和54.9l%,由此确定了该2种成分为厚朴清除2种活性氧的主要成分.同时测得抗坏血酸对羟自由基和过氧化氢的半数清除率分别为0.180mg/L和3,739mg/L,清除作用相对较弱.关键词:厚朴酚;和厚朴酚;羟自由基;过氧化氢;半数清除率中图分类号:R284文献标识码:A文章编号:10001565(2005)020164031955年由DenhamHarman提出的自由基致衰老学说1一认为人体内的许多物质在代谓过程中均产生过氧自由基.随着年龄的增长,人体自有的抗自由基系统将逐渐不能与之抗衡,导致过量的氧自由基产生,并与核酸,蛋白质等生命物质反应上乏应产物与多余的氧自由茎均会影响生物膜和遗传物质DA,改变些酶的活性,从而改变这些物质的结构和功能,使细胞受到损伤以至凋亡,最终导致生物体衰老.通过外源性氧自由基清除剂预防其毒害,防止机体过早衰老是一条有效的抗衰老途径,因此,寻找高效,价廉,低毒甚至无毒的氧自由基清除剂始终是人们所关注的工作.中药厚朴具有温中,行气,祛痰之功效,其主要功效成分是厚朴酚(Magnolo1)与和厚朴酚(Honokio1),国内外资料报道其具有抗菌,抗溃疡,镇静中枢神经,松弛肌肉,延长睡眠,降压,治疗胃肠疾病等作用l4一.还有资料表明厚朴还具有清除氧自由基的作用l5,但厚朴中何种成分是清除氧自由基的主要有效成分却未见报道.通过测定厚朴有效成分对氧自由基的半数清除率IC并将结果与厚朴的IC.相比较,可以确定所研究的成分是否为清除氧自由基的主要有效成分.过氧化氢(H,O,)和羟自由基(?OH)是人体新陈代谢过程中产生的2种活性氧,过量Ho的毒害作用类似于氧自由基,在相关研究中也将其作为氧自由基对待.本文拟采用这2种氧自由基,对厚朴中的厚朴酚与和厚朴酚的清除自由基功能做了研究,并与常见的重要氧自由基清除剂抗坏血酸的清除能力进行比较.1实验部分1.1主要仪器FP一750型荧光分光光度计(JascoInc.Japan);HDS一纯水器(河北大学水处理新技术开发有限公司);紫外灯(30W);PHS一4智能酸度计(江苏电分析仪器厂).收稿日期:20040723基金项目:河北省自然科学基金资助项目(202281);河北省教育厅自然科学基金资助项目(2000257)作者简介:郝庆红(1979),男,河北井陉人,河北农业大学在读硕士研究生.*通讯联系人第2期郝庆红等:厚朴中清除氧自由基主要有效成分的确定?l65?1.2主要试剂厚朴酚及和厚朴酚标准品(中国药品生物制品鉴定所);抗坏血酸(纯度99.5%,天津市天大化工实验厂);苯甲酸,苯胺,磷酸二氢钾,质量分数为30%H2O2均为分析纯;水为去离子水,电阻率为150kl2m.1.3氧自由基清除率测定方法要获得厚朴酚,和厚朴酚和抗坏血酸的Ic50,需要先测定其不同浓度时对氧自由基的清除率,参照文献56所报道的方法进行测定,具体步骤如下:H,O,清除率的测定:在乙醇体积分数为50%,pH为7.6的50mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中加入H,O,使其浓度为1mmol/L,然后加入不同浓度的抗氧化剂溶液,反应5rain后加入苯胺,苯胺在反应体系中的浓度为110mmol/L,再反应10rain,以326nm激发,344nm处测定苯胺的荧光强度,3次平行样品重复测定.?OH清除率的测定:在浓度为20mmol/L的50mL过氧化氢溶液中分别加入1mL不同浓度的抗氧化剂溶液,迅速置于紫外灯下照射15rain,然后加入0.85mol/L的苯甲酸溶液0.5mL,接着再照射5min,然后在302nm激发,于4llnm测定其荧光强度,3次平行样品重复测定.2结果与讨论2.13种抗氧化剂对H,O,的清除作用用不同浓度的厚朴酚,和厚朴酚和抗坏血酸测定其对固定量H2O的清除率,结果如表1所示.分别对其进行线性回归处理,得到厚朴酚的回归方程是Y=0.0047+21.21,相关系数是0.9999;和厚朴酚的回归方程是v=0.18+17.97x,相关系数是0.9990;抗坏血酸的回归方程是v=一7.39+15.35,相关系数是0.9877;其中为清除率,为抗氧化剂质量浓度.当在各自的方程中将代入50时,所得到的即为各抗氧化剂的IC据此,可算出厚朴酚,和厚朴酚和抗坏血酸的IC50分别为2.357,2.772,3.739mg/L.从3者ICs0的比较中可知,抗坏血酸对H2O2的清除能力明显比厚朴酚与和厚朴酚都弱,而和厚朴酚又比厚朴酚要弱一.表13种抗氧化剂的质量浓度与其对H2()2清除率的关系Tab.1RelationshipbetweentheconcentrationofthreeantioxidantsandtheireliminatingratioforH202lD(厚朴酚)/清除率/lD(和厚朴酚)/清除率/p(抗坏血酸)/清除率/(mg?L)%(mg?L一)%(mg?L.1%0.255.680.254.991.009.180.5010.960.509.612.00l7.541.0020.681.0017.5325033282.5052.332.5044.503.004l964.0085.335.0072.535.0068.262.23种抗氧化剂对?OH的清除作用用不同质量浓度的厚朴酚,和厚朴酚和抗坏血酸测定其对固定量?oH的清除率,结果如表2所示.分别对其进行线性回归处理,得到厚朴酚的回归方程是v=18.18+394.1l,相关系数是0.9885;和厚朴酚的回归方程是_y=19.53+333.16x,相关系数是0.9928;抗坏血酸的回归方程是v=一11.24+340.87x,相关系数是0.9892.按照与H2O2相同的处理方法可得到厚朴酚,和厚朴酚和抗坏血酸对?OH的IC0分别为0.081mg/L,0.091mg/L和0.180mg/L.从3者的比较中可以看出,在对?OH的清除能力方面,抗坏血酸比厚朴酚的与和厚朴酚更是低l倍左右,和厚朴酚同样比厚朴酚要低些.?166?河北大学(自然科学版)2005钜表23种抗氧化剂的质量浓度与其对?OH清除率的关系Tab.2Relationshipbetweentheconcentrationofthreeantioxidantsandtheireliminatingratioof.OH.D(厚朴酚)/清除率/.D(和厚朴酚)/清除率/.D抗坏血酸/清除率(mg?L一)%(mg?L)%(mg?L一)/%0.012519.070.012522.340.05004.820.025028.660.025026.690.100018.420.050038.560.050036.650.125034.940.125074.690.125066.350.150044.060.200092.470.200083040.250071.672.3氧自由基主要清除成分的确定在文献56中采用同样方法得到厚朴对H2()2和?OH的IC50分别为29.30mg/L和1.025mg/L,这就是说,清除同样数量的H2o2,2.357mg/L的厚朴酚或2.772mg/L的和厚朴酚与29.30mg/L的厚朴作用相同;而清除同样数量的?OH,0.081mg/L的厚朴酚或0.091mg/L的和厚朴酚与1.025mg/L的厚朴作用相同.经测定,实验所用厚朴中厚朴酚与和厚朴酚的质量分数分别为3.15%和1.49%,通过以下公式可计算出厚朴酚与和厚朴酚对H2o2和?OH的清除作用在厚朴的相应清除作用中所占的份额P:P=+,其中:M为厚朴的IC50;c为厚朴酚的质量分数;ch为和厚朴酚的质量分数;M为厚朴酚的IC;M为和厚朴酚的I(二50.通过上式可得这2种酚在清除H202和?OH时,其作用在厚朴的相应作用中所占份额分别为54.91%和56.70lo/0.从这个结果中可看出,这2种酚在厚朴中的质量分数仅占4.64%,但它们的清除作用份额却高达一半以上,因此,可以说厚朴酚与和厚朴酚就是清除H,O和?OH的主要有效成分.3结论通过将厚朴对H2和.OH的I0与厚朴酚,和厚朴酚的I0相比较,并经计算可知,厚朴酚与和厚朴酚在厚朴中仅占4.64%的质量分数,但Etfqx.i%_2种氧自由基的清除作用却占到厚朴清除作用一半以上的份额,充分说明该2种成分就是厚朴清除这2种氧自由基的主要成分.此外,通过与经典的抗氧剂(抗坏血酸)相比较,厚朴酚与和厚朴酚对H2和?OH的清除作用要明显强于前者,特别是对于?OH,更是如此.这说明厚朴酚与和厚朴酚是潜在的氧自由基清除药物,在抗衰老,心脑血管疾病的治疗方面都将具有很好的应用前景.参考文献:1刘建臣,黄寿康,李星彩.衰老学说的研究及其进展J.微量元素与健康研究,2002,19(4):7476.2蔡志强,赵希岳,李亮,等.三种天然抗氧化剂清除自由基作用的研究J.中国药科大学,2004,35(2):190192.3黄雪丹.国内外关于抗衰老研究进展J.海南医学,2001,12(12):6768.4林桂芸,谢生发,谢鸿,等.和厚朴酚抑菌作用研究J.成都大学(自然科学版),2003,22(2):一20.5陈冠华,田益玲,杨更亮,等.荧光分光光度法测定中药对羟自由基的清除率J.光谱学与光谱分析,2002,22(4):634636.6田益玲,陈冠华,魏显有.荧光分光光度法测定中药对过氧化氢的清除率J.分析化学,2002,30(2):183185.7冯雅琪,吴国江,郝庆红,等.厚朴酚抗脂质过氧化作用研究J.河北大学(自然科学版),2005,25(1):5254.(下转第178页)?178?河北大学(自然科学版)2005焦hillslope(StipabungeanaArtemisiafrigidacommunity)andthesoilhillslope(StipabrevifloraStipabungeanacommunity)terefitbyLogseriesdistributionmodelandLognorma/distributionmodelmorethanothers.ando/soshowedthatthosecommunitystructureandcomponent1ereQresponsepattrentoenvironment血ctorsandlongterradisturbancezvhhgrazinginthemountaingrass/and.Inthedesertgrassland(ArtemisiaordosicaAmmopiptantusmongolicuscommunity),Artemisiaordosicawasmostdominantspeciesanditsecologicalnichewasverylargethatoccupiedthemostecologicalspaceofthecommunity.Thestatisticalcheckingresultshowedthattwohypothesis(randomlyecologicalnichehypothesisandecologynicheoccupationhypothesis)confirmedwiththespeciesdistributionpatternofthemountainvegetation.Thedisturbanceofgrazingnotonlyreducedthedominantdegreeofdominantspecies,butalsoreduceddominantdegreeofsubdominantspeciesandothersspecieswerenotgrowingordevelopingwel1.Allstudyresultsindicatedthatallcommunypatternsanddynamicsweredisturbedbysomeexternalnobiologyfactors(grazinganddroughtect.)muchmorethanbyothers.Keywords:droughtmountainregion;desertgrassland;speciesdiversity;speciesabundancerelationshipmodel(责任编辑:梁俊红)(上接第166页)DeterminationoftheMainEfficientCompositionintheHerbofNlagnoiiaoffieinalispIU一一I-EliminatingOxygenRadicalsHAOQinghong,CHENGuanhua,FENGYaqi,TIANYiling(1.CollegeofLifeScience,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001,China;2.CollegeofFoodScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding071001,China)Abstract:Theeliminatingactionofmagnololandhonokiolintheherbofmagnoliaofficinalisforhydroxylradicalandhydrogenperoxidearedeterminedwithfluorescencespectrophotometry.Thehalfelimin