微生物工程07发酵工艺控制

第七章 发酵工艺控制,发酵的一般流程,提纲,温度控制pH值控制溶氧控制二氧化碳控制泡沫的控制,1、温度对发酵的影响,对细胞生长的影响：温度升高，从酶反应动力学来看，生长代谢加快，但由于酶很容易热失活，所以高温时菌体易于衰老；对产物形成的影响：菌体生长速率、呼吸强度和代谢产物形成速率的最适温度往往是不同的；温度升高，一般产物生成提前；对生物合成的方向的影响：反馈抑制随温度变化而改变；对发酵液物理性质及溶解氧的影响：影响氧的溶解和传递，影响一些基质的分解，间接影响生物合成。,2、影响发酵温度的因素,发酵热的成分生物热：微生物生长繁殖过程中的产热搅拌热：机械搅拌造成的摩擦热蒸发热：被通气和蒸发水分带走的热量辐射热：发酵罐罐体向外辐射的热量显 热：空气流动过程夹带着的热量Q发酵= Q生物 Q搅拌 Q蒸发Q显 Q辐射,3、发酵热的测定,通过冷却水进出口温度和流量测定：Q发酵=Gcw(t1-t2)/V G冷却水流量； Cw水的比热； V发酵液体积。通过发酵液温度随时间上升的速率测定：Q发酵=(M1c1+ M2c2)S M1、c1 发酵液质量、比热； M2、c2 发酵罐质量、比热； S温度上升速率。,4、最适温度选择与发酵温度控制,温度变化的一般规律与控制的一般原则接种后发酵温度有下降趋势，此时可适当升高温，以利于孢子萌发和菌体的生长繁殖；待发酵液温度开始上升后，应保持在菌体的最适生长温度；到主发酵旺盛阶段，温度应控制在比最适生长温度低些，即代谢产物合成的最适温度；到发酵后期，温度下降，此时适当升温可提高产量。选择是相对的，要考虑培养基成分、浓度；溶氧（温升氧降）；生长阶段；培养条件等。,4、最适温度选择与发酵温度控制最适温度选择,最适温度分最适生长温度和最适产物合成温度，两者往往不同，各阶段可用不同温度。 如：青霉素分别为： 30和 24.7 。青霉素发酵的温度控制0-5h：30C6-35h：25C36-85h：20C86-125h：25C,4、最适温度选择与发酵温度控制发酵温度控制,进行温度控制时应考虑的因素不同菌种在不同生长阶段的生长和生产特性参考其它发酵条件（通气、培养基成分和浓度、pH值等），如通气条件差时，则最适发酵温度比通气良好时低。,4、最适温度选择与发酵温度控制发酵温度控制,温度控制的方法冷却是主要的方法，通常是利用发酵罐的热交换装置进行降温，如果气温较高，冷却水温度也较高时，多采用冷盐水进行降温。发酵罐的热交换装置：罐外夹套罐内蛇管、列管,二、pH值对发酵的影响及控制,发酵液PH对菌体生长、繁殖和产物积累影响较大。生产前应进行试验和研究。菌体生长、繁殖和产物积累的最适PH不一定相同。整个发酵过程的PH是变化的。 1、 PH对发酵的影响 2、影响发酵PH的因素3、最适PH的选择和调节,1、 PH对发酵的影响,微生物生长最适pH值范围 不同的微生物具有不同的最适生长的pH值 细菌6.5-7.5； 放线菌6.5-8.0； 霉菌4.0-5.8； 酵母菌3.8-6.0产物形成最适pH值范围 微生物的生长和产物形成的最适pH值往往不同 少数一致，大多不同； 有的偏高，有的偏低。,1、 PH对发酵的影响,pH对微生物生长和产物形成影响的原因：PH值影响菌体形态，如壁厚薄、长径比； pH值改变使原生质膜电荷发生改变，影响菌体对营养物质的吸收和代谢产物的排出；pH值直接影响酶活性；pH值影响某些重要营养物质和中间代谢产物的离解，从而影响微生物对这些物质的利用。pH影响生物合成的途径。 如：黑曲霉PH=2-3时产柠檬酸；近中性时产草酸、 葡萄糖酸。,2、影响发酵pH的因素,影响pH值的因素：培养基成份、微生物代谢特性决定发酵过程的PH变化。（综合反映）此外，通气状况的变化，菌体自溶和杂菌污染都可能引起发酵液PH的变化。微生物改变培养液PH以适合自身生长的能力很强。发酵液的实际PH是“成分”和“途径”的统一。确定和有效控制PH在菌体生长或产物积累的最适范围是高产的保证。,2、影响发酵pH的因素,生理碱性物质和生理酸性物质生理碱性物质：经微生物代谢后，导致PH上升（碱性物质生成或酸性物质消耗）的物质。 如：有机氮源，硝酸盐，有机酸。 （产NH3、NaOH）生理酸性物质：经微生物代谢后，导致PH下降（酸性物质生成或碱性物质消耗）的物质。 如：糖类（产有机酸），脂肪（产脂肪酸），铵盐 （氧化产硫酸）。,3、最适PH的选择和调节,最适PH的选择和调节的原则：既有利于菌体的生长繁殖，又可最大限度的获得高产。根据不同微生物的特性，在发酵过程中随时检查pH 值的变化，选用适当的方法进行调节。生长最适PH和产物形成最适PH的相互关系： 两者相同，范围都宽；容易控制。 两者相同，范围都窄；必须严格控制。 两者相同，范围一宽一窄；必须严格控制。 两者不同，范围都窄；分别严格控制。,3、最适PH的选择和调节,选择pH值的方法：通过实验确定。 配制并始终调节控制不同PH，检出菌体或产物最大值。调节pH值的方法： 主要考虑培养基中生理酸、碱性物质的配比；补料调节：调节通气量、调整盐类、氮源、碳源的配比平衡； 如：青霉素生产的葡萄糖补加控制PH。 （按需补糖比恒速补糖效果好。）添加弱酸或弱碱、加缓冲剂。（一般效果不好）,三、氧对发酵的影响,氧是制约发酵进行的重要因素氧难溶于水，培养基中贮存的氧量很少； 【纯氧溶纯水，1.26mmol/L；空气氧溶纯水，0.25；培养基更低】高产株和加富培养基的采用以及发酵周期的缩短 加剧了对氧的需求；形成产物的最佳氧浓度和生长的最佳氧浓度有可 能是不同的；发酵罐中氧的吸收率很低；（多数 2%；通常 1%）加大通气量会引起过多泡沫；消泡剂不利于溶氧。,1、氧的传递和传质方程式,氧传递的阻力： 气相到气液界面； 气液界面； 通过液膜； 液相； 细胞或细胞团表面； 固液界面； 细胞团内； 细胞壁； 反应（生化）阻力。从空气泡到细胞内总阻力为上述阻力之和。 即1/kt=1/kG+1/kI+1/kL+1/kLB+1/kLC+1/kIS+1/kA+1/kW+ 1/kR液相主体到细胞壁，氧的浓度差很小。 （不结团，壁近液膜）。,1、氧的传递和传质方程式,氧传递的总推动力： 气相与细胞内的氧分压差和浓度差。减小阻力方法： 液膜，气液混合所生湍动； 细胞团表面液膜，搅拌减小外径； 细胞团内阻力和壁阻力，搅拌减少逆向扩散梯度； 反应阻力，培养基成分，培养条件，去产物。,1、氧的传递和传质方程式,气液相间的氧传递和氧传质方程式。 （氧分压和浓度变化图7-7）氧传递的主要阻力存在于气膜和液膜中。单位体积培养液中的氧传递速率 ： OTR=KL（C*-CL） KL 容积传递系数； 比表面积； KL以氧浓度为动力的总传递系数； C*气液平衡的液相氧浓度（应有）； CL液相主体氧浓度（存在）。 培养物处于充裕的通气情况下， CL会逐渐接近C*，氧传 递速率渐小； 而处于不充裕的通气情况下， CL下降趋于0，氧传递速率 最大。（C*-CL推动力）,2、影响微生物对氧需求的因素,不同微生物对氧的需求不同，其耗氧速度用呼吸强度（比耗氧速率）来表示： CL QO2 =( QO2 )m (当氧是限制性基质时 ) K0 + CL ( QO2 )m最大比耗氧速率； CL溶解氧浓度； K0氧的米氏常。 各种菌的K0和( QO2 )m有定值。菌的呼吸强度与菌种种类K0， ( QO2 )m和培养液中溶解氧浓度有关。 CL增加，( QO2 )m 增强；直至达到 CL /（ K0 + CL ）1 临界值，再不加大。如：图7-8。,2、影响微生物对氧需求的因素,摄氧率：单位体积培养液，在单位时间内耗氧量。 r = QO2X X细胞浓度。影响微生物摄氧率的因素：菌种； 溶解氧浓度； 细胞浓度；培养基成分和浓度：如：碳源，利用速度不同摄氧率不同； PH； 温度：温度高，临界值增高；有毒物积累。抑制呼吸；挥发性中间物（有机酸），加强；氧的满足度：溶解氧浓度与临界氧浓度之比。产物形成的最佳氧浓度有时与细胞生长最佳氧浓度不同，需氧量差别较大，各有不同。,3、培养基的流变特性,培养基的流变特性影响： 动量、热量、质量传递，继而影响各种发酵条件。如： 溶氧速率、气体交换、发酵温度、营养物补充、PH值的调节等。 培养液是 一多相体系，由液相、固相（菌体，不溶性培养基组分）和气相构 成。,牛顿流体和非牛顿流体,牛顿型流体：服从牛顿黏性定律，黏度只是温度的函数，与流变状态无关。即发酵罐中任何局部黏度相同，与搅拌速度、半径无关。 （清细菌、酵母液）非牛顿型流体：不服从牛顿黏性定律，其黏度不仅受温度影响，而且随流动状态而异。可分为几种类型的流体。与切变率有关。 （放线菌、霉菌、高浓度细菌、酵母培养液）,非牛顿流体的搅拌功率,罐中非牛顿流体的平均切变率与搅拌速 度成正比。 _ 平均切变率 r = k N k无因次常数 N搅拌器转速 对不同的非牛顿流体，采用不同型式和大小的搅拌器，k值一般在10-13之间。在发酵过程中，培养液和黏度系数、流变特征指数表现出时变性。,4、影响供氧的因素,由氧传质方程式： OTR=KL（C*-CL） 可知，以下因素影响氧传递速率：（1）影响KL的因素 ；（2）影响推动力（C*-CL）的因素 。,（1）影响KL的因素,搅拌： 汽泡变小，增大汽液相接触面积；延长汽泡在液体中的停留时间；增加湍动程度，减小气泡外液膜厚度，减小阻力；使培养基成分和细胞均匀分布，利于营养物吸收，代谢物扩散。搅拌比通气速度对KL的影响更明显。 但搅拌速度过高，会对细胞造成损伤，并会增加传热的负担。 通气效率还与罐体积（越小越好）、罐形状、结构、搅拌器形式、挡板有关。,（1）影响KL的因素,空气流量： 供氧，带走废气。 KL随空气流量增加而增加，但有限度。 如超过限度，搅拌器在空气泡中空转，不能分散空气，搅拌功率下降。气沿轴逸出。,（1）影响KL的因素,培养掖性质的影响： 微生物生长繁殖和代谢可引起发酵液密度、黏度、表面张力、扩散系数的变化。这些性质的变化都会影响KL值。 如：黏度增大，滞留液膜厚度增加，传质阻力增大；同时黏度影响扩散系数，使通气效率降低。 综合操作条件和流体性质对KL的影响，有： KL=f(Di,N,s,DL,g),（1）影响KL的因素,微生物生长的影响： 细胞浓增加， KL值变小，细胞浓度相同时，球状菌悬液的KL值是丝状菌悬液KL值的两倍。 （流动特性，稠度差别较大）,（1）影响KL的因素,消沫剂的影响： 分布于气液截界面，增大传递阻力，使KL下降（虽使 增大）。 产生泡沫原因多样，其中发酵性泡沫氧低，CO2高，不易破，“逃液”。 消沫剂虽然使KL下降，但最终会有 效的改善发酵液的通气效率。 （消沫剂的重要手段）,（1）影响KL的因素,离子强度的影响： 气泡在电解质溶液中，比在水中小很多， 较大， KL值也比水大。并随浓度增加而增大。 丙酮、乙醇、甲醇等有机溶剂也有类似情况。,（2）影响推动力的因素,提高推动力实际上是增加氧的泡和度C*。影响因素有：温度：常压下，随温度升高而降低。溶质的影响：随浓度增加氧饱和度下降。电解质，因盐析作用而降低；有机溶液，升高。缸压：缸压增加，溶解氧浓度增加，但CO2也增加且更快。不利于液相中CO2排出。对细胞渗透压有不利影响。纯氧：富氧通气、溶解氧增加。但生产成本提高，不够经济。,5、液相体积氧传递系数KL的测定,常握供氧，需氧情况，要测定： 溶解氧浓度，摄氧率和液相体积氧传递系数KL。1.摄氧率的测定： 先用纯水标定电极，得单位电流值代表的溶解氧浓度；测定时、关气、除气、保持搅拌；细胞耗氧，培养基氧降，电流值降，摄氧率 r 求出。,5、液相体积氧传递系数KL的测定,2.液相体积氧传递系数KL的测定： 可用直接测定法，动态测定法。 用复膜氧电极测定，停气、N气、除气，保搅拌；溶氧下降， 到呼吸临界氧浓度时，恢复通气。溶解氧浓度为纵坐标，测定时间为横坐标。制得曲线，其斜率=-1/ KL；延长线与纵轴的截距为C* 。,6、提高溶氧的方法,加强搅拌；适当的空气流量；减小培养基粘度；提高氧分压；调节微生物呼吸强度的临界值；合适的细胞浓度、碳源种类、pH、温度。,四、二氧化碳对发酵的影响及控制,二氧化碳的来源： 是微生物的代谢产物，也是某些合成代谢的一种基质。二氧化碳对发酵的影响： 1、对菌体： CO2效应：在发酵生产中不同微生物或某一生长阶 段对二氧化碳有着特殊的要求（促进或必须）； 通常对菌体生长有抑制作用。排气中高于4时，糖 代谢和呼吸速率下降。 2、对产物：需占一定的比例（或分压），过高、过低产量都会下降； CO2对某些发酵产生抑制作用。如：抗生素，组氨酸等。二氧化碳可通过改变pH而影响发酵生产。,四、二氧化碳对发酵的影响及控制,原因： CO2作用膜脂质核心部位，改变膜流动性及表面电荷密度，影响膜运输效率，导致细胞生长受限制，形态改变；（HCOO3-影响细胞膜的膜蛋白） 也可产生反馈作用，使PH下降，与其他物质反应，与生长必需金属离子形成碳酸盐沉淀，过分耗氧，引起溶解氧下降等，影响菌体生长和产物合成。,四、二氧化碳对发酵的影响及控制,发酵液中CO2浓度的影响因素： 细胞呼吸强度； 发酵液流变学特性； 通气搅拌程度； 罐压大小； 设备规模。二氧化碳浓度的控制方法：调节罐压、通气量和搅拌速度；补料。（青霉素：补糖，增加CO2 产生，降低PH。）,五、泡沫对发酵的影响及控制,泡沫产生的原因泡沫过多对发酵的危害泡沫的消长规律泡沫的消除和防止,1、泡沫产生的原因,充气产生泡沫微生物代谢气体形成泡沫泡沫的产生与培养基性质有关（蛋白质原料、蜜糖水解原料，淀粉水解不完全时易发泡）,2、泡沫过多对发酵的危害,使装量减少，或造成跑液，使产量降低；通过轴封泄漏，污染设备，增加染菌机会；菌体粘附罐顶、罐壁，发酵液中菌体量减少；影响通气搅拌的进行，造成减产或菌体提前自溶；菌体提前自溶会促使更多泡沫形成，恶性循环；减风量，影响溶解氧浓度，影响生长、代谢；加消泡剂，给提取工艺带来困难。,3、泡沫的消长规律,通气和搅拌： 随通气和搅拌增加而增加，搅拌比通气影响大；培养基原料性质： 蛋白胨、玉米浆、花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉等蛋白质原料是主要发泡物质；培养基灭菌方法： 温度过高，形成蛋白黑色素，5羟甲基糖醛，泡沫增多；细胞代谢活动： 初期，高粘度、低张力，泡多；中期，粘度降、张力升，泡少；后期，自溶，泡上升。,4、泡沫的消除和防止,消泡方法：改变培养基成份，减少通气，选育新生产株化学法：添加消泡剂（油类等），应用面广机械法：靠机械强烈振动，压力的变化，使 气泡破裂，或借助机械力将排出气 体中的液体加以分离回收,4、泡沫的消除和防止,化学消泡法机理：由于消泡剂本身的表面张力较低，当其与气泡膜表面接触时，使气泡膜局部的表面张力降低，从而使气泡破裂。消泡剂的特点：是表面活性剂，具有一定的亲水性，溶解度较小，无毒，不干扰溶氧、pH值等测定仪表的使用，来源广，价廉。缺点：1、消耗多种油类或化工原料； 2、使发酵液中氧的