【毕业学位论文】（Word原稿）两栖单顶孢菌（Monacrosporium janus）菌寄生性的酶学机理研究-植物病理硕士论文

密级 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 a o. a y A of 国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 I 目 录 目录 中文摘要 英文摘要 第一章 引言 1 第二章 菌寄生过程中相关酶的筛选 7 材料 7 方法 9 一、 板对峙培养观察菌落互作 9 二、平板透明圈法检测酶活性 9 三、比色法测定酶活性 9 四、蛋白质含量测定 11 结果 11 一、平板对峙培养 11 二、平板法检测几丁质酶和葡聚糖酶活性 12 三、比色法测定相关酶活性 13 讨论 15 第三章 葡聚糖酶的纯化 16 材料 16 方法 16 一、两栖 单顶孢产葡聚糖酶条件的测定 16 二、葡聚糖酶的纯化 17 三、蛋白质的氨基端氨基酸序列分析 19 结果 19 中国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 、两栖单顶孢产葡聚糖酶条件的测定 20 二、葡聚糖酶的纯化 22 三、葡聚糖酶 氨基 端氨基酸序列 25 讨论 25 第四章 葡聚糖酶的性质研究 26 材料 26 方法 26 一、温度对葡聚糖酶 影响 26 二、 葡聚糖酶 影响 26 三、金属离子对葡聚糖酶 活的影 27 四、葡聚糖酶 测定 27 五、葡聚糖酶的抗病原真菌的作用 27 结果 27 一、温度对葡聚糖酶 影响 27 二、 葡聚糖酶 影响 28 三、金属离子对葡聚糖酶 性的影 30 四、葡聚糖酶 测定 30 五、葡聚糖酶对病原菌的作用 31 讨论 31 参考文献 3 3 附录 39 致谢 41中国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 要 本论文对食线虫真菌两栖单顶孢（ 寄生的酶学机 理进行了研究。 平板对峙法培养两栖单顶孢和核盘菌，表明两栖单顶孢对核盘菌生长有抑制作用。在以菌核粉为唯一碳源的液体培养基中连续培养两栖单顶孢并连续测定各酶的活性，结果只有葡聚糖酶的活性较为显著且随着培养时间的延长酶活性明显变化。说明葡聚糖酶在两栖单顶孢的菌寄生过程中起重要作用。 从培养基种类、培养时间和初始 三方面对两栖单顶孢产葡聚糖酶的条件进行了优化。结果表明以麸皮粉为诱导物、 28 180荡培养 4 天、初始 为 6 时产酶量最大。 通过硫酸铵沉淀、 胶过滤脱盐和阴离子 交换柱层析对葡聚糖酶进行了分离纯化，得到了两种葡聚糖同工酶。 泳检验结果表明，一种同工酶得到了纯化 , 定名为 子量为 33右，其氨基端氨基酸序列为 N P C Y L G S F Q T。另一种同工酶得到了部分纯化。 对葡聚糖酶 特性进行研究，结果表明该葡聚糖酶的最适反应温度为 70，最适反应 于 70和 该酶比较稳定， 性有促进作用， 性有强烈的抑制作用。该酶对昆布多糖底物的 为 生测实验表明，两栖单顶孢所产生的葡聚糖酶粗酶液可明显抑制立枯丝核菌菌丝的生长，使其膨胀破裂，表明葡聚糖酶在两栖单顶孢的菌寄生过程中起重要作用。但对其中一种得到纯化的葡聚糖同工酶的生测结果表明，其抑菌效果不明显，对这一现象的产生本文进行了深入的讨论。 关键词：食线虫真菌 两栖单顶孢 菌寄生 葡聚糖酶 中国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 he a of in of of of a . in as an in of on , 8 80as of by is 3 000 N P C Y L G S F Q T. 0 0 pH to to as m of G1 of an in of . in to to 国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 1 第一章 引 言 真菌是植物的重要病原物，在植物病害中由真菌引起的病害数量最多，几乎每种作物都有几种真菌病害。 同时植物寄生线虫也对多种农林植物造成重大危害，据 守估计，全世界每年因线虫危害对粮食和纤维作物造成的损失大约为 12%，对 蔬菜、花生和某些果树造成的损失要超过 20%。 自 20 世纪 40 年代以来，对病虫害的防治主要依赖化学农药。 但随着社会的发展，化学农药的种种弊端引起了人们的认识和广泛关注，如环境污染、生态破坏、对人畜的毒害、病原物产生抗药性等等。 因此，防病杀线多功能生防菌的开发利用受到关注。 1978 年， 978) 首次发现在培养条件下捕食线虫真菌 少孢节丛孢（ 强力节丛孢（ A. 多孢节丛孢（ A. 平板上不但能以粘性 菌网捕食植物寄生线虫也可以通过菌环寄生于 枯丝核菌（ 地霉属真菌（ 等病原真菌上，为防病杀线多功能生防菌的开发提供了依据。 1食线虫菌物概况 食线虫菌物是指寄生、捕捉、定殖和毒害线虫的一类微生物，在自然界中广泛存在并对线虫的群体数量具有重要的调控作用 (。 1839 年，著名葡萄牙菌物学家 C. 立了食线虫真菌的第一个属 节丛孢属（ 。 到目前为止，世界已报 道的食线虫菌物约 400 种，我国已报到的约 120 种。 食线虫菌物经长期的进化形成了功能多样的不同类群，主要有以营养菌丝特化形成捕食器捕捉线虫，通过成囊孢子、粘性孢 (987)子、吞噬孢子和注射孢子侵染线虫，通过分泌毒素消解或定殖线虫。 有关食线虫菌物的代谢研究较少，仅有少量关于酶的产生及次生代谢产物的研究。1969）测定了 12 种寄生线虫菌物的纤维素酶活性，结果表明所有测试菌都可以产生纤维素酶。 1996）分别测定了 44 株食线虫菌物的纤维素酶活性及 30 株菌物的木质素裂解酶活 性，结果表明所有供试菌株都产生纤维素酶，仅有 2 株具有木质素裂解酶活性。 已经证明胶原酶能够降解线虫体壁影响植物寄生线虫的存活、游动及卵孵化，胶原酶可能与食线虫菌物侵入线虫有关。 一些学者对食线虫菌物降解线虫体壁及卵鞘的蛋白酶进行了纯化和定性，发现这些酶均属于丝氨酸蛋白酶中的枯草杆菌蛋白酶类，并具有很高的同源性。几丁质酶在线虫侵染中的重要性已经从几丁质酶活水平与致病性的正相关以及植物与细菌几丁质酶对卵和幼虫的影响中得到证明。 中国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 2 2菌寄生菌概况 菌寄生菌是指生长于其它菌物上，并从其获得营养的一类菌物。 一种菌 物寄生于另一种菌物上的现象叫菌寄生或重寄生。 寄生物叫菌寄生菌，被寄生物叫寄主菌物。 早在两百多年以前菌物学家就发现了这类菌物，但真正对其研究则始于 19 世纪 60 年代。 它作为植物病害生物防治的重要机制之一，已经受到越来越的重视。 根据寄生方式和对寄主的影响，菌寄生菌可分为不同类型。 1985）和 1988）将菌寄生分为活体营养菌寄生和死体营养菌寄生。活体营养的菌寄生菌从活的寄主菌物细胞内获取养料。根据从寄主菌物获取营养的方式不同，又分为内生性、吸器性和接触性。这类寄生菌一 般具有高度的寄生专化性，仅能寄生于某一种或者少数几种近缘的菌物。死体营养菌寄生菌是以酶解或产生有毒物质来杀死寄主，再从死亡的寄主细胞中吸收所必需的营养物质，这类菌寄生菌的寄主范围大，寄主专化性低，一般不产生特异性的侵染结构。 菌寄生菌对寄主菌的作用机制包括寄主菌形态学上的畸变、对菌丝的附着生长、侵入并产生吸器、菌丝的溶解，以及产生酶和抗生物质等。自 1932 年（ 1932）发现木霉对其它土壤真菌的寄生现象以来已报道了大量的菌寄生菌，尤其对哈茨木霉（ 的菌寄生过程中涉及的酶类及其基因研究最多。 3菌寄生生化机理 菌寄生是一个连续的过程，一般认为菌寄生过程分为四步：趋向性生长、识别、接触穿透和营养获得（ 1987）。 向性生长 趋向性生长是指菌寄生菌由于受某些化学物质的刺激而向性生长，从而到达寄主菌所在的位置（ 1987），它对菌寄生有促进作用，但这并不是菌寄生所必需的一步。 认为趋向性生长与寄主菌丝产生的化学刺激物的浓度梯度的方向有关（ 1983； et 1986）。吸器性活 体营养菌寄生菌的芽管对寄主的细胞表现强烈的正趋向性，菌寄生菌孢子萌发和芽管向性生长都需要一种或多种专门物质的刺激作用，这些物质可以由寄主菌物的分泌物提供。接触性活体营养菌寄生菌与寄主菌物接触前也表现有趋向性， 1973）报道 齿梗孢（ 膝葡孢（ 孢子萌发需要寄主菌丝的分泌物或酵母膏、玉米粉 、菌丝提取液等天然产物。但也有报道菌寄生过程中不存在趋向性生长，例如有 研究（ 1991）认为有些死体营养 菌寄生菌到达寄主菌物不存在向性生长，菌寄生菌到达寄主菌物的过程是随机的。 中国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 3 寄生菌与寄主菌的识别：凝集素和糖类的互作 识别是一种普遍而重要的生物现象。在菌物中，共栖、共生、寄生和致病等各种形式的相互关系都涉及到识别。 凝集素在菌寄生菌和寄主菌物相互识别中起重要作用。 1971）报道，利用与寄主真菌终极腐霉（ 丝直径相当的塑料线替代终极腐霉菌丝，结果发现并不是简单的接触就能引发菌寄生行为的产生，菌寄 生真菌哈茨木霉（ T. 本不在塑料线周围产生菌丝圈。他们的实验说明在菌寄生真菌和寄主之间一定存在着某种识别机制。 1983 年， （ 1983）用哈茨木霉（ T. 钩状木霉（ T. 其寄主作为模式系统，首次证明寄主真菌立枯丝核菌（ 胞表面的凝集素在识别中起重要作用。 1985， 1990）通过研究哈茨木霉 (T. 和钩状木霉 (T. 与寄主真菌齐整小核菌（ 相互作用再次证明了寄主真菌细胞表面的凝集素在识别中的作用，并纯化了这种凝集素。 该凝集素是一种糖蛋白，与蛋白酶和葡聚糖酶作用后凝集反应受到抑制，说明凝集素中的蛋白残基和糖残基参与凝集反应。 1992）将纯化的齐整小核菌凝集素黏附到尼龙纤维上，哈茨木霉盘绕尼龙纤维并产生钩状体与在真的寄主菌丝上模式相似，进一步证明了凝集素在识别中的作用。 1993 年， 1993）正式提出菌寄生真菌与寄主真菌相互识别的凝集素 糖相互作用模型： 寄主真菌细胞表面的凝集素和寄生真菌细胞表面的糖分子的特异性接合，使寄主与寄生物达到相互识别。 寄生过程中的细胞壁降解酶 水解酶类在菌寄生过程中起着重要作用。 一方面它们参与菌寄生菌侵染寄主菌的过程，死体营养菌寄生菌产生细胞壁降解酶消解和杀死寄生真菌，从而获得营养；吸器性活体营养菌寄生菌侵入寄主菌时，产生细胞壁降解酶，消解寄主菌细胞壁以助其侵入。另一方面菌寄生菌产生的细胞壁降解酶又能对寄主菌孢子的萌发、芽管的伸长和菌丝的生长起到抑制作用（李多川， 1998）。 目前所报道的菌寄生真菌产生的细胞壁降解 酶类主要有几丁质酶、葡聚糖酶和蛋白酶。 对它们的研究已有众多报道，主要包括分离纯化、基因克隆和基因表达（邢晓科， 2002）。 真菌的细胞壁主要是以几丁质为骨架，以 葡聚糖为填充物，其它还有少量的蛋白质和脂质（ 1967）。 真菌细胞壁包含大于 60的葡聚糖，几丁质以不规则的方式排列成层，葡聚糖以无定形的方式分布，几丁质和葡聚糖通过化学键形成由葡聚糖和 1979）。 因此几丁质酶和葡聚糖酶被认为是在降解真菌细胞壁过程中起重要作用。 有关其分离纯 化和相关基因的克隆已多有报道。 由于纯化的细胞壁降解酶对许多病原菌都是有效的杀菌剂，可以降解各种真菌组织如菌丝体、分生孢子及菌核等（ 1996； 2001），因此深入研究它 中国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 4 们在菌寄生过程中的作用，对生防菌的基因改良和农作物抗病基因转化有重要意义。 丁质酶 菌寄生菌产生的几丁质酶分为 切几丁质酶和内切几丁质酶，在侵染的不同部位和不同时期产生的几丁质酶也不尽相同。 1995）认为哈茨木霉的几丁质酶 系由六种几丁质酶组成，即两种 4氨基葡萄糖苷酶（ 四种内切几丁质酶（ 几丁质酶是一种诱导酶，在含有几丁质或其部分水解产物的培养基中产生的几丁质酶活性较高。 上述六种几丁质酶除 以葡萄糖为碳源胞外低水平表达的以外，其它都是以几丁质为唯一碳源时所诱导产生的。 近来在几丁质酶基因克隆和表达方面也做了许多研究。目前已知的菌寄生中的几丁质酶基因大多数都来自木霉，已被描述的木霉几丁质酶基因有： et 1995）、 et 1994；et 1994）、 et 1994）、 et 1995）、et 2001）、 et 1996）和 et 1993a）。1994 年 1994），首次在大肠杆菌中表达 隆，其产物具有几丁质酶活性。 被证实在对病原物的拮抗中起关键作用（ 1999）。 在以往的实验中人们只在菌寄生的后期阶段观察到几丁质酶的产生 (et 1996)， et 1999）利用绿色荧光蛋白报告基因技术证明了内切几丁质酶基因 表达发生在哈茨木霉与其寄主机械接触之前，从而证明内切几丁质酶 与菌寄生的前期过程。同时该实验还证明了 表达 需要一种大于 12种大分子物质是由 哈茨木霉 释放的，扩散到达寄主真菌立枯丝核菌，使后者释放一些细胞壁的低聚糖从而诱导 表达。 et 1998）将内切几丁质酶基因 转基因植株表现对叶部病原菌细交链孢（ 立枯丝核菌 （ R. 和灰葡萄孢 (抗性。我国覃宏涛等（ 2000）把该基因转入水稻，提高了对纹枯病的抗性。 聚糖酶 葡聚糖酶是以葡聚糖为底物 ,降解产生葡萄糖的一类水解酶。分为外切和内切酶， 外切酶从末端连续切割葡萄糖残基形成唯一的产物葡萄糖单体，内切酶在随机位点切割多糖链形成小的寡糖，只有在两种酶共同存在时葡聚糖才能被完全消化 ( 975; 962; 966)。 菌寄生菌产生的葡聚糖酶在菌寄生中的作用已得到证明。哈茨木霉 株的内切子量为 78灰葡萄孢（ 的孢子萌发和芽管伸长有强烈的抑制作用。 哈茨木霉 株的一种内切 子量为43多种植物病原菌的生长有抑制作用。 （ 2000）认为哈茨木霉中的 - 中国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 5 葡聚糖酶体系由至少 5 种不同的酶组成 ,它们在聚丙烯酰胺凝胶中移动的距离 30最大的葡聚糖酶 1,3 200 已被分离纯化。 1995) 纯化了由一种立枯丝核菌上的寄生菌 葡萄穗霉（ 分泌的子量约为 94 酶可以诱导立枯丝核菌菌丝顶端发生变化， 包括菌丝尖膨胀、破裂、细胞质渗漏以及多隔膜的形成。 在基因研究方面，哈茨木霉已有 11 种 葡聚糖酶被描述，两种编码基因（编码外切 和编码内切 克隆。 1999）发现菌寄生真菌白粉寄生孢（ 寄生过程中胞外外切 编码基因 哈茨木霉的 同源性分别为 46%和 30%， 培养的后期表达， 其转录受到真菌细胞壁成分的诱导。 表达受到碳水平的调节。在含有多糖、真菌细胞壁或无碳源的培养基中 在高浓度葡萄糖培养基中被抑制 (et 1993; 997) 。 而且，不同真菌细胞壁的诱导水平不同，哈茨木霉在不同碳源培养基中培养产生的 (et 1995; et 1998) 。 白酶 目前，对于菌寄生真菌产生的蛋白酶的报道很少。 1989）发现哈茨木霉 (在穿透尖孢镰刀菌 (菌丝细胞壁时，伴随着几丁质酶和葡聚糖酶的产生，一种蛋白质水解酶呈上升状态，当时推测有一种蛋白质或蛋白质类似物在阻遏几丁质酶和葡聚糖酶的产生，蛋白质水解酶水解阻遏物从而产生几丁质酶和葡聚糖酶。 et 1993）等从哈茨木霉 株中分离出了这种丝氨酸蛋白酶（ 并证明它在菌寄生过程中起协同作用，并已将这种丝氨酸蛋白酶基因克隆。 H (1998)发现哈茨木霉和寄主相互作用过程中产生一种碱性蛋白酶，并构建了过量表达此酶的转化菌株。 et (1997) 通过增加 蛋白酶基因 化菌株稳定并携带 2 10个 哈茨木霉和立枯丝核菌在体外培养相互作用时， 因得到高水平表达。 细胞壁降解酶在菌 寄生中的作用机制是多因子事件。多数学者认为细胞壁降解酶在消解和穿透寄主菌物细胞壁过程中起直接作用。 但 研究表明，一些菌寄生菌对寄主菌物的消解和穿透与其产生的细胞壁降解酶不成正比。 中国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 6 (1992) 认为菌寄生菌消解和穿透寄主菌物的过程既有酶的作用，也有机械压力。同时，许多报道表明一些细胞壁降解酶在菌寄生过程中需要其它物质协同作用。 et 1993b)发现哈茨木酶产生的内切几丁质酶和壳二糖酶共同作用时的抑菌效果明显，纯化后单独 作用抑菌效果都会降低。在其它一些真菌中也有报道表明几种酶的混合液比纯化的酶液的抑菌率高。 et 1988)和 1988)的研究证明高等植物中的葡聚糖酶类和几丁质酶类协同作用的抗菌性远远高于这些酶类的单独作用。 et 1993）发现在 相互作用中几丁质酶和胶霉毒素表现协同作用。因此 细胞壁降解酶在菌寄生中的作用还需进一步研究。 真菌和线虫都是植物病害的重要病原物，对农林业生产造成巨大损失。由于 人们长期依赖化学农药，严重破坏了生态环境。化学农药对环境的污染，对人类健康的威胁，病原物抗药性的产生及对有益生物的危害已经受到人们的高度重视。利用菌物防治植物病害具有无污染、持效长等优点，是发展绿色农业的一条重要途径。 食线虫真菌是一类广泛分布于土壤和有机残体上的宝贵资源，对线虫的群体数量具有重要调控作用（ 987），同时一些食线虫真菌也能寄生植物病原真菌。 1978 年， 首次发现捕食线虫真菌的菌寄生现象。 以后 1985）和 1993）发现少孢节丛孢（ 寄生过程中的菌环、菌网中蛋白酶的活性显著高于普通菌丝而在捕食线虫的菌网中未见蛋白酶活性的提高，表明少孢节丛孢（ 线虫的捕食和菌寄生具有不同机理。 尽管人为条件下捕食线虫真菌的菌寄生现象已发现二十余年，但在自然条件下捕食真菌的菌寄生行为一直没有发现。本实验室李世东等在对我国菌核病菌寄生菌资源调查中发现自然土壤中许多菌核病菌的寄生菌为捕食线虫真菌，进一步接种证明了这些菌类的菌寄生和捕食线虫特性（李世东 等， 2000）。其中 发现的一新种，根据其捕食线虫和寄生菌核双重特性被定名为两栖单顶孢（ （ D et 2003）。 本实验以两栖单顶孢为供试菌株，研究食线虫真菌菌寄生现象的生化酶学机理，明确菌寄生过程中的相关酶类及其作用，为开发防病杀线多功能真菌生防制剂提供基础。 中国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 7 第二章 菌寄生过程中相关酶的筛选 材料与方法 一、材料 （一）供试菌株 菌寄生菌：两栖单顶孢（ 85本实验室提供。 病原菌：核盘菌（ 由本实验室提供。 （二）试剂 几丁质 昆布多糖 块状茯苓 3， 5对二甲氨基苯甲醛 （三）供试培养基（ g/L） 1. 马铃薯葡萄糖琼脂培养基： 马铃薯 200，葡萄糖 20 琼脂 15 2种子培养基： 葡萄糖 5，蛋白胨 5，酵母浸膏粉 5， 3胶体几丁质琼脂培养基： 胶体几丁质 琼脂 20， , 胶体几丁质 4葡聚糖琼脂培养基： 葡萄糖 1，茯苓粉 4，琼脂 20， ， ，苯胺蓝 中国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 8 5诱导液体培养基： 1) 胶体几丁质 1， 2) 菌核粉 10， (， 3) 几丁质粉 10， (， 4) 蛋白胨 母膏 核 10， 5) 蛋白胨 母膏 丁质粉 10， 6) 几丁质粉 2, 马铃薯 200, 蔗糖 5, 酵母浸膏 5， 7) 菌核粉 10， ， ， 。 8) 几丁质粉 10， ， ， 。 9) 粉状几丁质 5, 菌核粉 5， ， ， 。 10）菌核粉 10， ， 11）几丁质粉 10， ， 12）马铃薯 200，蔗糖 10，酵母浸膏 5，菌核粉 2。 13）马铃薯 200，蔗糖 10，酵母浸膏 5，几丁质粉 2。 14）菌核粉 10， 15）几丁质粉 10， 16） 麸皮 10， (， 1， 17） 他命 中国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 9 二、方法 （一） 直径 9培养皿内倒入适量 养基，25恒温培养，并观察两菌落的互作。 （二）平板透明圈法检测酶活性 直径 9培养皿内倒入适量 几丁质琼脂培养基， 中央接种两栖单顶孢菌菌块， 25恒温培养，并观察菌落周围出现透明圈的情况。几丁质琼脂平板呈乳白色，在几丁质酶水解作用下，几丁质可被水解成可溶性小分子使水解部位的平板变的无色透明，根据有无透明圈 及透明圈的大小可粗略判断几丁质酶的有无及其活性大小。 直径 9培养皿内倒入葡聚糖 琼脂培养基，中央 接种两栖单顶孢菌菌块， 25恒温培养，并观察菌落周围颜色的变化。茯苓粉中的 在 1,3蓝色消失，平板上表现为无色的水解区。由此可以判断葡聚糖酶的产生情况。 （三）比色法测定酶活性 1酶液的制备 取供试液体培养基 50入 250角瓶内灭菌后用无菌移液管接入 3子液。28 180荡培养。 取培养液， 4 80000 分钟取上清液即为粗酶液。 2 几丁质酶活性测定 胶体几丁质的制备（周乐聪， 2000）： 20g 几丁质细粉（过 60 目筛）溶解在 3004预冷）中，缓慢加热到 37（一定不能升高温度），同时用玻璃棒轻轻搅动，并将温度维持在 37，待几丁质完全溶解后停止加热。 4下放置 24 小时，用玻璃棉过滤到 2000乙醇中（ 4预冷）搅拌，待呈胶体状， 10000弃上清。沉淀物用水反复漂洗至中性，再离心去除水分，重新悬浮于少量蒸馏水中。取 5体几丁质在 105 烘箱中烘干至恒重测出几丁质含量，加水调至几丁质含量为 1%。最后将几丁质胶体密封于玻璃杯中于 4冷藏备用。 试剂配制 ：称取 8g 对二甲氨基苯甲醛 溶于 70醋酸和 10盐酸的混合液中即为 1体积 9体积冰醋酸即为 1%配即用）。 配制 0、 5、 25、 50、 75、 100、 125、 150、 175、 200、 225、 250mg/l 浓度的 各浓度标准液 +100保温 7却后加入 2%7保温 1585测 立标准曲线。 中国农业科学院硕士学位论文 两栖单顶孢菌 （ 菌寄生性的酶学机理研究 10 测定步骤：取 1%胶体几丁质加入 匀， 37保温 2100000 %蜗牛酶， 37保温 30入 和硼砂溶液， 100保温 7却，加入 2%37保温 1585测定 从 准曲线求得 氨基葡萄糖的 含量计算酶活力 ，以缓冲液代替底物为对照。每毫升酶液每小生时产 1 个酶活力单位。 试剂配制：称取 20布多糖加 酸缓冲液溶解定溶至 50布多糖溶液；称取 301g 3,5水溶解定容至 100 葡萄糖标准曲线的制备：配制浓度分别为 0， 50， 100， 200， 300， 400， 500， 600，700， 800mg/l 的葡萄糖标准液，取各浓 度标准液 1入 1液沸水浴 5却，加入 5馏水混合均匀后 540测 ，建立标准曲线。 测定步骤：在试管中加入 昆布多糖， 50 预热 5 50 准确反应 10 加入 液 ,沸水浴 5 止反应。冷却 , 加 5 馏水混匀，在 540比色。测定 从葡萄糖标准曲线求得葡萄糖含量，计算酶活力。反应体系直接显色为对照。每毫升酶液每分钟产生 1g 葡萄糖的量定义为 1 个酶活单位。 4蛋白 酶活性测定 试剂配制：酪蛋白 20g 加入 10水浴中搅拌使其溶解，加入 液 390容至 1000成 2%酪蛋白（当天配用或置于冰箱中储存）；称取 氯乙酸溶于蒸馏水，定容至 1000为 取 水 于蒸馏水，定容至 1000为 酪氨酸标准曲线的制备：将酪氨酸配成 0、 10 、 20 、 30 、 40 、 50 、 60mg/l 的7 个浓度每浓度取 1 入 剂 1水浴保温 2060 。 测定步骤：取待测酶样 1对照立即加入 2酶失活）加入 2%酪蛋白迅速混匀放入 40 水浴 10加入 止反