【毕业学位论文】（Word原稿）pro-BDNF促进急性心肌梗死的进程

进急性心肌梗死的进程 中南大学湘雅二医院 410011 麻醉临床与基础研究 中青年委员会 2011 年年会论文投稿 摘 要 目的 : 检测脑源性神经营养因子的前体（ 在急性心肌梗死 （ 后心肌表达的变化，探讨 作用。 方法： 采用结扎左冠状动脉前降支建立大鼠 一大组： 穿线不结扎 ） 6只、 前 300ml/36只行免疫组化、 h、 6h、 1天、 3天、 7天、 14天（每个时间点 6只大鼠）心肌表达的变化。第二大组： 穿线不结扎 ） 10只、前 300ml/10只、 术前300ml/kg 10只、 脑源性神经营养因子（ 组（术前 300ml/10只， 术后 1天监测各组的血流动力学后，行 染色测定心肌缺血和梗死面积，并计算各组的 I/。 统计学处理： 采用 量资料的实验数据以 均数 标准差 （ x s） 表示， 多组资料之间的比较采用单因素方差分析 ( 重复测量资料的方差分析 （ M ， 组间比较采用（ ,以 P 结果： 1. 心肌表达的变化 心肌细胞和内皮细胞均有微弱 心肌非梗死区免疫阳性细胞显著增多，梗死区免疫阳性细胞增加更明显。果显示 梗死区、边缘区表达都有上调，但在梗死区表达上调最明显。 表达量在 梗死区1h 开始上升， 6h 达第一次高峰后逐渐下降， 1 天再次升高， 7 天达第二次高峰，至 14 天仍持续高表达。 四组大鼠血流动力学差异有显著统计学意义 （ P , 、 分别与 相比 dp/dp/异有显著统计学意义 （ P ; 、 相比 dp/dp/异有显著统计学意义 （ P ; 与 相比 dp/dp/异均无显著统计学意义 （ P 。 3. 染色测定心肌缺血和梗死面积结果 三组 I/R 及 I/T 比值 学差异有显著统计学意义 （ P ； 、分别与 相比 I/R 及 I/T 比值 学差异有显著统计学意义 （ P ； 与 相比 I/R 及 I/T 比值 学差异均无显著统计学意义 （ P 。 结论： 极参与 病理进程。 2 预先给予 体 可明显改善 鼠的血流动力学、减少心肌梗死的面积 ; 促进 程 。提示 能是治疗 靶点。 3 预先给予 体对 鼠的血流动力学、心肌梗死的面积无明显影响 ; 明显作用。 关键词： 硕 士学位论文 To in D to MI n= 6), 0ml/SA 0of h, 6h , 1 3 7 14 6 n=10), n=10), 00ml/kg n=10), (0ml/0n=10), TC of / R / T of of as x s) , of 硕 士学位论文 . in in in in in to h, 6h 7 4 2. of dp/ dp/dp/ dp/dp/ dp/2. TC of / R / T 士学位论文 / R / T I / R / T no 1. MI as as no on no on 前言 2 前 言 急性心肌梗死 （ 是导致全球人类死亡的主要疾病之一，探讨 求有效的治疗手段已成为目前研究的热点。 治疗 原则是尽快抢救恢复缺血心肌的血液灌注以挽救濒死心肌、缩小心肌缺血范围或防止梗死范围扩大，以及积极保护和维持心脏功能，及时处理并发症。近些年来， 治疗发展迅速，且对改善 预后起到了极为重要的作用，取得了很好的效果。目前治疗 法主要 包括溶栓治疗、冠状动脉搭桥术 (经皮冠状动脉介入 (心肌干细胞移植等。 尽管这些现代治疗方法的发展已显著改善 的预后 , 但是 高致残率和高死亡率仍然是当今医学的难题 , 因此探寻新的药物和治疗方法从未中断。近些年来研究显示，促红细胞生成素 （ 1、血管内皮生长因子（ 2、 成纤维细胞生长因子 （ 3均能 促进内皮细胞增殖 , 诱导新生血管的形成 , 积极挽救濒死的心肌细胞，甚至能促进心肌细胞增殖，从而为 的治疗提供了新的突破。 神经营养因子 (一组功能相关的多肽性生长因子，在中枢神经系统和周围神经系统中起着极为重要的作用，调节神经细胞的生长、发育、分化与死亡。随 着人们对 在非神经系统的作用也越来越受到人们的重视。 神经生长因子（ 脑源性神经营养因子 （ 是神经营养因子家族的两大成员，已 前言 3 有研究表明它们在心血管系统也有分布，且积极参与 进血管新生、参与其炎症反应 4 的前体。 放出具有生物活性的羧基端，即成熟的蛋白质 （ ，其氨基端则与成熟蛋白质的正确折叠及分泌有关。近些年来，随着人们对神经营养因子前体功能的深入研究发现，神经营养因子前体具有不同于成熟的神经营养因子的作用。越来越多的研究表明，神经营养因子前体具有诱导神经细胞凋亡的功能，其与神经损伤后神经元的死亡以及神经退行性变等神经系统疾病密切相关，作用方式与成熟的营养因子也不尽相同 7, 8。 但其在心血管的作用尚未见任何研究报道。本文旨在初步探讨 心肌的表达的变化，及其对 影响，从而为 治疗提供新的理论依据。 第一章 材料和方法 4 第一章 材料和方法 动物及分组 洁级，存活 82只，体重 (265 15)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司中心提供。 采用结扎左冠状动脉前降支建立大鼠 一大组： 穿线不结扎 ） 6只 、 前 300ml/36只行免疫组化、 h、 6h、 1天、 3天、 7天、14天（每个时间点 6只大鼠）心肌表达的变化。第二大组： 穿线不结扎 ） 10只、 前 300ml/10只、术前 300ml/kg 10只、 脑源性神经营养因子（ 组（术前 300ml/0只。 要仪器 手术 器械一套 3000数码相机 淮北正华生物仪器设备有限公 司 成都泰盟科技有限公司 美菱冰箱 中国合肥美菱有限公司 电子天平 上海光正医疗仪器 第一章 材料和方法 5 精宏电热恒温水浴箱 广州永程实验有限公司 普通光学显微镜 日本 24 16 电泳仪 摇床 （ 4） 上海市离心机械研究所 水平和垂直以及电转移电泳槽 超低温冰箱 药物与试剂 司 司 司 湘雅二医院自制 长沙安泰精细化工实业有限公司 长沙安泰精细化工实业有限公司 司 北京中杉金桥 成都市积泷化工试剂厂 司 第一章 材料和方法 6 司 司 10%水合氯醛 湘雅二医院自制 蔗糖 成都金山化学试剂有限公司 司 明胶 司 司 司 方法 0水合氯醛腹腔注射麻醉 (3.0 ml/将其固定于鼠板，用针形电极插至四肢皮下，观察记录标准肢体导 联心电图。行 颈部正中切口暴露气管， 16吸机正压辅助呼吸，潮气量 20ml/呼比1 1，呼吸频率 65次 /胸部去毛，消毒，于胸骨左缘第 4， 5肋间切开皮肤，上下纵向延伸切口约 2 层钝性分离皮下组织、肌肉至胸壁，剪断第 3， 4肋 (或第 4， 5肋 )，挑破胸膜，用眼睑撑开器撑开胸壁，暴露心脏。挑开心包膜，于右侧胸壁轻压挤出心脏，用无菌6 0号医用缝合线在肺动脉圆锥与左心耳之间距主动脉根部约3扎深度约1-2 扎完毕后将 心脏迅速放回胸腔，轻柔挤压胸腔排尽气体，逐层关闭胸腔。待大鼠恢复自主呼吸后，停止人工呼吸。观察并记录 第一章 材料和方法 7 结扎后 lO 联心电图，比较结扎前后心电图肢体导联 弓背或水平抬高（见图 1），左心室前壁颜色变白、室壁运动减弱为成功的标志 。 手术复制 图 1 大鼠左冠状动脉前降支结扎后 联 抬高 血流动力学指标的测定 术后 1天 大鼠用 10水合氯醛腹腔注射麻醉剂量较前略减，将其固定于鼠板，用针形电极插入四肢皮下，观察记录标准肢体导联心电图。行 颈部正中切口暴露气管， 16吸机正压辅助呼吸，潮气量 20ml/呼比 1 1，呼吸频率 65次 /24接 力感受器，肝素盐水排净气泡，检查动脉 导管是否畅通及压力感受器是否敏感 。 将压力感受器探头置于与大鼠左心房同一水平，进行调零 。 分离右侧颈总动脉，结扎远心端， 24入颈动脉并用 3续记录血压（ ） 。 胸 第一章 材料和方法 8 部消毒，逐层分离手术切口，眼睑撑开器撑开胸壁，暴露心脏。 将 24至左心室中部，连续记录左心室收缩末压 ( 舒张末压 ( 、左心室内压上升下降最大速率 ( 并保存。 图 2 图 3 鼠心内有创测压波形 心肌组织切片制备 检测血流动力学改变后处死，取出并分离心脏，剔除血管和心耳、右心室，生理盐水洗净，滤纸吸干。切 第一章 材料和方法 9 取心肌梗死区 (非心肌梗死区 (织 4冰箱 4%多聚 甲醛固定两天， 30 的蔗糖沉糖一天后，滤纸吸干。制备 720 保存。 免疫组化检测 1） 冰冻切片室温放置 30，油笔画圈， 53 2） 1过氧化氢甲醇溶液染缸浸泡 10 53 3） 500%00%湿盒中封闭 2h 4) 滴加适当比例稀释的一抗 (： 100) 37 孵育2过夜 5） 取出冰冻切片室温放置 30， 53 漂洗一抗 6） 配二抗（ ： 200； ） 配三抗 （ A 液、 B 液、 :1:200） 7） 加二抗，室温 2h， 53漂洗二抗 8） 加三抗，室温 2h， 53漂洗三抗 9） 色 10）自来水充分冲洗，片子干燥后行苏木精复染 11）脱水、脱脂、封片 12) 拍照 测 白表达变化 1） 分别于 1h 、 6h 、 1D 、 3D 、 7D 、 14D (各时间点均为 n = 6) 处死大白鼠 ,切取心脏 ,用生理盐水冲洗干净后，行滤纸吸干，将梗死区、边缘区、遥远区分别至于冻存管内。即置于 - 70 冰箱。 2） 收集蛋白样品 称取 心 肌 组织 50100加 0.5 利用液氮、研钵 快速 粉碎组织块 ； 加入 利用 15,000转 /分 *1分钟）维持 4 ； 加入 第一章 材料和方法 10 30分钟 ； 移入离心管 4 20,000g （约 15,000转） 15分钟 ； 上清液为细胞裂解液可分装 保存 ； 采用 取相同质量的细胞裂解液，并加等体积的 2 电泳加样缓冲液 。 每次上样前煮沸 ， 3 3) 电泳 上样前将胶板下的气泡赶走 ；将 所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用 等体积的 1 以初始电压为 45电压达 80 在目的蛋白泳动至距胶下缘 1 4） 转膜 使用常规电转液湿转 。 醇 中浸泡30滤纸也浸入转移液中。 将胶卸下，保 留 30分子量范围更广些的胶，左上切角后在 转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张滤纸。电转槽用去离子水淋洗晾干，加入 1000胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧 降 将电泳槽置于冰水混 合 物中。恒流 100 5) 免疫反应 (1) 封闭： 转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的 涤液中，漂洗 1钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有步骤，注意膜的保 湿。 第一章 材料和方法 11 用微型台式真空泵吸尽洗涤液，加入 闭液，在摇床上缓慢摇动 ,4 封闭过夜。 (2) 加一抗： 用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗 （ 1:200），室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵 育一小时。 假如 一抗孵育一小时效果不佳，可以在 4 缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入 涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤 5钟。共洗涤 3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 (3) 加二抗： 用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗 （ 1:200），室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时 ， 回收二抗。加入 涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤 5钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤 5钟 ， 共洗涤 3 次。如果结果背景 较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6） 发光 鉴定 滴加 测液，在暗室中将膜贴在 X 光 胶片上曝光大约 5规显影 X 胶片。 7） 凝胶图象分析：将胶片进行拍照，用 理系统分析目标带的分子量和净光密度值。 1）完成测压后，由颈动脉注入 1 确定未缺血与缺血心肌 (未缺血心肌呈蓝色，危险区域不染色 ) 第一章 材料和方法 12 2） 生理盐水冲洗心脏，切取左、右心房及右心室标本 滤纸吸干 3） 将离体心脏用保 鲜膜包裹，置于 下保存 1h 4） 将心室肌以平行于房室沟的方向切成 8 片，每片厚 1 2） 置入 1氯化三苯基四氮唑 (酸缓冲液 ( 37水浴 20光，振荡 ) 6） 10福尔马林固定 2天， 梗死区不染色，未梗死区染为 淡 红色， 淡 红色区与未染色区之和为 危险 区 7）将每只老鼠的 8个心肌层面正反拍照，采用 别测出每只老鼠的心肌梗死面积（ I ）、危险区面积（ R）、心肌总面积（ ） ,并计算 I/R、I/T。 计学处理 采用 量资料的实验数据以 均数 标准差（ x s） 表示， 多组资料之间的比较采用单因素方差分析 (、重复测量资料采用一般线性模型的 （ M 方差分析 ， 组间比较采用（ ,以 P 第二章 结 果 13 第二章 结 果 2.1 心 肌表达的变化 果 心肌细胞和内皮细胞均有微弱 死区免疫阳性细胞增加更明显。 (见图 1 6) 第二章 结 果 14 图 1图 6 分别示 心肌细胞和内皮细胞均有微弱 达， 心肌非梗死区免疫阳性细胞显著增多，梗死区免疫阳性细胞增加更明显。蓝色示细胞核，棕褐色示白。 果 以 为内参，各个时间点 的 净光密度值代表 1白质 相对含量， 采用 0 中 一般线性模型 ) 的 程对实验数据进行重复测量方差分析， 并进行不同时间点和不同组间的两两比较，以 P异有统计学意义。 梗死区、边缘区表达都有上调，但在梗死区表达上调最明显。 表达量在 梗死区 1h 开始上升， 6h 达第一次高峰后逐渐下降， 1天再次升高， 7 天达第二次高峰，至 14 天仍持续高表达。（见图 7 10 ，表 1） 第二章 结 果 15 表 1 不同时间点 量的比较 1h 6h 1D 3D 7D 14D + + + 以 为内参，各个时间点 的 净光密度值代表 第二章 结 果 16 的相对含量 *同一时间点与 比， P #同一时间点与比， P+同一时间点与 比， P图 10 以 为内参，各个时间点 的 净光密度值代表相对含量； 1 表达趋势 梗死区、边缘区表达都有上调，但在梗死区表达上调最 明显。 表达量在 梗死区 1h 开始上升， 6h 达第一次高峰后逐渐下降， 1天再次升高， 7 天达第二次高峰，至 14天仍持续高表达。 *同一时间点与 比， P #同一时间点与 比， P+同一时间点与 比， P 第二章 结 果 17 显改善大鼠 1D 的心功能 四组大鼠血流动力学差异有显著统计学意义 （ P , 、 分别与 相比 dp/dp/异有显著统计学意义 （ P ，说明 模成功 ; 、 与 相比 dp/dp/ P ， 心功能显著改善，提示抗 能具有心肌保护作用 ; 与 相比dp/dp/异均无显著统计学意义 （ P ，提示 可能对 明显作用。 （见表 2、图 11） 表 2 各组大鼠血流动力学的比较 dp/dp/ * P P 少大鼠 1D 心梗面积 染色测定心肌 缺血和梗死面积结果显示， 三组I/R 及 I/T 比值 学差异有显著统计学意义 （ P ； 、 相比 I/R 及 I/T 比值 学差异有显著统计学意义（ P ，从形态学上说明抗 积极影响 ； 相比 I/R 及 I/T 比值 学差异均无显著统计学意义 （ P 第二章 结 果 18 ，提示 可能对 明显影响 。（见表 3、图 12、 13） 表 3 各组大鼠 I/R、 I/T 比较 I/R I/T 第二章 结 果 19 图 13 : P 图 11 各组大鼠血流动力学的比较 (dp/dp/* P P 第二章 结 果 20 比。 第三 章 讨 论 21 第三章 讨 论 性心肌梗死 (心肌凋亡 （ 理学改变 心肌梗死 (I)是导致全球人类死亡的主要原因之一 9, 10。 因 冠状动脉 的 病变，导致 冠状动脉的血流急剧减少或中断，使相应的心肌出现严重而持久地急性缺血，最终导致心肌的缺血性坏死。 急性心肌梗死 (后心肌受损及负荷增大引起一系列神经体液变化和细胞因子 高表达，启动一系列复杂的分子和细胞机制，诱导心肌中多种基因表达改变发生心肌重塑 (R)使心肌结构、功能 和表型的 变化，主要 包括心肌细胞的肥大、凋亡；胚胎基因和蛋白的再表达；以及心肌细胞外基质组成的变化。临床主要表现为心肌重量、心室容量的增加以及心室形状的改变。 早期重塑时梗死区的心肌细胞发生水肿、凋亡、坏死，导致心肌舒缩功能障碍；晚期重塑时梗死区纤维愈合，非梗死区心肌细胞凋亡，以及 成纤维细胞增殖、细胞外基质代谢紊乱导致 心肌纤维化 11 心肌肥大和心肌纤维化，两者在 互影响。 在人衰竭心脏和动物心衰模型上都已证明心肌细胞的进行性丢失是 室功能下降的一个主要原因 14。 第三 章 讨 论 22 肌凋亡 （ 与 细胞凋亡 （ 又称程序 性细胞死亡 , 具有不同于 细胞 坏死的特征性表现。 细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡形式， 是一种主动的精密调节的耗能的过程。 其主要特征为细胞皱缩、细胞膜完整、细胞器完整、染色质固缩以及凋亡小体形成。 目前研究的诱导凋亡的基因主要有野生型 制凋亡的基因主要有 虽然凋亡和坏死在 但是由于凋亡心肌细胞数量大 , 5等采用大鼠 型的研究发现 ,冠状动脉结扎后 2 h , 可在梗死区检测到 106个心肌凋亡细胞 ,4.5 h 后可达 106个 ,随后则进行性下降 ,至第 7 天时仅有 104个。说明心肌细胞凋亡在 病理过程有着重要作用。而今越来越多的研究表明 凋亡细胞主要分布于梗死与非梗死的交界区域，提示细胞凋亡可能是早期、轻度缺血条件下心肌细胞死亡的主要方式，而严重的缺血缺氧则导致细胞坏死。 6 等研究发现 ,在冠状动脉结扎后 3 h 梗死的边缘区开始出现凋亡的心肌细胞 ,1 2 天细胞数量 明显增加 ,7 天 后开始下降 ,至 14 天 减少73 % 。而 7等人研究发现凋亡的心肌细胞于冠状动脉结扎 4 h 后开始出现 ,随后逐渐增多 ,于 48 h 后达高峰 ,其后迅速下降 ,72 h 后则未再检测到凋亡细胞 。 因此 尽快抢救恢复缺血心肌的血液灌注以挽救濒死心肌、缩小心肌缺血范围或防止梗死范围扩大是 则。 粒 体 （ 与 心 肌 凋 亡 （ 第三 章 讨 论 23 即含半胱氨酸特异天冬氨酸蛋白酶家族的总称 ,含有10 个以上成员 。 在细胞凋亡过程中处于中心地位 ， 可 将其分为两类：启始 效应 始 括 8,9,10等，对细胞凋亡的刺激信号作出反应，启动细胞的自杀过程；效应括 3， 6， 7 等，是在细胞凋亡过程中的具体执行者，完成对特定蛋白底物的水解。 越来越多研究表明， 线粒体在促 进 凋亡信号和 活之间 具有 不可替代的作用。 线粒体 约 占心 肌细胞体积的 45%,大量 研究发现 ,当心肌细胞发生凋亡时 , 线粒体 将 出现结构与功能的改变 18, 19。线粒体 通透性转 换 孔 （ 一种位于线粒体膜上的蛋白质复合物，具有调节线粒体膜通透性的功能。正常情况下，绝大多数 于关闭状态。当各种凋亡诱导因素（缺血、缺氧、药物化学等）引起线粒体跨膜电位下降时， 放，导致线粒体膜通透性增高， 使细胞色素 c(c)、凋亡蛋白酶激活因子 （ 和凋亡诱导因子 （ 等从线粒体内逸出来。 c 与 同作用下激活胞质 前体，激活而激活 联反应，诱导细胞凋亡。 白分布于线粒体外膜的