【毕业学位论文】(Word原稿)香蕉枯萎病菌GFP标记和β-葡萄糖甘酶基因克隆-分子植物病理学与植物生理学

福建农林大学硕士学位论文 分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： 建农林大学硕士学位论文 香蕉枯萎病菌 学 科 门 类：农学 一级学科名称：植物保护 二级学科名称：植物病理学 研 究 方 向：分子植物病理学与植物生理学 研 究 生： 指 导 教 师： 教授 研究员 完 成 时 间：二 0 一 0 年四月 福建农林大学硕士学位论文 of 2010 福建农林大学硕士学位论文 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论 文被查阅和借阅，学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期： 福建农林大学硕士学位论文 i 目录 目录 . i 中文摘要 . I . 错误 !未定义书签。 第一章 前 言 . 1 1 香蕉枯萎病重要性 . 错误 !未定义书签。 2 香蕉枯萎病菌的分子病理研究进展 . 错误 !未定义书签。 蕉枯萎病菌的分子鉴定研究进展 . 错误 !未定义书签。 蕉枯萎病菌的 . 错误 !未定义书签。 3 丝状真菌的转化 . 错误 !未定义书签。 究概况 . 错误 !未定义书签。 菌 化方法 . 错误 !未定义书签。 4 绿色荧光蛋白 (因在丝状真菌研究中的应用 . 错误 !未定义书签。 5 本研究的目的和意义 . 错误 !未定义书签。 第二章 香蕉枯萎病菌的分离与分子鉴定 . 7 1 材料 . 7 2 方法 . 7 蕉枯萎病症状观察 . 7 菌的分离 . 7 萎病原菌的纯化与保存 . 7 子鉴定 . 7 3 结果与分析 . 8 蕉枯萎病菌的分离 . 8 蕉枯萎病菌的鉴定 . 11 4 讨论 . 13 第三章 构建香蕉枯萎病菌遗传转化体系 . 15 1 材料 . 15 2 方法 . 16 生质体制备 . 16 色荧光蛋白的转化 . 16 化子的抗性鉴定 . 17 化子的分子鉴定 . 17 化子荧光检测 . 17 3 结果与分析 . 17 蕉枯 萎病菌原生质体形成 . 17 色荧光蛋白的转化 . 18 化子的抗性鉴定 . 19 化子的分子鉴定 . 21 化子荧光检测 . 22 4 讨论 . 23 孢镰刀菌转 因 遗传转化体系的建立与优化 . 23 第四章 因标记香蕉枯萎病菌后的生物学特性 . 24 1 材料 . 24 2 方法 . 24 福建农林大学硕士学位论文 因尖孢镰刀菌 生长特性 . 24 因尖孢镰刀菌 侵染特性 . 24 因尖孢镰刀菌的香蕉植株致病性测定 . 25 3 结论 . 25 孢镰刀菌的生长特性 . 25 孢镰刀菌的侵染特性 . 26 因尖孢镰刀菌的香蕉组培苗侵染速度 . 28 株中分离出的转化子荧光稳定性测定 . 28 因尖孢镰刀菌的香蕉植株致病性测 定 . 29 4 讨论 . 29 绿色荧光蛋白基因转化香蕉枯萎病菌 . 30 第五章 香蕉枯萎病菌 隆 . 31 1 材料 . 31 2 方法 . 31 间序列的引物设计 . 31 间序列的序列的扩增 . 32 !未定义书签。 个人简历 . 49 致 谢 . 50 福建农林大学硕士学位论文 I 中文摘要 尖孢镰刀菌古巴专化型（ 起的香蕉枯萎病是香蕉的毁灭性病害，它能侵染几乎所有的香蕉品种，特别是 4号生理小种（ 给我国香蕉的生产带来严重威胁。目前，国内外尚无十分 有效的化学防治方法，也未培育出稳定的高抗性品种，主要因为香蕉枯萎病是由维管束侵染的系统性病害，一般的化学药剂不能奏效，且而长期不清楚香蕉枯萎病菌的致病机理造成的抗病育种靶标不明确。 建立 于香蕉枯萎病菌研究基因的表达调控机理、基因功能等具有重要意义；将绿色荧光蛋白（ 因转化入香蕉枯萎病菌，研究转化后菌株的生物学特性以及在香蕉植株体内的侵染特性，为进一步研究香蕉枯萎病菌致病机理和生防提供理论基础 ； 本研究克隆香蕉枯萎 病菌的 研究此基因功能奠定基础 。主要研究结果如下： 1. 香蕉枯萎病株采自福建省漳州，经单孢分离及形态学与分子鉴定，获得 28个尖孢镰刀菌古巴专化型，其中 21个为 4号生理小种。 2. 建立香蕉枯萎病菌 的 导原生质体法 遗传转化系统，香蕉枯萎病菌的原生质体的制备是整个转化中最关键的一步， 影响原生质体制备因素很多主要包括合适的酶液、菌丝的菌龄、制备原生质体的溶菌温度和溶菌时间。本文转化方法采用的是 0.8 解的崩溃酶 (溶壁酶（ 菌龄 10h 的新鲜菌丝； 28 ，70 r化酶解 2-3 h。 3. 对尖孢镰刀菌古巴专化型 4号生理小种 记后菌株的菌丝、分生孢子、厚垣孢子的形态与亲本菌株形态基本相同，且在紫外光下都呈现绿色荧光。的基因已转入到 标记后菌株较之原始菌株的抗潮霉素能力大大增加。在无选择压力条件下继代培养 6代，转化子仍然保持强烈的绿色荧光。佳 株致病力未有 明显改变，发病率均达到 90 以上。 4. 利用激光共聚焦显微镜扫描观察结果表明，标记病原菌侵染香蕉是以孢子萌发或菌丝体从根部侵入植株体内，并沿着寄主细胞间隙扩展与蔓延，经植株的维管束组织向上生长至植株的假茎顶部。 缘物种 计简并引物，提取 尖孢镰刀菌古巴专化型 过 株 个 1473 关键词：香蕉； 尖孢镰刀菌古巴专 化型；绿色荧光蛋白基因； 物学特性；侵染 福建农林大学硕士学位论文 ne of of is . , is to to is to is is a by by oc to of of of on of in to in as 1 by 8 f. of 1 . 2 oc is of of of is .8 0h of 0 r 8 -3 h. 3 by of to to in of It in pH of 0 4 s by or of to at 5 A on of of NA CR by we of ; 福建农林大学硕士学位论文 建农林大学硕士学位论文 1 第一章 前 言 香蕉清甜柔软，口感润滑，天然无籽、食用方便等独特的风昧和营养价值深受人们的喜爱。同时，香蕉因产量高、投产早、供应期长（可全年供应）、效益好而深受生产者的欢迎 1。 目前共有 120 个国家和地区生产香蕉，其中大部分属于发展中国家，主要分布在北纬 18 之间 2。我国是香蕉原产地之一，分布在广东、广西、海南、福建、云南等热带与亚热带地区， 2005 年我国香蕉产量为 t，居全球第三位，为我国国民经济的发展做出了重要的贡献 3,4。 但随着种植面积的扩大，香蕉病害问题也日益突出。目前全世界报道的香蕉病害现今生产中重要的有束顶病、叶斑病、枯萎病、冠腐病类及炭疽病等 5。香蕉枯萎病被评价为高度危险外来物种， 在我国 2007年 5月被正式列入进境植物检疫性有害生物名录 6,7。本研究建立起一套完整的尖孢镰刀菌 古巴专化型遗传转化体系，并进行转化子生物学特性的变化测定，以了解转基因对尖孢镰刀菌生物学特性的影响，并利用转化子研究在香蕉植株体内的侵染特性和体内分布状况等问题进行研究。同时，克隆香蕉枯萎病菌的 期将来探索 1 香蕉枯萎病重要性 香蕉枯萎病又名香蕉巴拿马病、黄叶病 ， 是一种世界性广泛分布的毁灭性病害 8，也是香蕉产区最为严重和著名的毁灭性病害之一 9； 1874年 报道了此病 , 1910年巴拿马香蕉就此病损失惨重 ；我国台湾于 1967年首次发现该病危害对香蕉产业造成巨大破坏；目前广东、福建、海南、广西等蕉区也都发现有枯萎病的发生 9在香蕉枯萎病发生区，一般病园发病率为 20 %，严重的在 60 %以上 14。 香蕉枯萎病现几乎蔓延到所有的香蕉种植国家与地区 15。 香蕉 在幼龄期感病无明显的症状，到成株期时最下部叶片及其叶鞘呈橙黄色，从叶边缘向中脉逐渐扩展，叶片自下而上相继发黄，叶柄在靠近叶鞘处折曲，病叶凋萎，倒挂 在假茎旁。有些病株则从假茎外围的叶鞘近地面处开裂，渐向内扩展，层层开裂直到心叶，并向上扩展，裂口褐色干腐。在病株内部，有黄褐色病变的维管束， 根部木质导管变为红棕色，一直延伸到球茎内，后来黑褐色而干枯 16 香蕉枯萎病是一种的植物土传病害，由尖孢镰刀菌古巴专化型（ 起 19该菌主要形态特征是马铃薯葡萄糖培养基上（ 落呈放射状生长，菌落颜色为淡紫、粉红及白色等，可产生大型分生孢子，小型分生孢子以及厚垣孢子。迄今尚未发现尖 孢镰刀菌的有性阶段。分生孢子萌发的温度范围是 8 ，最适温度是 28 ， 范围是 3适 5 菌丝生长的温度范围是 8 ，最适温度是 26 ， 范围是 3最适 2。在相对湿度 100 %的条件下，病原菌分生孢子萌发率最高；碳源营养条件比氮源更有利于分生孢子萌发；光照可以促进分生抱子的萌发 23。 福建农林大学硕士学位论文 2 目前已报道香蕉枯萎病菌有 4个生理小种， 1号生理小种呈世界性分布，侵染龙芽蕉类； 2号生理小种只侵染杂种三倍体棱香蕉 且仅局限于中美洲，对香蕉栽培品种危害较小； 3号生理小种只侵染野生蝎尾蕉属 4号生理小种在亚洲与非洲的部分国家以及澳大利亚发生危害，严重威胁世界香蕉第一大种植品种 及 A)和 其寄主范围大于生理小种 1号，毒性最大 24,25。目前国内 4号危害最为广泛和严重 4,26,27,17。 2 香蕉枯萎病菌的分子病理研究进展 蕉枯萎病菌 的分子鉴定研究进展 对于香蕉枯萎病菌分子生物学的研究，集中在基因组 害症状诊断以及常规病原物分离培养检测这样的传统技术，要求要有一定的病原菌分类知识与经验，还有费时、且漏检率高的缺点 28。随着分子生物学的发展，以 外 65个 将所有菌株划分起源的系谱 21。目前有许多根据 式 中针对 。漆艳香等 利用 、 4号生理小种进行遗传多样性分析，且寻找到 1、 4号生理小种的特异条带，为在分子水平上进行香蕉枯萎病菌生理小种鉴定提供了方便 26。 刘景梅等用 和 29。王国芬等对根据香蕉枯萎病菌 (用于香蕉枯萎病的早期鉴定和病原菌的检测 30。 台湾学者 蕉枯萎病 4号生理小种（ 异引物 1。廖林凤等用 中一个引物成功地建立了4号生理小种的快速诊断 32。 农业部公告第 1298号于自 2010年 2月 1日将实行香蕉镰刀菌枯萎病诊断及疫情处理规范。 蕉枯萎病菌的 2, 1, 21) , 属于水解酶类，其英文名 称 名龙胆二糖酶、纤维二糖酶或苦杏仁苷酶 33。是纤维素 酶的主要成分之一，纤维素酶是由包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和 个主要成分组成的诱导复合酶系 34。 纤维素酶组分种该酶含量最少、活力普遍较低，因此成为纤维素酶解的瓶颈。该酶分布较为广泛 ,尤其是植物的种子和微生物中尤为普遍 35,36。 不同来源的 不同来源的 活力、分子量、等电点、 稳定性范围、最适反应 、适反应温度和热稳定性范围上均有很大差别 33。酶的相对分子质量一般在 40000间。众多研究结果表明， 最适反应一般都在 围内，其中有许多酵母、细菌的胞内该酶的最适反应 接近 右；一般该酶的 稳定性范围较广，在 围内，糖苷酶的稳福建农林大学硕士学位论文 3 定性较好。 0 之间都有分布。对大部分 们的 都在酸性范围，一般在 间，变化不大，。如来源蜜蜂的 接近 3,37。 目前已经发现的产生 核生物、古细菌 3个界，几十个属，共几百个种