【毕业学位论文】(Word原稿)柑橘木虱内生细菌种类多样性-微生物应用与基因工程

分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： 1101737 福建农林大学博士学位论文 柑橘木虱内生细菌种类多样性 学 科 门 类：理学 一级学科名称：生物学 二级学科名称：微生物学 研 究 方 向：微生物应用与基因工程 研 究 生： 指 导 教 师： 博士、 研究员 博士、 副 研究员 完 成 时 间：二 O 一三年四月 he on 2013 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件， 允许论文被查阅和借阅 ; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期 福建农林大学硕士学位论文 I 目 录 中文摘要 . I . 言 . 1 1 研究背景 . 1 橘黄龙病的危害 . 1 橘木虱对黄龙病的传播作用 . 1 橘黄龙病 /木虱的防治问题 . 1 橘木虱内生菌的研究进展 . 2 2 研究方法与技术 . 4 交试验优化木虱内生细菌培养基 . 4 6S 因序列分析的应用 . 4 时荧光定量 术 . 5 针实时荧光定量的应用 . 6 3 本研究的目的和意义 . 6 4 技术路线 . 7 第一章 柑橘 木虱内生菌 取方法的筛选 . 8 1 引言 . 8 2 材料和方法 . 8 料 . 8 菌 取方法 . 8 度和纯度检测 . 10 应条件 . 10 物的克隆试验 . 10 3 结果与分析 . 10 取木虱内生菌 检测结果 . 10 度检测结果 . 11 应结果 . 11 物克隆结果 . 11 4 讨论 . 12 第二章 柑橘木虱内生细菌的 16S 定 . 13 1 引言 . 13 2 材料与方法 . 13 料 . 13 验方法 . 13 3 结果与分析 . 15 4 讨论 . 19 第三章 柑橘木虱可培养内生细菌的分离、鉴定 . 21 1 引言 . 21 2 材料与方法 . 21 试样品 . 21 试试剂 . 21 福建农林大学硕士学位论文 试仪器 . 21 法 . 22 离木虱内生细菌培养基的优化筛选 . 22 橘木虱内生细菌 的 16S 定 . 22 橘木虱细菌生理生化鉴定 . 23 3 结果与分析 . 23 虱内生细菌培养基的优化筛选 . 23 橘木虱内生细菌的 16S 定 . 24 橘木虱内生细菌生理生化鉴定 . 24 4 讨论 . 26 第四章 虫龄、温度对柑橘木虱内生细菌的影响 . 28 1 引言 . 28 2 材料与方法 . 28 验材料 . 28 量 准样品的标准曲线的制作 . 29 同处理后柑橘木虱实时荧光定量检测 . 29 3 结果与分析 . 29 株标准曲线的制备 . 29 虱样品实时荧光定量结果与分析 . 31 4 讨论 . 33 第五章 柑橘木虱可培养性内生菌与寄主植物内生菌群 落的相似性 . 35 1 引言 . 35 2 材料和方法 . 35 料 . 35 法 . 35 3 结果与分析 . 36 橘根际土壤、不同器官和木虱内生细菌的分 离与鉴定 . 36 橘木虱内生菌群落与寄主不同部分细菌群落 的相似系数 . 39 4 讨论 . 39 第六章 结论与展望 . 41 1 结论 . 41 2 展望 . 42 参考文献 . 42 附 录 . 48 个人简历 . 71 致 谢 . 73 福建农林大学硕士学位论文 I 中文摘要 柑橘木虱（ 通过传播黄龙病给柑橘产业造成巨大损失。了解柑橘木虱内生菌群落组成和影响因素，可为研究木虱内生菌与黄龙病菌在虫体内的互作关系，探索防治柑橘黄龙病新途径提供参考。 本文 结合细菌分离培养和分子生物学方法，研究柑橘木虱内生细菌群落结构及其与寄主不同部位内生菌群落的相似性。此外，采用实时荧光定量 术测定不同龄期、不同温度对木虱内生细菌 胞体共生菌） 和 沃尔巴克氏体共生菌 ） 含量的影响。主要有以下研究结果： 参考 3 种昆虫 取方法和试剂盒法提取木虱内生菌 用细菌 16S 果显示， 所参考的 3 种 昆虫 取 方法 得到的 总 整性较低， 增需 要进一步摸索。 剂盒法提取的总 度和完整性较高，浓度相对较低，但是浓度为 12L， 1L 就可以得到很好的扩增效果。 增产物可以很好的进行克隆测序。所以 试剂盒法提取 木虱内生菌总 合适 。 利用试剂盒提取木虱内生细菌 过分子生物学技术以 16S 因为基础对柑橘木虱成虫内生细菌群落结构进行研究。对随机挑取的 100 个克隆子进行测序比对和系统发育树分析后，结果显示所克隆的序列可分成 8 个组。第一组含 34 个克隆子， 所克隆序列 与 . 橘木虱 合胞体共生菌 ） 16S 列（ 的 相似性为 99第二组 为 . （ 16S 似性为 99%）， 仅 含 1 个克隆子 ， 与第一组的相似性为 80第三组含克隆子 1 个， 所克隆序列 与 . 橘木虱 沃尔巴克氏体共生菌 ）的 16S 列（ 相似性为 100%。第四组， 16 个克隆子，它们与 l）（ 褐飞虱沃尔巴克氏共生菌）的 16S 似性为 100%；与第三组序列的相似性为 98第五组 15 个克隆子，与 柑橘木虱另一种沃尔巴克氏体共生菌 . 16S 相似性为 99与第三、第四组的相似性为 34第六组含 1 个克隆子，其序列与其余 99 个克隆子的序列 相似 性为 32在 与其同源性最高的序列为 . 6S 段 （ 相似 性 91%。第七组含 1 个克隆子， 是 In （一种不可培养的泛菌）， 其序列与其它 99 个克隆子目标 序列的 相似 性为 32第八组含 31 个克隆子，与 . （柑橘木虱 次生内共生菌 ） 的同源性为 99 正交试验 34） 筛选结果表明， 养基 （ 添加柞蚕蛹血淋巴可以分离出较多的柑橘木虱可培养性内生细菌。根据菌落形态的差异，将正交试验中分离到的 福建农林大学硕士学位论文 橘木虱内生细菌进行初步分类 ； 通过纯化培养，提取细菌 行 16S 定 ；再通过生理生化特征测定，对鉴定结果进行验证 。经鉴定 ，柑橘 木虱可培养性内生菌有：木糖葡萄球菌（ 葡萄球菌属（ 一个可能的新种 、芽孢杆菌属（ 、肠杆菌属（ 、短小杆菌属 的 砖红色微杆菌 （ 嗜麦芽寡养单胞菌（ 柠檬色短小杆菌（ 对柑橘木虱体内含量较高的 合胞体共生菌 ） 和 沃尔巴克氏体共生菌 ） 构建的标准曲线判定系数分别达到 归方程分别为 + + 木虱体内 ， 均含量在成虫与若虫之间存在 显著差异。 量高温 （ 35处理 显著性增加 。 同一龄期）体内 高温 （ 35处理 1 d 显著减少， 3 d、 5 d 后 显著 性增加 。 利用优化后 2个随机选取的柑橘品种的不同部位的内生细菌以及其上面的五龄木虱内生细 菌进行分离鉴定，分析其相似系数。 结果表明， 柑橘木虱体可培养性内细菌较少， 其中 萎蔫短小杆菌） 、 地衣芽胞杆菌 ） 在寄主植物根、茎、叶内部及根区土壤中均存在，且数量较多。 在不同柑橘品种间，柑橘木虱 的内生菌群落相似系数（ 著高于它与茎、根部内生菌群落和土壤微生物群落的相似系数。柑橘叶片内生菌群落在不同品种间的稳定性也较高，其相似性系数为 同柑橘品种间，土壤细菌群落的相似数较低，它与其它部们细菌群落的相似系数也较其它群落间的低。柑橘木虱内生菌群落分别与寄主叶、茎、根、土壤细菌群落的相似系数之间不存在显著的差异。 关键词：柑橘木虱；内 生细菌；群落结构； 16S 因；实时荧光定量 福建农林大学硕士学位论文 he on to on of CP a on LB CP be to to In of as as in s in of as a