【毕业学位论文】（Word原稿）胸膜肺炎放线杆菌ApxⅢA基因的克隆表达及毒力因子免疫原性的测定预防兽医学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 胸膜肺炎放线杆菌 A 基因的克隆表达及毒 力因子 免疫原性的测定 A A I 摘 要 猪传染性胸膜肺炎 (由胸膜肺炎放线杆菌 (起的以肺出血、坏死和纤维素性渗出为主要病变的高度接触性传染病。自 1957 年 次报道本病以来，该病在世界范围内广泛流行，并给各国养猪业带来了严重的经济损失。由于 易产生耐药性，疫苗接种是防控本病的主要措施。目前，国内主要使用灭活疫苗预防和控制本病。但由于 清型较多，灭活疫苗的保护效果十分有限。因此，开发新型疫苗已经成为研究热点。 本研究通过基因工程方法 ，重组表达 一种毒力因子，制备了重组亚单位疫苗，并进行了免疫保护效果的探讨。研究表明， 泌的外毒素（ 外膜蛋白（ 不仅是 要的毒力因子，同时也是重要的免疫原性因子。 1 成功构建了重组表达载体 A。并将 3 种重组表达载体 A 、 二种为实验室已经构建好）分别在大肠杆菌 进行诱导表达，获得 3 种重组蛋白 A（ 、 大小分别约 41、 41 和 45析表明， 3 种重组蛋白具有良好的抗原性。 2 将 合作为疫苗组， ， 、 3、 7 型菌制备的灭活疫苗作为疫苗组，作为空白对照组，进行家兔的免疫试验。免疫共分 3 次，每次间隔两周。通过间接血凝试剂盒检测血清特异性抗体、评价重组亚单位疫苗的免疫保护效果。结果表明，疫苗组的抗体水平均显著 高于疫苗组，但是疫苗组抗体水平不如疫苗组，其血清效价最高滴度为 1： 256。 关键词 ： 胸膜肺炎放线杆菌 ， 毒力因子 ， 克隆 ， 表达 ， 重组亚单位疫苗 ， 免疫试验 is a is by in 957, it in in PP a to At an is CP PP 5 so of is a an PP in It mp as 1 A mp 2 of r r ); of 、 3 ( of of of of of :256. 录 第一章 引言 . 1 传染性胸膜肺炎的概况 . 1 原学 . 1 行病学 . 2 床症状和病理变化 . 3 . 3 理变化 . 4 . 4 . 4 生物学诊断 . 4 清学诊断 . 5 子生物学诊断 . 7 . 8 . 8 . 8 . 9 . 9 . 10 . 10 . 11 . 11 . 11 . 12 . 12 苗 . 12 . 13 . 15 第二章 胸膜肺炎放线杆菌 A 基因的克隆和原核表达 . 17 料与方法 . 17 株与质粒 . 17 要试剂 . 17 要仪器 . 17 菌的培养 . 18 . 18 目的 . 20 隆重组质粒的鉴定 . 21 达载体的构建 . 22 组菌的诱导表达 . 26 果与分析 . 26 . 26 . 26 . 27 . 28 论 . 29 第 三 章 毒素、外膜脂蛋白的表达 及重组蛋白的纯化 . 30 料与方法 . 30 株及质粒 . 30 要试剂 . 30 要仪器与设备 . 30 组质粒的表达及鉴 定 . 31 组蛋白的提纯与复性 . 34 果与分析 . 37 组蛋白的鉴定 . 37 论 . 39 第 四 章 动物免疫试验 . 40 料与方法 . 40 组表达蛋白和实验动物 . 40 要试剂 . 40 苗的制备 . 40 物分组及免疫 . 41 体监测 . 41 果与分析 . 43 论 . 44 第 五 章 全文总结 . 46 参考文献 . 47 致谢 . 56 作者简历 . 57 附录 1 . 58 V 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 A 基喋呤 原 苄青霉素 硫酸铵 血清白蛋白 -(1-(环己氨基 )磺酸 氨基联苯胺 甲基亚砜 氧核糖核苷三磷酸 硫赤藓糖醇 硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 二醇双（ 2乙酸 联免疫吸附试验 原型谷胱苷肽 化型谷胱苷肽 胱甘肽 H 黄嘌呤 丙基硫代 乳苷 那霉素 B 培养基 文缩写 英文全称 中文名称 NC 酸纤维素 苯二胺 酸盐缓冲液 酸盐吐温缓冲液 乙二醇 二烷基硫酸钠 酮酸钠 T 腺嘧啶 羟甲基氨基甲烷 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引言 传染性胸膜肺炎的概况 猪传染性胸膜肺炎（ 由胸膜肺炎放线杆菌 (起的高度接触性呼吸道疾病。该病主要以肺出血、坏死和纤维素性渗出为病变特征。它可致各年龄段的猪发生急性和慢性感染， 常与巴氏杆菌等混合感染。病猪发热 (可达 42 )，呼吸困难，食欲不振；剖检可见纤维素性胸膜肺炎，多感染两侧， 65%的肺叶病变严重； 发病率和死亡率 常在 20%以上，最急性型的死亡率可高达 80% 100%； 慢性猪传染性膜肺炎潜伏于猪群内，可使猪只生长缓慢，平均日增重下降，饲养报酬降低，给养猪业造成巨大的经济损失。同时，急性感染耐过或阴性感染的猪只将是带菌者，成为本病再次爆发和流行的潜在传染源，是本病防控和根除的隐患。另外 , 感染 由于胸椎间脓肿压迫脊髓而引起后躯麻痹。自 1957年在英国首次报道以来，欧洲、美洲和亚洲的许多国家和地区都先后报道本病流行严重，成为世界性工业养猪的主要疫病之一。 20世纪 80年代以来 , 由该菌引起的呼吸道传染病在我 国陆续报道以来 ,广泛流行，且呈逐年上升趋势。 本病几乎遍及全世界所有养猪国家，流行日趋严重，成为世界性规模化养猪的重要疫病之一。 原学 胸膜肺炎放线杆菌 (猪传染性胸膜肺炎的病原菌，原名为副溶血嗜血杆菌 (胸膜肺炎嗜血杆菌（ （ et 1981）。后来因该菌在形态、生化特性及 源性方面与李氏放线杆 （ 系密切，于 1983 年被归入放线杆菌属，正式命名为胸膜肺炎放线杆菌 (et 1983) 。 革兰氏阴性小球杆菌，有时呈线状或多形性。有荚膜或不完全荚膜。不形成芽孢且无鞭毛。有菌毛，直径约 2度约 60 450菌为兼性厌氧菌，且营养要求较高。初次分离时应供给 5% 10%最适合生长的培养基为巧克力琼脂平板和绵羊血琼脂平板 （张耀相等 , 2004） 。 根据 长是 否需 要烟 酰胺 腺嘌 呤二 核苷 酸 （ 分为两个生物型，即生物 赖菌株）和生物 赖型） (et 1992; et 1997)。其血清型的划分是依据荚膜多糖 (P)和脂多糖(抗原性。根据抗原性的不同，又分为 15个血清型。中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 2 其中 et 2002)。生物 12型和 15型，生物 3型和 14型 （ et 1999） 。各血清型之间的交叉保护性不强，其中 1、 4和 6型之间及 3、 6和 8型之间有交叉反应，这种交叉反应主要是由于在外膜蛋白上存在共同的抗原决定簇。其中生物型对猪具有致病性。生物型中的 1、 5、 9、 10、 11等 5种血清型致病力最强。生物型 (13和 14)分布于欧洲及美国，其致病性比生物型要弱。多数国家为复合型感染。 生物 血琼脂平板上难以生长或不生长，而需在培养基上划一条金黄色葡萄球菌线，其产生的较多 37培养 24葡萄球菌附近可形成表面光滑、圆形、稍突起、边缘整齐、针尖大小的菌落，呈明显的 一现象被称为“卫星现象”。生物 37培养 24样呈 溶血素周围产生一个不断增大的溶血区，越靠近划线的菌苔，溶血区越大，形似杯状，这一现象称为 et 995)。许多试验数据已证明生物 型菌。一般来说，分泌 、5、 9、 10和 11型比其他血清型毒力强，最常见于严重爆发、高死亡率和严重的肺脏病变。其他血清型的毒力较弱，死亡率也较低。血清 3型和 6型的毒力通常被认为很低 (et 1990)。 括荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、蛋白酶、溶血外毒素、粘附因子和菌毛等，其中溶血外毒素是引起宿主肺部病变的最主要因素 (et 1990; 王春来等 , 2001)。 外界环境的抵抗力弱， 60 15燥情况下易 死亡， 对 常 用消毒剂敏 感。但 对结晶紫 有一 定 的 抵抗力 。 该菌对氟苯尼考、头孢拉啶、甲氧苄啶、头孢噻呋等抗菌药敏感，对 杆菌 肽 、林 可 霉 素、 壮观霉 素 、 链霉素、青霉素、红霉素、氟哌酸、卡那霉素和复方磺胺等药物不敏感 (et 2005)。 行病学 感染胸膜肺炎放线杆菌的母猪群表现典型的血清学阳性反应，这些母猪通过初乳传递高滴度的母源抗体给它们的后代。仔猪大约在 4 周龄时将失去母源抗体的保护，到 9 周龄时母源抗体 消失，此时仔猪就处于 威胁之下。研究表明，猪胸膜肺炎的发生与 感染剂量有关，当生长猪遭受到数倍于感染剂量的 击时，胸膜肺炎就会暴发，这就是临床上常见的猪胸膜肺炎多发于 12麦的 J P 个曾发生过肺炎的育肥猪群，当猪在 20，采用 术发现猪舍空气中存在胸膜肺炎放线杆菌，而同一批猪上市(80，猪舍空气中却没有发现 表明，猪在进入育肥舍后不久，经空气传播的胸膜肺炎会突然发生，其后将逐渐减少，并可能恢复正常和获得 免疫力。 自 1957 年 首次报道猪传染性胸膜肺炎以来，世界大部分国家相继报道了本病的暴发和流行。 如欧洲、美国、加拿大、墨西哥、南美、韩国、日本、中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 3 中国台湾省、澳大利亚国。 清型较多，不同的国家和地区流行的血清型不同。血清 1、 5 和 7 型在北美较为多见 （ et 1990） ；血清 2 型在瑞士和瑞典发现的最多 （ et 1992）； 丹麦主要流行血清 2、 6 和 12 型；加拿大主要流行 1、 3 和 5 型；而大多数欧洲国家则以血清 1、 2、 5、 7、和 9 型为主 （ et 1993）。 我国在上世纪 80 年代以前主要以分散饲养为主，没有猪传染性胸膜肺炎报道。 90 年代后，随着养猪业规模的逐渐扩大，加上国家由外引种及地区之间引种工作的频繁进行，该病在我国流行开来。 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所杨旭夫等于首次于国内发现临床病例，并通过病原分离、鉴定、血清分型、人工接种及血 清学检查等证明了该病在我国的存在和流行 。 随着集约化养猪业的突飞猛进，该病的发生呈逐年上升趋势。自 2000 年以来，猪传染性胸膜肺炎在国内多处出现暴发性流行。上海、浙江、广东、湖北、湖南、河南等 地尤为严重，据报道，仅杭州郊区某猪场因该病就造成近 3 万头猪只死亡。近年来，我国大多数省市报道有此病的发生，但不同地区流行的血清型有所差异。但主要以 1、 3 和 7 型为主。 床症状和病理变化 床症状 自然感染潜伏期为 1更久，人工感染可在 6病。根据猪的免疫状态、不利环境的应激和对病原体的暴露程度不同，临床症状存在着差异，可以分为最急性、急性和慢性三种。最急性型 同舍或不同舍个别猪只突然发病，体温升高可达 上，精神沉郁，食欲不振，有短暂的轻微腹泻和呕 吐，无明显的呼吸道症状。疾病后期出现高度呼吸困难，呈犬坐姿势，鼻孔流出泡沫样淡血色的分泌物，脉搏增速，心衰，耳、鼻、四肢皮肤出现紫斑， 在 24死亡。个 别 幼 龄 猪 只 因 败 血 症 死 亡 ， 但 并 不 出 现 上 述 临 床 症 状 。 病 死 率 高 达 80% et 1988)。急性型同舍或不同舍的许多猪只患病，体温上升到 41，精神沉郁，食欲不振 ,呼吸困难，常出现心脏衰竭。病程根据肺部病变程度及开始治疗时间的不同而异，可能发生死亡，也有可能转为亚急性或慢性型 (et 1994)。亚急性和慢性型多由急性型转化而来，体温不升高或很少升高，也有的可达 40。病情较轻猪只呈连发性或间歇性咳嗽，食欲不振，日增重减慢，出现一定程度的异常呼吸。这种症状经过数日乃至一周，或治愈或进一步恶化。慢性感染期的猪群症状表现不明显。在首次爆发本病的猪群中还可能出现流产病例，特别是 群。个别猪只可发生关节炎、心内膜炎以及不同部位出现囊肿，在慢性感染猪群中常存在隐性感染猪，一旦其他病原体（如副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌等）经呼吸道感染，可使症状加重。最近有报道，感染了 猪只还可患中 耳炎。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 4 理变化 通过解剖感染猪只可以发现，呼吸道的损伤主要在肺部 （ 1992） 。在疾病早期，其组织学病变包括坏死，出血，嗜中性白细胞浸润，巨噬细胞和血小板激活，血管内血栓形成。后期则主要以巨噬细胞浸润为特征（ 吴家强等 , 2002） 。最急性型 可见患猪流血色鼻液，气管和支气管充满泡沫状血色黏液性分泌物。其早期病变颇似内毒素休克性病变，表现为肺泡与间质水肿，淋巴管扩张，肺充血、出血和血管内有纤维素性血栓形成。肺炎病变多发于肺的前下部，而在肺的后上部，特别是靠近肺门主支气管周围， 常出现周界清晰的出血性突变区或坏死区(et 1990)。急性型 肺炎多为两侧性，常发生于尖叶、心叶和膈叶的一部分。病灶区呈紫红色，坚实，轮廓清晰，间质积流血色胶样液体，纤维素性胸膜炎明显。肺脏以外的病变表现为肾小球毛细血管、入球动脉和小叶间动脉有透明血栓，血管壁纤维素样坏死，此为内毒素血症所致 (et 1986)。亚急性型 肺部可能发现大的干酪性病灶区或含有坏死碎屑的空洞。由于继发细菌感染，致使肺炎病灶转为脓肿，后者常与肋胸膜发生纤维性粘连。慢性型常于膈叶见到大小不等的 结节。其周围有较厚的结缔组织环绕，肺胸膜粘连。感染了慢性传染性胸膜肺炎猪只很难进行确诊。因为患急性传染性胸膜肺炎后所造成的肺部损伤在几周后会减轻，而患慢性传染性胸膜肺炎所形成的肺部损伤很难与其他的病原所形成的损伤相区别 （ et 1994） 。这些肺部的损伤多为红色的斑块，纤维化程度较轻 （ et 1990） 。 断方法 临床诊断 本病发生突然，传播迅速，并伴发高热和严重呼吸困难，死亡率高。死后剖检可见肺脏和胸膜有特征性的纤维素性坏死性和出血 性肺炎、纤维素性胸膜炎，通过以上临床症状、病变以及流行病学可以作出初步诊断，进一步确诊则需要进行实验室诊断和血清学诊断。 生物学诊断 片镜检 无菌采集新鲜肺、肝、肾脏触片，革兰氏染色镜检，镜下可见革兰氏阴性的球状杆菌，无芽孢，有荚膜。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 引言 5 原分离 新鲜病料较容易从支气管、鼻腔分泌物或肺部病变中分离得到病原。初次分离可用 10%绵羊血液琼脂平板，与表皮葡萄球菌交叉划线， 10%37温箱培养24见划线附近有 小菌落。其周围完全溶血，呈典型的 是一种快速的细菌诊断方法。然后，可以挑取可疑菌落纯培养后作细菌特性鉴定。 清学诊断 同血清型有各自的型特异性抗原（主要是荚膜多糖和脂多糖的抗原性不同），大多数血清型之间没有交叉反应。但在某些血清型之间，荚膜多糖和脂多糖却非 常相似，所以交叉反应又时有发生。交叉反应最易发生在血清3、 6、 8， 1、 9和 11型及 4和 7型之间 （ et 2000） 。这些交叉反应不仅阻止了分离株的分型，对于疾病暴发时流行病学调查也 是一个障碍。尤其是不同血清型 此，使得 异、快速且有效的诊断方法。 体结合试验 ( 本方法是最早用于胸膜肺炎放线杆菌血清学诊断的实验之一，由于其灵敏度与准确性高，又不需要特殊设备，因此至今仍是一些传染病诊断的常用方法。 1971年， 979)。国内朱士盛等人于 1987年对补体结合试验方法，诊断猪胸膜肺炎获得满意结果，混合抗原与单价抗原的敏感性欲特异性比较，一般前者比后者高一倍。因此，最佳混合抗原的应用有利于该病的流行病学调查。 有较好的敏感性和特异性，检出率可达 100%，能够区分胸膜肺炎放线杆菌和猪副嗜血杆菌 (et