HPLC法测定越橘益视胶囊中叶黄素的含量

IHPLC法测定越橘益视胶囊中叶黄素的含量摘要：目的本文建立了简便易行、准确的HPLC-DAD法测定越橘益视胶囊中叶黄素的含量。方法取样品0.3g，加水溶解后再加入含0.1%BHT的丙酮，在避光低温的条件下超声提取，定容，过滤。色谱条件为资生堂MG色谱柱(4.6mm250mm，5m)；流动相：甲醇-甲基叔丁基醚（85:15）；流速：0.2mL/min，柱温：25，检测波长445nm。结果叶黄素在0.8488-42.44g(r=0.9999)之间呈良好的线性关系，平均加样回收率为96.42%，RSD为3.46%。结论用高效液相色谱分离，二极管阵列检测器检测，测定叶黄素的方法精密度、稳定性等均能满足保健食品中叶黄素分析要求，且灵敏度高，重现性好，操作简单快速，可作为越橘益视胶囊中叶黄素含量测定方法。关键词：越橘益视胶囊；叶黄素；高效液相色谱法；含量测定IIDeterminationofluteininYuejuYishicapsulebyHPLCAbstract：0bjectivewesystematicallyresearcheddeterminationmethodsofluteininYuejuYishicapsulebyHPLC-DAD,whichissimpleandaccurate.Methods0.3gramsamplewith5mlwatertodissolveandthenaddedabout40ml0.1%BHTacetonewasoscillatedtoextracttheluteininlowtemperatureandfiltratedby0.45mfilterbeforesampleinjectionfordetection.TheShiseidoMGIIC18column(4.6mm250mm，5m)wasusedunderthemobilephaseofmethanol-methyltert-butylenter(85:15,v/v)ataflowrateof0.2mL/min.Thecolumntemperaturewasmaintainedat25andthedetectionwavelengthwas445nm.ResultsTherewasagoodlinearrelationshipattherangesof0.8488-42.44gforlutein(r=0.9999).Theaveragerecoveryratewas96.42%withrelativestandarddeviation(RSD)of3.46%.ConclusionThemethodwithHPLCseparationandDADdetectioncanmeettherequirementsforanalysisofluteininhealthcarefoodwithfeaturesofhighprecision，highstability，simpleandrapidItissuitablefordeterminationofluteininYuejuYishicapsule.Keywords:YuejuYishicapsule;Lutein;HPLC;Contentdetermination目录摘要.-1前言.12材料与仪器.32.1使用的主要试药及溶剂.32.2使用的主要仪器.33方法.43.1叶黄素的对照品溶液制备.43.2测定波长的选择.43.3供试品溶液的制备.53.4色谱条件.53.5方法学考察.54讨论.114.1提取溶剂的选择.114.2色谱条件的选择.124.3方法学验证结果.145结论.14参考文献.16综述.17致谢.2201前言越橘益视胶囊以天然植物越橘提取物和叶黄素粉为主要成分，并含有多种眼睛所需的营养，能够缓解视疲劳，提高视力，具有一定的改善视力的保健功能。越橘是杜鹃花科植物，多年生落叶灌木，高至40厘米，花白色或粉红色，果实为浆果，蓝色或红色，近圆形。其中蓝果越橘(俗称蓝莓)，在世界范围内栽培面积最大。其主要成分有天然视紫质（Rhodopsin）和类黄酮（Flavonoid）。视紫质是眼睛产生视觉的最基本物质，可加强适应对黑暗弱光的敏感度。类黄酮具有维生素P的活性，是保护血管的物质。叶黄素是一种具有和越橘花青素同等地位的视觉营养物质，是一种非常重要的抗氧化剂，为类胡萝卜素家族的一员，又名胡萝卜醇。叶黄素是一种无维生素A活性的类胡萝卜素，其分子式为C40H56O2，链末端含有羟基基团，其结构式如图1，是由8个异戊二烯为单位所组成的含有2个羟基的共轭烯烃。易溶于氯仿、二氯化碳，可溶于正己烷，微溶于醇、醚，呈黄色。在类胡萝卜素中，叶黄素与胡萝卜素有区别。其一，分子结构的不同，叶黄素是含氧化合物，比胡萝卜素的链末端多2个羟基，普遍认为叶黄素比胡萝卜素具有更强的抗氧化性。对于机体，叶黄素可通过自由基机理抑制活性氧自由基的活性，阻止活性氧自由基破坏正常细胞，从而增强机体的免疫能力，因此叶黄素独特的化学结构不仅决定其颜色，更决定其其他的理化性质。其二，叶黄素和胡萝卜素区别之处在于，如-胡萝卜素具有2个-紫萝酮环，是最有效的维生素A原，具有维生素A的各种功能，但是人体过多食入维生素A，维生素A将在体内沉积，损害肝脏或引起维生素A的过多症。然而叶黄素不具有维生素A的功能，人体过多食入，不会出现这种副作用。叶黄素存在于视网膜黄斑区的主要色素，有抗氧化和过滤蓝光的作用1，从而保护眼底组织免受光毒性伤害2。每日人体接受的光照中，短光(蓝光)对人体的伤害很大，消耗大量的叶黄素，而叶黄素在人体内不能合成，必须补充一定量的叶黄素以维持身体健康。此外，叶黄素还能减少很多种眼科疾病的发生，例如老年性视网膜黄斑变性（AMD）、白内障、结膜炎和畏光等3。因此，市场上出现了大量叶黄素保健品，为监管叶黄素保健食品的质量，建立一个快速高效分析叶黄素的方法非常必要。越橘益视胶囊的简要生产工艺如下：越橘益视胶囊以叶黄素粉、越橘提取物、牛1磺酸，维生素C、天然维生素E（d-生育酚醋酸酯）、柠檬酸锌、维生素A粉、食用玉米淀粉、二氧化硅、硬脂酸镁为原料，经称量备料、混合、填充、内包装、外包装等主要工艺加工制成的具有缓解视疲劳的“越橘益视胶囊”。具体工艺如下：将维生素A粉、柠檬酸钠锌加约等重量的食用玉米淀粉混合2分钟后过60目筛，然后加入约等重量的食用玉米淀粉、配方量的天然维生素E混合均匀后和配方量的其他物料加入三维混合机中，若有结团的需先过40目筛，混合30min至混合物色泽均匀后出料，备用，制囊。由于叶黄素的对温度和光照环境非常敏感4，在低温避光的环境下性质较为稳定，不易降解，而在温度高、光照强、含氧量高的条件下易降解，故要求叶黄素在提取分离和分析的过程中要注意避免在高温、光照强的条件下进行，也有必要在分析的过程中加入相应的抗氧化物质来防止被测物的氧化破坏。通过查找相关的文献发现，叶黄素的提取溶剂主要有：无水乙醇、丙酮、正己烷、石油醚、二氯甲烷等，提取方法主要有：超声波提取法、微波提取法、干燥法、膜分离技术、超临界CO2萃取法、酶介质有机溶剂提取等5。由于叶黄素受热不稳定，且提取时间长易降解,以及越橘益视胶囊中叶黄素的主要来源是叶黄素原料，不需酶解，故不考虑超临界CO2萃取法、酶介质有机溶剂提取的方法。本次试验的主要考虑采取超声方法进行提取：主要用到的溶剂有水、无水乙醇、1%BHT丙酮。经过讨论、预实验和借鉴前人的经验，本次试验通过叶黄素超声提取方法提取，筛选提取溶剂，选出超声提取方法中的最优方法，最终确定最佳的叶黄素提取方法。常见的叶黄素的测定方法有，高效液相色谱法，薄层扫描法，紫外-可见分光光度法等。目前，叶黄素的主要分析方法为高效液相色谱法，特别是在定性定量中使用的非常广泛，该方法具有高效准确，灵敏度高的优点。由于公司对该产品的质量标准尚未完善，未收载越橘益视胶囊中叶黄素含量的测定方法。本文对越橘益视胶囊功效成分叶黄素进行了含量测定方法的研究，根据有效成分的理化性质、投料类型、制备工艺特点，制定该产品叶黄素的高效液相含量测定方法，并通过方法学考察的各项实验，验证了方法的可行性。有助于完善本产品的质量标准，能够更全面地保证越橘益视胶囊质量。22材料与仪器2.1使用的主要试药及溶剂使用的主要溶剂见表1、2表1样品名称批号及生产商样品名称批号生产商越橘益视胶囊201401汤臣倍健股份有限公司表2试剂、药品及生产商试剂规格生产商叶黄素标准品50mgUSP（批号G0L260）叶黄素原料汤臣倍健股份有限公司甲醇色谱纯(GR)Merck甲基叔丁基醚色谱纯(GR)Sigma-Aldrich二氯甲烷分析纯（AR）广州化学试剂厂丙酮分析纯(AR)广州化学试剂厂无水乙醇分析纯(AR)广州化学试剂厂2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）分析纯（AR）上海润捷化学试剂有限公司2.2使用的主要仪器使用的主要仪器见表3表3主要仪器设备型号及生产家主要仪器生产商WatersAlliancee2695型高效液相色谱配2998型DAD检测器沃特斯公司色谱柱（CapcellpakC18MG，4.6mm250mm，5m）资生堂（中国）投资有限公司超声波清洗机中国华南超声设备厂纯水器默克密理博实验室设备有限公司电子天平（十万分之一，41g（精细量程）梅特勒-托利多国际股份有限公司3/120g）3方法关于叶黄素的测定方法文献报道较多6-8，多为使用HPLC法，但未见测定越橘益视胶囊或相似产品中叶黄素含量的报道，本实验是用HPLC法对越橘益视胶囊中叶黄素进行含量测定，对于方法的探讨进行如下：3.1叶黄素的对照品溶液制备3.1.1对照品储备液称取叶黄素对照品约20mg于20mL棕色容量瓶，用二氯甲烷溶解并定容至刻度，摇匀，即得叶黄素对照品储备液，其浓度为1mg/ml。在-80冰箱避光保存3.1.2标准曲线溶液分别精密量取对照品储备液4.00mL、3.00mL、2.00mL、1.00mL于100ml棕色容量瓶并用二氯甲烷定容至刻度，摇匀，即得：S7、S6、S5、S4；然后精密量取S5溶液3.00mL、1.00mL于10mL棕色容量瓶并用二氯甲烷定容至刻度，摇匀，即得S3、S2；再取S5溶液1.00mL于25mL棕色容量瓶并用二氯甲烷定容至刻度，摇匀，即得S1。3.2测定波长的选择叶黄素的结构式见下图：图1叶黄素结构式叶黄素含有两个不同的紫罗酮环：-和-紫罗酮环，在各紫罗酮环的第三个碳原子上存在一个功能性羟基，为高度不饱和化合物9。其分子中有共轭双键结构，在可见光区有较强的吸收，未获得最佳实验效果，取对照品溶液在300nm-600nm进行扫描。4结果表明，叶黄素对照品在445nm附近有最大吸收峰（见图2），故实验选择测定波长为445nm。31.34.8472.1AU纳米350.40.0450.50.050.60.0纳米图2叶黄素紫外吸收光谱3.3供试品溶液的制备取同一批（201401）的越橘益视胶囊，按如下方法得到供试品溶液。供试品溶液的的制备：称取样品0.3g，置50ml棕色容量瓶中，精密加入5ml水溶解后，加入约40ml1%BHT丙酮，低温超声处理（160w，40MHz）3min，并用1%BHT丙酮定容至刻度，摇匀。取2ml至10ml容量瓶中，用1%BHT丙酮定容至刻度，摇匀，用0.45l滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，即得到供试品溶液。含量为1.2mg/ml。叶黄素原料溶液的制备：取叶黄素原料（由汤臣倍健股份有限公司提供）约50mg，精密称定，其余同上述供试品溶液的的制备方法。含量为0.2mg/ml。3.4.色谱条件色谱柱：资生堂MG液相色谱柱（4.6mm250mm;5m），流动相：甲醇:甲基叔丁基醚(85:15)，检测波长为445nm，进样量为10L，柱温为25，流速为0.2mL/min。3.5方法学考察3.5.1标准曲线的制备5分别将标准曲线溶液（S1S7）依次注入液相色谱仪，按3.4项下色谱条件，每个浓度进样测定1次测定，根据峰面积与标准品浓度的关系，以峰面积为纵坐标（Y）标准品浓度为横坐标（X）绘制标准曲线（图3）得到叶黄素标准曲线方程为：Y=546948.7574X+79110.9032，相关系数为R2=0.9999，结果表明，叶黄素浓度在（0.8488g/mL-42.4400g/mL）范围内呈良好线性关系，结果见表4、图3。方法检出限按3倍信噪比在标准曲线查出所对应的叶黄素浓度再根据计算公式中样品在实验过程中的量值关系计算出本方法的检出限为0.04974mg/kg表4不同浓度叶黄素对照品的峰面积序号取样量（mg)对照品含量（%）稀释倍数浓度（g/mL）峰面积SS1125000.8488418070S250002.12201068722S21666.66676.36603412124S4100010.61005769160S550021.220011363658S6333.333331.830017409503S721.2210025042.440023143001图3叶黄素线性范围图3.5.2精密度试验6取对照品溶液S4，按3.4项下色谱条件，连续进样量6次，每次进样量为10L，考察叶黄素测定结果的精密度，结果见表5。记录其峰面积并计算相对标准偏差（RSD），RSD=0.70%，结果表明进样器及色谱仪器精密度良好。表5叶黄素的精密度实验结果第n次峰面积平均峰面积标准偏差RSD%1602885925985127359427424590943755963480659358635960918419920.703.5.3稳定性的考察精密取同一批（120206）样品0.2998g，按3.3项下供试品溶液的制备方法及3.4项下色谱条件测定,考察在室温下0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h稳定性，连续时间内对照品峰面积相对标准偏差RSD是：0.90%。结果见表6，可见供试品溶液中叶黄素在12h内含量稳定。表6样品稳定性试验结果稳定性时间峰面积平均面积标准偏差RSD%0h86283851h84197512h86617104h86613746h85815968h864603410h855777412h85396188587030769830.903.5.4重现性试验7取同一批（201401）越橘益视胶囊样品6份，按3.3项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，按上述3.4色谱条件测定，每份测两次。测定峰面积结果如下表，计算得到叶黄素含量的RSD为2.07%。说明本方法重现性良好，结果见表7。表7越橘益视胶囊叶黄素重现性结果序号样品取样量（g）稀释体积(mL)实测峰面积实测浓度(g/mL）含量（%）平均含量（%）RSD（%）971924817.91461.352210.3312981343318.08681.3652903235816.65871.383220.3011880993916.25211.3494846492315.62131.344330.2905860811715.88311.3669972229717.92021.370540.3269984544918.14531.3877862838515.92011.327650.2998850859615.70111.3093806118614.88311.314360.2831250802554414.81791.30851.352.073.5.5叶黄素原料含量测定取叶黄素原料约50mg，精密称定，置50ml棕色容量瓶中，精密加入溶剂5ml水溶解后，加入约40ml1%BHT丙酮，低温超声处理（160w，40MHz）3min，并用1%BHT丙酮定容至刻度，摇匀。取2ml至10ml容量瓶中，用1%BHT丙酮定容至刻度，摇匀，用0.45l滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液，即得到叶黄素原料溶液。按3.4项下的色谱条件进样10L，平行制备6份，每份测2次，测定峰面积，计算平均含量为6.55%，RSD为0.72%。（结果见表8）表8叶黄素原料含量测定序号原料取样量（g）稀释体积（mL）实测峰面积实测浓度（g/mL）含量（%）平均含量（%）RSD（%）720187813.31206.533210.05094719814613.30526.5398746655313.79596.564520.05254738691313.64036.495230.04914699114212.92676.57658704361213.02276.6253732124513.53036.520040.05188728665713.46706.4895723288313.36876.557150.05097721366713.33366.5399756062113.96796.645160.05255250741933313.70966.52226.550.723.5.6加样回收率试验取已知含量的样品（批号：201401，叶黄素含量为1.875mg/g）18份，每份0.3g，精密称定，平均分为三组，分别加入叶黄素原料25mg、50mg、75mg，精密称定，其余同3.3。按3.4色谱条件进样10L，每个浓度制备6份，每份测2次，测定峰面积，计算平均回收率为96.42%，RSD为3.46%，结果见表9、表10、表11。结果表明，本法具有良好的回收率，方法准确、可靠。表9加样回收率的实验结果表（低浓度回收）序号供试品取样量（g）供试品含量（mg）叶黄素原料加入量（g）叶黄素原料含量（mg）实测叶黄素总量（mg）回收率（%）0.29463.970.025951.705.6095.85R10.29463.970.025951.705.5592.630.29363.960.025461.675.5796.66R20.29363.960.025461.675.4991.560.29944.040.028801.895.8797.36R30.29944.040.028801.895.8696.460.28903.900.023981.575.3793.61R40.28903.900.023981.575.3693.310.31364.230.027881.835.9292.40R50.31364.230.027881.835.9694.940.30224.070.026141.715.6893.94R60.30224.070.026141.715.6290.36表10加样回收率的实验结果表（中浓度回收）序号供试品取样量（g）供试品含量（mg）叶黄素原料加入量（g）叶黄素原料含量（mg）实测叶黄素总量（mg）回收率（%）90.31884.300.051563.387.5997.41R70.31884.300.051563.387.5195.100.31974.310.055813.667.7393.56R80.31974.310.055813.667.7293.190.29333.950.052873.467.2595.22R90.29333.950.052873.467.1993.550.30054.050.053633.517.58100.50R100.30054.050.053633.517.63102.000.29884.030.052913.477.3094.29R110.29884.030.052913.477.4297.940.30944.170.051073.357.2692.23R120.30944.170.051073.357.3394.42表11加样回收率的实验结果表（高浓度回收）序号供试品取样量（g）供试品含量（mg）叶黄素原料加入量（g）叶黄素原料含量（mg）实测叶黄素总量（mg）回收率（%）0.31174.200.077025.048.9293.60R130.31174.200.077025.049.0195.370.31594.260.077095.058.9793.30R140.31594.260.077095.058.8691.090.32694.410.077995.119.55100.58R150.32694.410.077995.119.70103.510.29143.930.075734.968.6895.85R160.29143.930.075734.968.6394.850.30154.060.075084.928.5891.91R170.30154.060.075084.928.7394.870.30364.090.081965.379.4299.17R180.30364.090.081965.379.63103.073.5.7阴性溶液制备按越橘益视胶囊处方比例及工艺条件制备缺叶黄素原料的阴性样品。取阴性样品0.3g，按3.3项下的供试品溶液制备项下的方法制成供试品溶液。取对照品适量，按对照品溶液制备项下的方法制成对照品溶液。分别取叶黄素对照品溶液，阴性对照品溶液、供试品溶液各10L，注入色谱仪，记录色谱图，结果表明，可见在与叶黄素相同位置，供试品有色谱峰出现阴性样品无色谱峰出现，表明阴性样品无干扰。见图4、图5。10AU0.150.2min.02.04.06.08.010.12.014.016.018.020.2.01图4叶黄素对照品HPLC图AU-0.40.6min0.2.04.06.08.010.12.014.016.018.020.2.0图5阴性样品HPLC图备注：1叶黄素3.5.8越橘益视胶囊中叶黄素含量测定分别称取样品（越橘益视胶囊）0.3g，精密称定，按3.3供试品溶液的的制备方法制备，按3.4的色谱条件进行测定，分别进样供试品溶液各10L，两次，测定峰面积，计算越橘益视胶囊中叶黄素含量，平均含量为1.35%，结果如下（见表12）：表12越橘益视胶囊中叶黄素的含量测定序号样品取样量（g）稀释体积（mL）实测峰面积实测浓度（g/mL）含量（%）平均含量（%）RSD（%）971924817.91461.352210.3312981343318.08681.3652903235816.65871.383220.3011880993916.25211.3494846492315.62131.344330.2905860811715.88311.3669972229717.92021.370540.3269984544918.14531.3877862838515.92011.327650.2998850859615.70111.309360.2831250806118614.88311.31431.352.0711802554414.81791.30854讨论4.1提取溶剂的选择曾尝试以三氯甲烷、二氯甲烷、水、丙酮、乙醇、50%DMSO、DMSO、正己烷、石油醚等直接溶解叶黄素原料，结果均不能使叶黄素原料溶解。后经分析，企业所投叶黄素可能为包埋的微胶囊化叶黄素，经查询相关文献10-11，先加少量水使微胶囊外壳的有机膜溶解，令叶黄素析出，再用有机溶剂进行提取。通过探究和向企业核实，该样品投料类型为原料型投料，原料含量测得平均含量为6.55%，为含量较高的有微囊包埋的颗粒。目前对叶黄素常见的提取溶剂有石油醚、氯仿、丙酮，无水乙醇等，由于丙酮提取效率高，不会对色素的性质和质量产生不良影响，又可以回收12，乙醇毒性低，价格低廉，故本次实验主要尝试使用丙酮和无水乙醇为提取溶剂分别低温超声提取同一批（201401）越橘益视胶囊，并测得含量。考虑到叶黄素在提取的过程中容易被氧化13，选用在提取液中加入1%BHT。因为BHT作为一种脂溶性抗氧化剂，可以在提取时对越橘益视胶囊中的叶黄素起到保护作用14，避免叶黄素在提取过程中发生氧化，从而提高了叶黄素的回收率。取同一批（201401）越橘益视胶囊内容物，按3.3项下方法制备，采用1%BHT无水乙醇和1%BHT丙酮超声3min进行提取，测得结果含量分别为1.20%和1.35%，结合样品越橘益视胶囊中叶黄素的投料类型分析得，提取溶剂选用1%BHT丙酮能较好地提取越橘益视胶囊中的叶黄素。（结果见表13）表13无水乙醇和1%BHT丙酮分别提取样品中叶黄素的结果序号样品取样量（g）稀释体积（mL）实测峰面积实测浓度（g/mL）含量（%）平均含量（%）819610714.84051.19221%BHT无水乙醇-10.3112817636314.80441.1893805759514.58731.21521%BHT无水乙醇-20.3001804577714.56571.2134766953813.87781.19431%BHT无水乙醇-30.2905774961814.02421.20691%BHT丙酮-10.3126250945202517.13671.37051.2012951494417.25181.3797886012916.05461.32991%BHT丙酮-20.2998892219516.16801.3393840459815.22171.33431%BHT丙酮-30.2831836840815.15551.32851.354.2色谱条件的选择4.2.1流动相的选择在高效液相色谱法测定叶黄素的流动相系统中，常见的流动相有甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲基叔丁基醚、环己烷-乙酸乙酯、甲醇-乙腈-醋酸乙酯-水等。由于叶黄素稳定性受物理、化学及生物因素影响较大，例如光辐射、酸、高温、碱、游离卤素、水分状况等，但氧是影响叶黄素稳定性的主要因素，特别是纯结晶的产品更容易被氧化破坏15，故选用甲醇-甲基叔丁基醚为流动相，主要是甲基叔丁基醚不仅对叶黄素有较大的溶解度，而且有一个非常重要的性能，即很强的抗自动氧化性，能有效地防止叶黄素在检测过程中被氧化破坏。该体系流动相一般能较好的分离测定叶黄素而且比较准确、稳定，线性关系良好，重现性好，保留时间适中，洗脱率高，不出现因样品被氧化降解而产生的前沿峰或者拖尾峰。4.2.2流动相比例的选择以甲醇-甲基叔丁基醚为流动相的体系，多数采用梯度洗脱，容易引起少部分极性比较接近叶黄素的杂质混入叶黄素的色谱峰中从而干扰测定的结果。除此之外，每次梯度洗脱时间较长，平衡色谱柱也消耗较长时间。本次试验采用等度洗脱的分离方式进行检测，HPLC分析时对的流动相系统比例作了探索研究，由所得的色谱图表明，以甲醇-甲基叔丁基醚（85:15，v/v）为流动相时，保留时间适中，样品中叶黄素峰与其他色谱峰分离效果好，峰形佳，可以消除提取液中其他组分的干扰，使叶黄素与越橘益视胶囊中其他组分得到了很好的分离（图6、图7、图8、图9）。13AU0.150.2min.02.04.06.08.010.12.014.016.018.020.2.01图6叶黄素对照品HPLC图AU0.150.2min.02.04.06.08.010.12.014.016.018.020.2.01图7叶黄素原料HPLC图AU0.150.2min.02.04.06.08.010.12.014.016.018.020.2.01图8越橘益视胶囊HPLC图AU-0.40.6min0.2.04.06.08.010.12.014.016.018.020.2.0图9阴性样品HPLC图备注：1叶黄素4.2.3方法学验证结果本实验以现行的叶黄素测定国家标准为基础，结合保健食品的性质，研究提取方法和测定条件，该提取测定方法稳定性强（在12小时内稳定），重现性好（RSD为2.07%），回收率高，平均回收率达到96.42%。该法操作简便、快速，经方法学考察，14提取时不易发生乳化、结块，并且检出限低，可准确地测定越橘益视胶囊中叶黄素的含量，是一种在检测实践中可以广泛应用的方法。5结论由于公司原药品标准中没有制定叶黄素含量测定方法，我们通过研究该样品的制备特点，投料类型，选择了高效液相色谱法测定叶黄素含量，具有快速简便、重现性好等特点，可以有效地控制该产品的质量，从而保证了产品质量的均一性和临床用药的安全性及有效性。同时也提高了越橘益视胶囊原有质量标准。试验中考察了提取溶剂对含量的影响，结果表明提取溶剂1%BHT丙酮对有效成分提取效果较无水乙醇好。本实验曾采用流动相甲醇-甲基叔丁基醚（85:15，v/v）等度洗脱和甲醇-甲基叔丁基醚梯度洗脱，色谱峰分离效果均较理想，结果显示，等度洗脱分离效果好，且保留时间较短，而被采用。本次试验，有一定的实用性，为下一步制定相应的质量标准提供一定的参考价值。15参考文献1KijlstraA,TianY,KellyER,etal.Lutien:MorethanjustafilterforbluelightJ.ProgressinRetinalandEyeRearch,2012,31(4):03-315.2RenziLM,JohnsonEJ.Luteinandage-relatedoculardisordersintheolderadult:AreviewJ.JournalofNutritionfortheElderly,207,26(3-4):139-157.3KalariyaNM,RamanaKV,VankuijkFJGM.Focusonmolecules:LuteinJ.ExperimentalEyeResearch,2011,102:107-108.4杨杰,高洁,方从容,等.叶黄素标准溶液稳定性考察J.中国食品剂,2013,6:184-189.5郭薇,马福秋,崔瑞敏,等.叶黄素提取方法研究概况J.化学与粘合,2005,27(6):377-380.6王丽娜,黄峻榕,张立,等.超高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中的叶黄素J.色谱,31(12):1228-1231.7彭科怀,杨长晓,陈曦.HPLC法测定保健食品中叶黄素的含量J.职业卫生与病伤,2013,28(5):287-289.8张志强,唐道城,张乃湛,等.薄层扫描法测定万寿菊中叶黄素的含量J.化学世界,2009,9:536-539.9朱海霞,郑建仙.叶黄素(Lutein)的结构、分布、物化性质及生理功能J.中国食品添加剂,2005,No.5:48-55.10白鸿.保健食品功效成分检测方法M.北京：中国中医药出版社.2012:258-270.11GB/T23209-2008奶粉中叶黄素的测定:液相色谱-紫外检测法S.12李永祥,刘惠君,赵林秀.从蚕沙中提取粗品叶黄素的工艺研究J.江西化工,2004,24(2):19-20.13MitriK,ShegokarR,GohlaS,etal.IntJPharm,2011,420(1:):141.1614黄百芬,郑凯,谭莹,等.高效液相色谱法同时测定婴幼儿食品和乳品中的叶黄素、-胡萝卜素和-胡萝卜素J.中国卫生检验杂志，2012,22(9):2043-2045.15王永华,梁世中.类胡萝卜素的结构和生理功能研究J.广州食品工业科技,2000,(4):1-4.综述叶黄素提取方法的研究进展叶黄素（lutein）又名植物黄体素，是胡萝卜素的非酸性氧衍生物，含紫罗酮环和多个不饱和双键。叶黄素为3,3-二羟基-胡萝卜素1，分子式C40H56O2，相对分子质量为568.85，熔点为190，不溶于水，易溶于某些有机溶剂，如氯仿、二氯甲烷、正己烷等。叶黄素在偏酸溶液、弱光和低温下比较稳定，在偏碱性条件下较不稳定，在弱酸性、弱碱性条件下,发生颜色可逆变化，在强碱、强光或高温条件下被破坏，其结构如下:纯的叶黄素为棱格状黄色晶体，有金属光泽，熔点为183190，对光和氧不稳定，需贮存于阴凉干燥处，避光密封保存2。叶黄素在甘蓝、羽衣甘蓝、菠菜等深绿色叶菜及金盏花、万寿菊等花卉中含量最高，其次，南瓜、桃子、辣椒、芒果、柑橘中含有丰富的“叶黄素酯”。叶黄素是构成人眼视网膜黄斑区域的主要色素，对维持眼部健康有一定作用。此外，大量研究发现叶黄素对心血管疾病、癌症、糖尿病等多种慢性疾病有一定预防和改善作用。鉴于叶黄素无毒安全，具有较强抗氧化、改善视力等生理功能，已被作为食品补充剂允许在食品、饮料、化妆品、保健食品，甚至婴幼儿食品中添加。171叶黄素的提取方法综述1.1超临界CO2流体萃取法超临界CO2流体萃取技术是食品工业新兴的一项萃取和分离技术，与传统的有机试剂法相比，采用超临界CO2流体萃取技术生产的产品无溶剂残留、无污染，可避免萃取物在高温下的热劣化。保护生理活性物质的活性，保持萃取物的天然风味等。目前超临界CO2流体萃取技术已经成功地应用到辣椒红素、番茄红素、-胡萝卜素和栀子黄色素等天然食用色素的萃取和精制中3-6。徐如平等通过改变萃取温度、时间、压力、CO2流量等条件万寿菊干花粉叶黄素提取率的影响进行了研究。结果表明：萃取时间为3h，温度55，萃取压力25MPa，CO2流量10L/h，分离罐I温度42，压力11MPa，分离罐温度38，压力同储罐，为万寿菊叶黄素的最佳提取条件。1.2有机溶剂萃取法叶黄素的萃取效果主要受原料颗粒的大小、萃取温度、萃取时间、萃取剂的种类和萃取剂流量大小等因素的影响。目前常用的提取剂有正己烷、石油醚、丙酮、乙醇、四氢呋喃、氯仿、6#溶剂油等，以6#溶剂油、氯仿和四氢呋哺的提取效果较好7。夏树林等8研究了从万寿菊花提取叶黄素的工艺条件，结果显示，将万寿菊花、四氢呋喃、乙醇、水和K0H在室温下混合，同时进行萃取和皂化处理的工艺流程最佳。采用该工艺所得的叶黄素的纯度可达97.6%以上。崔振海等9通过改变溶剂种类、提取时间等条件对万寿菊干花粉叶黄素提取率的影响进行了研究。结果表明：浸提溶剂采用氯仿-乙醇以3:2的体积比混合，浸提次数2次，物料比1:10浸提时间，每次的浸提时间为2h，皂化时NaOH的浓度5%，皂化时间8h，为万寿菊叶黄素的最佳提取条件。1.3循环超声提取法超声波提取是目前国内外正在研究开发的一种辅助溶剂提取技术，它的优点是提取速度快、效率高、溶剂用量少等。采用超声波法从植物中提取天然活性物质，在提取过程中将细胞破碎使被提取物能够快速、高效地进入提取介质，缩短捉取时间，增加提取效率。而没有超声辅助的普通静态溶剂提取法的主要问题是提取时间长，溶剂用量大，在研究中为了了解万寿菊中自然存存及加工中每种类胡萝卜素对应的真实含18量，必须要有较高的提取率来保证后续研究的准确性，所以静态溶剂提取法经常要多次离心多次和更新溶剂以获得较高的提取效率，而循环超声捉取法的优点是不仅节约溶剂用量而且大大降低了捉取时问，提高了提取效率，同时降低了后续浓缩而造成类胡萝卜素降解的可能性。王静钰等10采用循环超声技术，用石油醚和丙酮混合溶剂从万寿菊造粒中提取叶黄素，探讨获得循环超声提取的理想工艺参数，在结果显示，提取溶剂为丙酮:石油醚=1:1(V/V)，在超声波功率800W、超声波作用时间为20min，料液比1:70时，可以得到较好的提取效果。2叶黄素常见的分析方法综述2.1高效液相色谱法目前，叶黄素的主要分析方法是高效液相色谱法(HPLC)，特别是在定性、定量分析不同极性类胡萝卜素时此法成为首选方法。HPLC可以实现对待测物中叶黄素的定性定量分析，用叶黄素标准品建立峰面积和浓度之间的标准曲线，根据样品的出峰时间和峰面积，确定叶黄素的组成和含量。目前，国内外在HPLC分离多种类胡萝卜素方面已经进行了一定的研究，主要在于该方法具有高效，准确，灵敏度高的优点。2.2薄层扫描法薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。与HPLC相比，TLC适应性更强且操作简单。TLC有更多可选择的溶剂用于流动相，而且可以同时分离几个样品。分析含有叶黄素的复杂样品时，将TLC和HPLC结合起来，能够得到更好的效果。Hodisan11等人在分析蔷薇过时的类胡萝卜素的组成的时候，发现了用薄层扫面法和高效液相法可得到基本型相同的定性分析结果，以此表明TLC是一种有效快速的定性类胡萝卜素的方法，2.3紫外-可见分光光度法紫外-可见分光光度法具有灵敏度高，操作简单，仪器价格低廉等优点，成为一种定量分析的检测方法。叶黄素分子结构中具有共轭双键体系，在可见光区表现出较强的吸收带。叶黄素符合Lambert-Beer定律，即溶液的吸光度值与浓度成正比，因而19可以实现精准的定量分析。除此之外，叶黄素的最大吸收峰与溶剂的折射率有关，