【毕业学位论文】热胁迫下番茄多胺代谢与基因差异表达分析博士学位论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 热胁迫下番茄多胺代谢与基因差异 表达分析 士 研 究 生：刘志勇 指导教师：杜永臣 研究员 申请学位类别：农学博士 专 业：蔬菜学 研 究 方 向：蔬菜遗传育种 培 养 单 位：中国农业科学院研究生院 蔬菜花卉研究所 提交日期 2007 年 06 月 007 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 要 番茄属于喜温性蔬菜作物，最适温度范围为 20适应温度范围为 15但在生产中周围的环境温度往往会超过这一温度范围，达到 35以上，甚至超过 40。高温胁迫成为番茄生产中产量和品质提高的主要限制因素之一。研究番茄耐热性形成的生理和分子生物学基础对于番茄耐热育种以及建立提高番茄耐热能力的栽培技术都具有重要的意义。日益增多的研究表明，多胺与植物的抗逆性密切相关。本研究重点探讨番茄耐热性与多胺代谢之间的关系和进行耐热性相关基因的克隆，以期为建立高效、可靠的番茄耐热性鉴定、评价方法以及进行番茄耐热分子生物学方面的研究提供依据，主要研究成果如下： 1利用染色体步行法，从已知 研究对连接介导 行了改良，包括以下步骤： 1）多酶切位点接头的设计； 2）接头和基因组 3）利用基因特异性引物和锚定引物进行巢式 取步移片断。使用该技术成功获得了番茄 （ 录起始位点上游 879 2以蔓陀罗 录号： 信息探针 , 筛选 依据若干同源 人工拼接、 得了一个新的番茄名为 录号： ，并利用染色体步移技术克隆了 798475非翻译区和3非翻译区分别长 523241 在 3个 其 中 60个氨基酸的 648有 3个内含子，均位于 5非翻译区，所有内含子的剪切位点均符合真核生物 48% ，与番茄已克隆 6%和 77%， 与人、 大肠杆菌以及酵母的同源性较低 （ 30%、 25%和 10%） 。 交表明， 达谱分析发现， 、叶、花蕾、果实等器官中均表达，果实中的表达量稍高。生物信息学分析表明， 3研究了高温胁迫对耐热品系 热敏品系中蔬 6 号多胺代谢和光合作用的影响。耐热性不同番茄品系，经过 24 小时高温处理后（ 40/30） ，净光合速率都受到了影响，但下降的程度相差很大。耐热品系 光合效率下降 32%，而热敏品系中蔬 6 号则下降了 63%。高温处理后， 中蔬 6 号多胺含量均上升，前者的上升幅度大于后者，亚精胺含量增加的差异是主要原因。热胁迫下， 因和 因的转录均受到不同程度的抑制。亚精胺预处理可以有效减轻高温胁迫对光合作用的抑制作用，且对于热敏性番茄更为有效。 4应用 法，以番茄幼苗为研究对象，对高温胁迫下番茄叶片的基因表达进行了 纹分析。通过 768 对引物组合的筛选，共分离了 187 个差异表达的 对其中47 个 行了克隆、 测序和序列分析。 结果表明： 35 个 已知序列同源 （ 甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为国产分析纯。 20购自 外可见光 ) 50荧光定量 J 析软件为 法 胺含量的测定 多胺含量的测定按 1993)方法进行，略作修改。取番茄材料 入 4氯酸（ V/V）冰浴研磨，冰浴浸提 120000g， 304）；吸取上清液到一新的离心管中，冰浴。利用 2心（ 20000g， 304），合并上清液。取上清液 0.5 入 1的 加 101苯甲酰氯，涡旋后 37水浴反应 30别加231500后吸 直超静台内吹干后，加 100160%(v/v)甲醇溶解，过 0高效液相色谱仪进行多胺含量的测定。流动相 : 甲醇 :水 (60:40， V/V)，检测波长为 254速 温 30。多胺的含量用纳摩尔 /克鲜重 (示。 混合标样制备： 分别取腐胺、精胺、亚精胺各 1为 1000加 2 151 苯甲酞氯，涡旋 温下孵育 30 2和 2醚萃取；离心 5 分钟 (10000g )，吸取 1醚相， 在垂直超静台内吹干， 溶于 500l 甲醇。 上述各种标样各取 100合， 再加 200照刘俊（ 2005）的方法建立标准曲线。 胺合成代谢相关酶活性（ 析 蛋白提取 参照赵福庚（ 1997）略加修改。取 1入 550磷酸盐缓冲液， 5 50磷酸毗哆醛， 20%(w/v)不溶性 0蛋白抑制剂 5 20 于冰浴中充分研磨。过滤后，取20和度( 淀溶于 10磷酸盐缓冲液 (对此缓冲液透析( 4过夜)后， 加入两倍体积 酮， 于 0振荡 5以 50000)， 沉淀溶于 10磷酸缓冲液中，透析过夜，以 2000004），上清液用于酶活测定。 用赵福庚（ 2000）所建立的苯甲酰化紫外检测法，略加改动：反应系统体积 括 1国农业科学院博士学位论文 第三章 热胁迫下耐热性不同番茄多胺代谢分析 53100内含 5 50 磷酸毗哆醛， 5 37水浴中放置 2 ，加入 5 rg(5 37反应 60入高氯酸（ 终浓度 5%(对照在开始即加入 以 30000 0.5 合后加入 10悬振荡 20s， 37下反应 30次加入 2荡， 1500集 垂直超净工作台吹干，再溶于 30%甲醇中，岛津紫外分光光度计于波长 254活以 示。 用 1982)检压法测定，酶活以 胺合成代谢相关基因转录水平分析 物设计和合成 利用引物设计软件 设计番茄多胺合成相关基因和内标 18 引物由北京三博远志公司合成。 表 荧光定量 物名称 录号 引物序列（ 5 段长度 1851576 805 6 29 59 04 32 50 74 47 中国农业科学院博士学位论文 第三章 热胁迫下耐热性不同番茄多胺代谢分析 随机引物引发反转录，利用 转录酶合成 （ 1）向灭过菌的 0.2 g/l) 3l 10) 1l 950m/L) 1l 2O 8l 3l （ 2）混合样品，短暂离心， 70保温 5 （ 3）迅速置于冰上，冷却 5暂离心收集样品于管底；加入下列试剂于反应管中（冰上操作）： （ 4）短暂离心， 50水浴 60 （ 5） 70水浴 15存于 用。 光定量0l l l 0l 以 荧光指示剂，每一份 平均值，以 18算目的基因的相对表达量。通过溶解曲线来检测反映产物的纯度，分析模式定为： 95 5后 65 95，每 定荧光强度 10S。 5l l l 转录酶 1l 0l 中国农业科学院博士学位论文 第三章 热胁迫下耐热性不同番茄多胺代谢分析 55 94 24 30s 55 1 30s Go 0 ; 0:00:01 合速率测定 采用 美国， 测定第三片真叶的净光合速率 (检测条件：光量子通量密度( 600度 25， 90L/L。 果与分析 胁迫对番茄叶片多胺含量的影响 苯甲酰化多胺在一般的反相柱上均能获得较好的分离。在本试验设定的色谱条件下， 附录。 在前期实验中，发现番茄体内多胺含量及相关合成酶类酶活性（ 有表现出明显的昼夜差异（数据未列出） 。在高温处理过程中，三种多胺的含量变化趋势明显不同。如图 胺的含量最少，在 中，其含量变化不明显。同样，腐胺也没有表现出明显的变化趋势。在 0 12后维持在较高的含量水平；而在中 6中， 增加的含量和幅度均小于 胁迫对多胺合成代谢相关酶类（ 性的影响 高温处理后， 在处理时间内， ，而且在高温处理 12直保持在较高水平。而 化规律难以判断。高温处理后，中 6的 a，如图 胁迫对多胺代谢相关基因转录的影响 根据 计了基因特异性引物，以 18S 态跟踪各基因的相对表达。结果显示， 9个基因的扩增曲线重复性强， 靶温度低于产物的解链温度，反应过程中的荧光值可有效反映扩增产物的实时变中国农业科学院博士学位论文 第三章 热胁迫下耐热性不同番茄多胺代谢分析 56化。 扩增曲线及溶解曲线见附录。 图 热胁迫对番茄叶片 量的影响 of on pm in : B:C:中国农业科学院博士学位论文 第三章 热胁迫下耐热性不同番茄多胺代谢分析 573个 中的表达模式相似，如图 高温处理后表达都受到了抑制，开始 30暗处理后 增加量相似，而 据 温下 多胺代谢的差异主要出现在亚精胺的含量上，所以只对 达量只有 0中 6中， 85表达量分别达到 0在中 6中， 在 1521图 胺预处理可有效缓解减轻热胁迫对番茄光合作用的抑制 25时， 的净光合效率存在差异， 低于中 6（ 经过 24小时的高温处理后，耐热品系和热敏品系的净光合效率均都有下降，但减弱的幅度各不相同。中 6下降了 63%，而 2%。多胺预处理可以有效缓解高温胁迫对图 胁迫对多胺代谢相关酶活的得影响 of on DC DC in A:B:C:中国农业科学院博士学位论文 第三章 热胁迫下耐热性不同番茄多胺代谢分析 58番茄幼苗叶片净光合速率抑制作用，但不同种类多胺的缓解效应不同。亚精胺的效果最好，其次是精胺，腐胺的效果最差。见图 图 热胁迫下， 表达分析 PS 中国农业科学院博士学位论文 第三章 热胁迫下耐热性不同番茄多胺代谢分析 论： 光合作用是植物物质转换和能量代谢的关键，同时也是植物体内对外界逆境最为敏感的生理生化途径之一。植物遭受高温胁迫时，最明显的表现就是光合效率的下降（ 1980） 。但光合效率受抑制的程度因品系耐热性而异，耐热品系光合效率下降的幅度明显小于不耐热品系（沈征言， 1993；毛胜利， 2002） 。高温造成作物光合效率下降的原因是多方面的。一般认为，光合电子传递受阻是光合效率下降的主要原因。各类生物膜对高温的敏感性有所不同，类囊体膜比线粒体膜和原生质膜更容易受到高温的伤害 (980)，而光合作用中的光反应系统就存在于类囊体膜上。高温胁迫破坏番茄叶肉细胞叶绿体被膜及类囊体系统的完整性，并且耐热性不同的品种的表现差异很大， （王冬梅等， 2003） 。类囊体膜系统的损伤使依赖于类囊体膜的光合电子传递链遭到破坏，量子效率降低。光系统是光合电子传递链中最敏感的部位（ et 1996） 。在 38时番茄叶片光系统的光化学反应就会受抑制， 42时这种抑制成为不可逆（ 992） 。由于 耐热性高于 故高温下作物叶片内的假环式电子传递被激活，造成了量的下降，从而限制了 可能也与高温下作物光合作用的下降有关。 本研究发现，耐热性不同的番茄品系，经过 24 小时高温处理后（ 40/30） ，光合作用都受到了影响，但下降的程度相差很大。耐热品系 合效率下降 32%，而热敏品系中蔬 6 号则下降了 63%。高温处理前，喷施亚精胺可以有效减轻高温胁迫对光合作用的抑制作用，而且对于热敏性番茄更为有效。同时，在以前的研究中，我们发现相对于热敏品系 , 耐热番茄品种总能保持较高水平的游离态精胺和亚精胺。在本研究中，我们采用了更高的处理温度，这种差异依然存在，尤其表现在亚精胺含量上。高温处理下， 中蔬 6 号的亚精胺含量都增加，但前者增加的幅度和绝对量大于后者。不论耐热品系还是热敏品系，高温下多胺代谢相关合成基因的表达很复杂，大部分基因的表达受到抑制，而且 因下降的趋势还很明显。但相对于对照（ 25/20） ， 活性增加，亚精胺含量也同时增加。造成亚精胺含量和 因转图 源多胺对番茄光合速率高温抑制的缓解作用 As on of in 中国农业科学院博士学位论文 第三章 热胁迫下耐热性不同番茄多胺代谢分析 60录情况的不符的原因可能有： 1、番茄 能存在较强的翻译调控能力和翻译后修饰能力，尤其是在耐热性番茄品系中； 2、有可能存在其它 因家族成员； 3、有可能存在高温下被激活的非常规多胺代谢途径。 中国农业科学院博士学位论文 第四章 热胁迫下番茄叶片基因差异表达研究 61第四章 热胁迫下番茄叶片基因差异表达研究 摘要: 应用 番茄幼苗为研究对象，对热胁迫下番茄叶片的基因表达进行了过 768对引物组合的筛选，共分离了 187个差异表达的转录衍生片段 (并对其中 47个 序和序列分析。结果表明： 35个 过级联反应地将信号不断放大并传递下去（刘强等， 2000）。在植物热激反应中，热激因子直接调控热激蛋白的形成，而番茄中一种热诱导的促分裂原活化蛋白激酶( 以选择性的磷酸化 et 002）。本研究得到 度同源，高温处理后该基因诱导表达。可以推测， 中国农业科学院博士学位论文 第四章 热胁迫下番茄叶片基因差异表达研究 8114主要以同源 /异源二聚体形式存在，通过磷酸化丝氨酸 /苏氨酸介导和靶蛋白结合，从而发挥其调控功能。已有 100多种蛋白质被证明可以与 14白相互作用，包括各种蛋白激酶、受体、支架蛋白、细胞周期调控蛋白、转录因子和凋亡调控蛋白、线粒体 /叶绿体前体蛋白等（ C., 2002）。因此， 14胞分裂、信号转导、蛋白跨膜转运等重要生命活动的调节进程（伍家发， 2005）。在人体中， 14种互作的中断会引起一系列疾病的发生（ et 2005）。 1999）在研究壳梭孢素（ 番茄抗病反应得影响时时发现，外施壳梭孢素可以诱导 144 4 小 在于所有的真核生物中，形成一个超过 100个成员组成的蛋白超家族。这一蛋白超家族按照结构分为 们广泛地参与调控诸多细胞功能( et 2003)。小 是关于小 志爱等（ 2007）研究发现，小麦小 用动物细胞所进行的研究已经证明， 别是在跨膜细胞信号转导过程中有着重要的作用（伍维华等， 1996），但小 亮氨酸氨基肽酶（ 泛参与植物的抗逆反应。 已知番茄 因序列完全相同。该基因可以受多种信号（干旱、损伤、 盐）的诱导表达，并已证实 水杨酸和 诱导。在本文中， 于为高温诱导类型，也间接说明了番茄耐热反应中可能存在依赖于 水杨酸的信号传导途径。 转录因子类： 锌指蛋白是真核生物基因组中最丰富的一类转录因子，这种蛋白质与 合形成稳定的手指结构，在基因的表达调控、细胞分化等生命过程中发挥重要作用（ et 2001）。 2003） 对一个胁迫应答的锌指基因 2） 的研究表明， 在拟南芥和矮牵牛中， 旱以及低温胁迫反应，具有非常相似的表达机制。利用转基因技术，将一些与逆境胁迫相关的锌指蛋白基因在目标植物中过量表达后，能对植物起到增强抗逆性的作用，说明锌指蛋白在增强植物逆境抗性方面有着重要的作用。过量表达锌指蛋白 强光能力明显增强，表现为形态上的剧烈变化如栅栏薄壁组织增加、花青素和叶绿素含量的增加（ et 2000） 。 2001)把大豆锌指蛋白基因 基因植株的抗寒能力显著增强。 ( 2004)将水稻锌指蛋白基因 草表现出对高盐、干旱和低温的抗性增强。但现阶段，还没有关于锌指蛋白与植物耐热之间的详细研究结果。本研究得到的 表达受热诱导，表明该转录因子有可能与番茄的耐热有关。 中国农业科学院博士学位论文 第四章 热胁迫下番茄叶片基因差异表达研究 82保护性蛋白类： 细胞色素 具有混合功能的血红素氧化还原酶类，是一个基因超家族。其蛋白质结构、催化底物及反应类型具有多态性，它参与多种生化反应，在防御生物免受病虫害及逆境胁迫等方面具有重要作用（赵剑等 , 1999; Qi et 2006）。已有多项研究表明，一些 et 2005）。在本研究中可能编码 温处理后诱导表达，但由于该 以确定该基因编码哪一类细胞色素此，需要获取其全长序列，进一步研究其在植物热激反应中的作用。 热激蛋白与植物的耐热性密切相关。植物热激反应的重要表现之一是产生热激蛋白（ 根据分子量的大小， 60、 70、 90和 100 1992年， 理论。后来发现，大部分的热激蛋白都行使分子伴侣的功能，参与生物体内新生肽的运输、折叠、组装、定位以及变性蛋白的复性和降解( 2004)。在本研究得到的 47个 且说明这 3个热激蛋白基因都是受热诱导的。同源分析表明， 据结构和功能的不同，大多数 此本研究所获得的 而保证细胞正常的生理功能（王金海， 2005； et 2006）。拟南芥中的 且在植株衰老时含量也有所增加（ et 1997）。在 47个 个与热激蛋白 明我们利用 在 47个 12个未找到同源序列，这些 番茄耐热反应中扮演重要的角色，因此，需要对它们做表达模式的验证，对感兴趣的 一步研究基因的功能。 中国农业科学院博士学位论文 第五章 番茄 因的克隆与序列分析 83第五章 番茄 因的克隆与序列分析 摘要： 在热胁迫下番茄叶片基因差异表达研究的基础上，利用 端 别暂命名为 对其基因结构、分子进化和亚细胞定位进行了初步的分析。结果显示， 415放阅读框编码 692个氨基酸，预测其亚细胞定位于叶绿体； 码 436个氨基酸。 在系统发育中， 其相对分子量的大小可分为： 小分子热激蛋白 (在植物体内，多肽合成后将获得一系列的信息来指导其正确的折叠以发挥其必要的功能。分子伴侣 (一类在原核生物及真核生物中广泛存在、可协助其他蛋白质维持构象、参与蛋白质的变构、转运及降解，对 录进行调节的蛋白质 (et 1995)。近十几年的研究证明，大分子 与生物体内新生肽的运输、折叠、组装、定位以及变性蛋白的复性和降解 (004)。在第四章中，我们利用获得了 47个差异表达基因。 其中，文在前文研究的基础上，采用 期获得全长 进一步研究番茄的耐热机制提供信息。 料与方法 验材料与处理 试验材料为耐热性番茄品系 国番茄遗传中心，编号 ，种植管理和高温处理同 用试剂和药品同 取及 一链的合成 总 取采用 步法抽提试剂盒，依试剂盒说明书进行，分别提取高温胁迫后 62h 的番茄叶片总 量混合后分光光度计测定其 ， 琼脂糖电泳检测所提取总 质量。 一链的合成参照 3剂盒说明书。 5一链的合成参照 司 5剂盒说明书（ ，引发反转录的引物为5 和 5。 中国农业科学院博士学位论文 第五章 番茄 因的克隆与序列分析 3据前文所获得的 设计基因特异性引物 （表 ， 利用嵌套 照 5剂盒说明书和 3剂盒说明书，分别扩增 和 3端。具体 剂盒说明书和 3 表 于 基因特异性引物 物的克隆与测序 采用 收、纯化 过 体，转化大肠感菌 白斑筛选阳性重组子并进行 认阳性克隆后，每 个单菌落，培养菌液送北京三博远志公司测序。所获得的序列经拼接后，利用用 果与分析 取 所提取的番茄叶片总 188S 外分光光度计检测 之间，表明所提取的总 引物编号 引物序列（ 5 扩增区段 端 端 端 端 中国农业科学院博士学位论文 第五章 番茄 因的克隆与序列分析 物分析 分别取 8l %琼脂糖凝胶电泳。电泳结果显示： 激蛋白 70)的 5000003增出两条带，大小分别为 140000序结果表明， 600400图 列分析 茄 列分析 将所得的 5除载体和引物序列后，与 8S 28S 6h 6h 12h 12茄叶片总 of NA by 00000 1 2图 茄 果 物 ; 物 : 00 1 2 图 茄 果 物 ; 物 : 国农业科学院博士学位论文 第五章 番茄 因的克隆与序列分析 86获得 2415 搜索以及与相似性较高的黄瓜对分析 , 确定了起始密码子在第 78位 , 终止密码子在第 2156位 , 长度为20793位核苷酸为 A, +4位为 G, 是一个典型的 这一结