【毕业学位论文】小麦高分子量谷蛋白近等基因系的培育及1Bx 等位基因表达差异分析博士论文

密级：内部 5 年 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 小麦高分子量谷蛋白近等基因系的培育及 1位基因表达差异分析 of in 士研 究生：庞斌双 指 导 教 师：张学勇 研究员 申请学位类别：理学博士 专 业：生物化学与分子生物学 研 究 方 向：小麦应用基因组学 培 养 单 位：中国农业科学院研究生院 作物科学研究所 提交日期 2007 年 6 月 of in 2007 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议 ) 论文作者签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 论文评阅人、答辩委员名单 （此页请复印论文答辩会上专家签名的一份） 要 高分子量麦谷蛋白是小麦种子的主要储藏蛋白之一，在胚乳中以聚合体形式存在，用强还原剂处理后解聚成单体（ ，简称高分子量麦谷蛋白亚基（ 。在和面时，亚基间通过形成二硫键，形成面筋的 “网络骨架 ”结构，赋予面团一定的弹性和强度，从而影响着小麦的加工品质。尽管国内外对一些 基（对）对面包加工品质的贡献进行了评价，并取得了可喜的成绩，但同时也存在着如下问题： （ 1）取材不同，材料的遗传背景不同，评价的指标不尽统一，从而对同一亚基（对）优劣的评价存在分歧； （ 2）评价的编码基因数量偏少，对同一位点上的一些编码基因（如 点上的 11 1因对）之间的品质贡献差别缺乏量化； （ 3）对大部分亚基（对）对我国传统食品面条、馒头等食品加工品质的影响知之甚少。因此，本试验培育了以 “小偃 54”和 “偃展 1 号 ”为背景的、含 20 个编码基因的近等基因系，对每个 码基因（或基因组合）对面包、面条和馒头等食品加工品质的作用进行评价，为专用小麦品种的选育奠定了基础，创制了背景优异、基因组成来源明确的基因资源材料，为开展小麦品质功能基因组学研究奠定了物质基础。 1 1因是目前公认的优质基因，由山东省农科院作物研究所培育的小麦新品种 0 是面包、面条兼用型强筋小麦品种，其亚基组成是 “1111可见亚基对 1实在其中扮演了非常重要的角色。 对人工合成六倍体小麦进行品质测试的结果表明，来自粗山羊草（ 是 11 了在分子水平上诠释 1 因在分子水平上的进化关系，本文克隆了这三个基因，并在分子水平上分析了它们的结构特征。 因的表达受环境和基因型的影响较小，主要是由遗传决定的。通常情况下，一个小麦品种中 在所有 因中， 1基因的表达量相对最高，但 1基因之间的表达量也存在一定的差异。本文把目标锁定在表达量有差异的 1位基因，克隆它们的上游调控序列，分析其结构特征，并进行了初步的功能验证。下面将全文研究结果归纳如下： 1、获得了以 “偃展 1 号 ”（ 14+15， 5+12）为背景的纯合近等基因系 11 个，带型分别为 “1, 14+15, 5+12”； “1, 7, 5+12”； “6+8, 5+12”； “20x+20y, 10”； “7+8, 5+12”； “14+15, 5+10”； “7, 5+12”； “1, 6+8, 5+12”； “14+15, 10”； “7+8, 5+10”； “14+15, 5+12”。 2007 年 8 月可以进行加工品质测试，其它编码基因的近等基因系正在培育过程中。 2、 获得了以 “小偃 54”（ 1， 14+15， 2+12） 为背景的 1组体 （编号： 012912， ， 14+18， 2+12） ，与其轮回亲本小偃 54 相比，除 1 1不同外，两品系面筋蛋白组成完全相同， 降值和揉面参数显示 012912 比小偃 54 的面团加工品质更好，因此推论， 1因对小麦加工品质的贡献要优于 1因。 3、从不同角度证明了供体亲本 “济麦 20”和轮回亲本 “偃展 1 号 ”所含的 1因既不是 1因也不是 1因，而是一个新的 码基因。 4、克隆到了 11 序结果显示， 1码基因全长为 2391 95 个氨基酸残基，其编码的氨基酸残基数和分子结构与 11码基因全长为2220码 738 个氨基酸残基，是已发表的 因中分子量最大的基因，其中央重复区比 1因多 36 个氨基酸的插入； 514码 836 个氨基酸残基，比对发现，其与来自普通小麦的 1因结构相同，亲缘关系也最近，仅以 3 个谷氨酰胺残基替换了 1 3 个精氨酸残基。 5、通过 法确定了表达有差异的四个 1因，分别为： 1展 1 号） 、 1济麦 20） 、 1国春）和 1麦） 。用同一对引物克隆了这四个基因的上游调控序列，长度分别为： 111 12300果以 1因的上游调控序列为对照，则 1因在 游 54复区缺失一个完整的54件； 1 游存在 185插入； 11075游存在 43插入，且其后 40前面 40重复。 6、启动子功能验证结果表明，所克隆的启动子驱动 因表达强度为： 11 1短为 1192含 185入 )和 845除185入） ，分别构建瞬时表达载体，结果显示， 1192动的 达强度大于 845明 185入对表达强度有正向影响。 7、对插入和缺失片段的序列分析发现，他们都含有类似 列。对这些片段含有的类似列进行统计， 结果显示， 43入含有两个 列， 185入含一个， 54隆到的长启动子依据含有类似 列的多少排序为： 123006） 15） 14） 13） ，这一结果与它们所驱动基因表达量高低（表达量的顺序为： 1111吻合，因此类似 列可能对 码基因的表达有很强的影响。 8、 时表达试验结果表明， 因上游 置的 54列是胚乳特异表达所必需的组件，缺失一个 54件不影响胚乳特异表达，但明显降低了基因的表达强度。 关键词 ：小麦，高分子量麦谷蛋白亚基，近等基因系，加工品质，基因克隆，启动子，瞬时表达 in of of in (1) is on of be by in (2) of is a at 1(3) of as is in to of it is to in In we of 0 ” (4” (as 1, 14+15, 5+12”; “1, 7, 5+12”; “6+8, 5+12”; “20x+20y, 10”; “7+8, 5+12”; “14+15, 5+10”; “7, 5+12”; “1, 6+8, 5+12”; “14+15, 10”; “7+8, 5+10”; “14+15, 5+12”. be in In a 12912 4 to of 12912 to 4, DS of 12912 of 4, on In Dx of 0 a as a so we 1in a 36 in 220be 38 in 39195 51436 In of is of of Bx is in a Bx is , 10, 1 of 1119322582410bp 300a 4bp 40054bp 185bp 845a 43bp 0bp a of 01075by in 1230011In of 192bp 18545bp 185of 3bp 85 4bp 230011, 5, 4 , of by an in of US in 54a in a a “54of by 1 录 第一章 引言 .麦品质的概念及其影响因素分析 . 1 麦品质的概念 . 影响小麦加工品质的因素 . 小麦种子储藏蛋白的分类 .遗传学和多态性 . 2 遗传学 . 多态性 .分子结构、氨基酸组成及分子标记 . 4 分子结构 . 氨基酸组成 . 分子标记进展 .小麦加工品质的关系 . 6 麦 等基因系研究进展 . 11 因表达差异研究 . 11 启动子研究 . 12 麦近缘种属 究 . 12 因的分离 . 13 因的遗传转化现状 . 13 文的立题依据、目的和意义 . 15 麦 等基因系的培育 . 小麦 因的克隆 . 小麦 因差异表达机理研究 .二章 小麦高分子量谷蛋白亚基近等基因系的培育 .料和方法 . 17 验材料 . 实验试剂 . 实验仪器 . 实验方法 .果与分析 . 20 因遗传特点 . 因共显性遗传的表达效应 . 因的确认 . 组体的发现及其品质特性分析 . 已获得的以偃展 1 号为背景稳定的近等基因系 .论 . 26 第三章 因的克隆 . 料和方法 . 28 料 . 方法 .果与分析 . 34 析、 增 . 嵌套缺失突变和 析 . 因的分子结构 . 因的氨基酸序列比较 . 1因的分子结构 . 1因的氨基酸序列比较 . 因的分子结构 . 1因的氨基酸序列比较 . 1 1已发表的 因进化关系 .论 . 44 第四章 位基因表达差异分析 .料和方法 . 46 料 . . 因表达量的计算 . 小麦基因组 提取 . 引物的设计和 应条件 . 测序 . 时表达载体的构建 . 基因枪转化 . 色 .果与分析 . 51 泳结果及定量分析 . 增 . 测序结果 . 1因上游调控序列结构特征及聚类分析结果 . 插入和缺失片段的序列特点 . 体的构建 . 瞬时表达结果分析 .论 . 57 第五章 全文结论 .等基因系的培育 . 59 因的克隆 . 59 位基因表达差异机理研究 . 59