基于纳米粒子放大的生物传感器检测p53蛋白

分类号学校代码10426密级学号2010051009硕士学位论文MASTERDEGREETHESIS基于纳米粒子放大的生物传感器检测P53蛋白作者王楠楠指导教师丁彩凤学科专业应用化学专业代码081704研究方向生物分析化学2013年6月1日基于纳米粒子放大的生物传感器检测P53蛋白学位论文完成日期2013年6月1日指导教师签字答辩委员会成员签字基于纳米粒子放大的生物传感器检测P53蛋白摘要癌症的死亡率极高，近几年来，是严重威胁人类健康的重大疾病。对肿瘤标志物的准确灵敏的检测，对于肿瘤的诊断、预防、治疗和疗效观察的研究具有重要的作用。其中，P53蛋白是一种重要的肿瘤抑制蛋白，它与细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞衰老、DNA损伤修复、细胞代谢状态改变或发生自噬等重要的生物学功能有关。在高于50的癌症中，P53基因出现异常，因此，对于P53蛋白的临床检测具有着重要的意义。本论文主要结合了纳米技术，生物条码，滚环复制等技术，得到信号的放大作用，通过石英晶体微天平检测、表面增强拉曼检测等方法实现了对野生型P53蛋白及全部P53蛋白的高灵敏度检测。以下是论文包含的内容1、研制了一种新颖的基于纳米金粒子质量放大石英晶体微天平（QCM）的频移信号，检测肿瘤标记物P53蛋白的新方法。该方法将抗体先固定在芯片上，对金纳米粒子修饰共识双链DNA，通过抗体与抗原的特异性免疫反应及共识双链DNA对野生型P53蛋白的识别作用，将能放大QCM频移信号的金纳米粒子固定在QCM芯片上，实现对野生型P53蛋白的检测，具有较高的灵敏度和良好的选择性。在最佳实验条件下，对野生型P53蛋白的检测限为01PGML1。此方法灵敏度高，选择性好，就有广泛的应用前景。2、研制了一种基于纳米粒子，免疫金及双抗体夹心技术，通过石英晶体微天平（QCM）的频移信号检测P53蛋白的方法。该方法将抗体先固定在芯片上，二抗与金纳米粒子制成免疫金，利用抗体对P53蛋白进行识别，将放大QCM频移的金纳米粒子固定在芯片上，实现对P53蛋白的灵敏检测，其检测限为01PGML1。将该方法与上章检测野生型P53蛋白的方法相结合，可以得到野生型P53蛋白同突变型P53蛋白的比例，判断是否是癌细胞，故能为临床医学和生物分析提供了一种新的分析方法。3、报道了一种基于循环信号放大以及生物条码技术，通过表面增强拉曼光谱（SERS）技术来实现对野生型P53蛋白的检测。该方法将拉曼信号分子罗丹明标记的SINGALDNA和PROBEDNA修饰到金纳米粒子上，制成生物条码；通过滚环放大将固定在修饰有抗体的聚苯乙烯微球上的PRIMMERDNA复制得到的长链可以接合许多的拉曼信号分子编码的生物条码探针；另外，对金纳米粒子修饰上共识双链DNA；由于抗原抗体特异性免疫反应及共识双链DNA对野生型P53蛋白的识别作用，将它们都固定在纳米金磁微粒上。这样，通过表面增强拉曼光谱（SERS）就可以来完成对野生型P53蛋白的检测。关键词P53蛋白，金胶纳米粒子，肿瘤细胞，石英晶体微天平，滚环复制，表面增强拉曼光谱ANEWBIOSENSORBASEDONNANOPARTICLESANDAPPLICATIONINASSAYOFP53PROTEINABSTRACTINRECENTYEARS,THEMORTALITYRATEOFCANCER,ONEOFTHEMOSTTHREATENINGDISEASESOFTHEHUMANBEING,ISBECOMINGINCREASINGLYHIGHTHEACCURATEANDSENSITIVEDETECTIONOFTRACETUMORMARKERISCAPABLEOFDIAGNOSINGCANCER,PREVENTION,TREATMENTANDCLINICALOBSERVATIONTHEREINTO,P53,ATUMORSUPPRESSORPROTEINANDATRANSCRIPTIONFACTOR,PLAYSANIMPORTANTROLEINCELLGROWTHCONTROL,DNAREPAIR,ANDPROGRAMMEDCELLDEATHINMORETHAN50OFCANCERCASES,THEP53GENEHASBEENFOUNDTOBEMUTATED,THEREFORE,THEDETECTIONOFP53PROTEINISTHEESSENTIALNEEDTHISTHESISREPORTEDNEWMETHODSBASEDONNANOTECHNOLOGY,BIOBARCODEANDRCA,WHICHWEREUSEDTODETECTWIDETYPEP53ANDTAOTALP53PROTEINBYQCMANDSERSTHISTHESISMAINLYCONSISTSOFTHEFOLLOWINGTHREEPARTS1WEDESIGNEDANOVELMETHODTODETECTWIDETYPEP53PROTEINWITHAQUARTZCRYSTALMICROBALANCEQCMSENSORBASEDONTHEAMPLIFICATIONOFGOLDNANOPARTICLESAUNPSTOACHIEVETHEQCMASSAY,GOLDCRYSTALCHIPAUCHIPWASIMMOBILIZEDWITHPRIMERANTIBODYAB1OFP53PROTEINSTHROUGHTHELINKINGOFCYSTEAMINETHENTHEWIDETYPEP53PROTEINANDCONSENSUSDOUBLESTRANDEDDSDNAMODIEDWITHAUNPSWEREINJECTEDSEQUENTIALLYACCORDINGTOTHEHIGHAFNITYOFTHECONSENSUSDSDNATOTHEWILDTYPEP53PROTEINANDTHEANTIBODYTOP53PROTEIN,ASTABLEFRAMEWORKWASFABRICATEDTHEDETECTIONLIMITOFTHISASSAYFORWIDETYPEP53PROTEINDETERMINEDIS01PGML1THEMETHODHOLDSGREATPROMISEINTHEBIOCHEMICALASSAYFORTHEEARLYDIAGNOSISOFCANCERS,WHICHHASHIGHSENSITIVITYANDEXCELLENTSELECTIVITY2BASEDONTHEAMPLIFICATIONOFQUARTZCRYSTALMICROBALANCEQCMSIGNALSBYGOLDNANOPARTICLES,ANOVELANDSENSITIVEASSAYFORTHETOTALP53PROTEINDETECTIONHASBEENDEVELOPEDBYUSINGNANOPARTICLES,IMMUNOGOLDANDSANDWICHTYPETECHNIQUESTOACHIEVETHEQCMASSAY,GOLDCRYSTALCHIPAUCHIPWASIMMOBILIZEDWITHPRIMERANTIBODYAB1OFP53PROTEINSTHROUGHTHELINKINGOFCYSTEAMINETHENTHETOTALP53PROTEINANDAB2MODIEDWITHAUNPSWEREINJECTEDSEQUENTIALLYACCORDINGTOTHEANTIBODYTOP53,ASTABLE“SANDWICH”FRAMEWORKWASFABRICATEDTHEDETECTIONLIMITOFTHISASSAYFORTOTALP53PROTEINDETERMINEDIS01PGML1COMBINEDWITHTHEFIRSTPART,THEDIFFERENCEINTHEQCMSIGNALSBETWEENTHETOTALP53ANDWIDETYPEP53PROTEINREVEALSTHEEXTENTOFP53MUTATION,WHICHISINDICATIVEOFCANCERDEVELOPMENTTHUS,THEQCMSENSORCOULDPOTENTIALLYSERVEASANATTRACTIVETECHNIQUEFORRAPID,SENSITIVE,RELIABLE,ANDLABELFREECANCERDIAGNOSES3THEDETECTIONOFWIDETYPEP53PROTEINISACHIEVEDBYSURFACEENHANCEDRAMANSPECTROSCOPYSERS,BASEDONROLLINGCIRCLEAMPLIFICATIONRCAANDBIOBARCODESIGNALAMPLIFICATIONTECHNOLOGYTOACHIEVETHESERSASSAY,THEPRIMERDNAMODIFIEDONJS,WASDEVELOPPEDINTOALONGCHAINDNAATTHEPRESENCEOFROLLINGCIRCLEAMPLIFICATIONTHELONGCHAINDNACANHYBRIDIZEWITHBIOBARCODETOAMPLIFYTHESERSSIGNALSACCORDINGTOTHEHIGHAFNITYOFTHECONSENSUSDSDNATOTHEWILDTYPEP53PROTEINANDTHEANTIBODYTOP53,ALLTHESEPARTSWEREIMMOBILIZEDONTHEGOLDCSATLAST,WECANDETECTWILDTYPEP53BYSERSKEYWORDSP53,NANOPARTICLESAUNPS,CANCERCELLS,QUARTZCRYSTALMICROBALANCEQCM,ROLLINGCIRCLEAMPLIFICATIONRCA,SURFACEENHANCEDRAMANSPECTROSCOPYSERS目录第1章前言111生物传感器1111生物传感器的概念、组成及分类1112生物传感器的工作原理2113生物传感器的特点2114免疫传感器31141免疫传感器的概念31142免疫传感器的分类3115DNA生物传感器41151DNA生物传感器的工作原理41152DNA生物传感器的分类41153DNA生物传感器的应用512生物分析中纳米材料的应用5121纳米材料的定义及特征5122纳米粒子的制备和修饰51221DNA修饰的纳米金粒子61222蛋白质修饰的纳米金粒子7123纳米粒子的应用71231纳米金在免疫传感器中的应用71232纳米金在表面增强拉曼光谱中的应用81233纳米金粒子在电化学DNA传感器中的应用813肿瘤细胞及肿瘤标志物9131肿瘤的概念及分类9132癌细胞的特点10133肿瘤标志物及其分类10134目前对肿瘤标志物的检测方法111341酶联免疫分析方法111342胶体金免疫分析方法12135P53基因及P53蛋白121351P53基因及其蛋白的概述121352P53蛋白的检测1214滚环复制放大技术14141滚环复制放大技术概述14142RCA技术基本原理14143RCA技术的种类15144RCA技术的应用1515课题意义及主要内容15参考文献17第2章基于纳米粒子放大作用的QCM传感器检测野生型P53蛋白2121引言2122实验部分22221仪器与试剂222211试剂222212仪器22222实验方法222221AU纳米粒子的制备232222修饰有互补双联DNA的金纳米粒子的合成232223石英晶体微天平芯片的预处理232224P53蛋白及其抗体的预处理232225固定P53蛋白的抗体AB1242226石英晶体微天平检测野生型P53蛋白2423结果与讨论24231QCM检测野生型P53蛋白的原理24232紫外可见吸收光谱图谱25233共识双链DNA对野生型P53蛋白的识别25234实验最佳条件的优化262341P53蛋白抗体（AB1）浓度的优化262342共识双链DNA用量的优化272343粒子粒径的优化28235实验方法选择性研究28236QCM对于野生型P53的检测2924小结30参考文献32第3章利用金胶放大作用的QCM传感器检测肿瘤细胞中的P53蛋白3531引言3532实验部分36321仪器与试剂363211试剂363212仪器36322实验方法373221细胞培养373222从MCF7细胞中提取P53蛋白373223金纳米粒子的制备373224免疫金的制备373225石英晶体微天平芯片的预处理383226固定P53蛋白的抗体AB1383227石英晶体微天平检测P53蛋白383228ELISA方法检测P53蛋白3833结果与讨论38331设计方案及工作原理38332实验最佳条件的优化393321制备免疫金时第二抗体用量优化393322所用金纳米粒子粒径的优化40333实验方法选择性研究40334QCM对于P53蛋白的检测41335ELISA对于P53蛋白的检测42336实验的准确性43337实际样品分析测定4434小结44参考文献45第4章基于滚环复制放大作用的拉曼传感器检测野生型P53蛋白4841引言4842实验部分49421仪器与试剂494211试剂494212仪器49422实验方法504221生物条码的制备504222抗体（AB1）修饰的PS的制备504223滚环复制放大（RCA）步骤504224生物条码的组装504225修饰有互补双联DNA的纳米金磁微粒的合成504226表面增强拉曼光谱检测野生型P53蛋白5143结果与讨论51431QCM检测野生型P53蛋白的原理51432生物条码的紫外表征52433对照实验53434实验条件的优化534341生物条码中捕获SIGNALDNA与PROBEDNA比例的优化534342滚环复制时间的选择544343共识双链DNA用量的优化55435实验方案的选择性研究5544小结56参考文献57结论60致谢61硕士期间发表论文62声明63第1章前言11生物传感器生物传感器是指由一种生物敏感部件和转换器紧密的结合，对某些特定种类的化学物质或生物活性物质具有选择性及可逆性的分析装置1。敏感元件通常是将生物体的某种成分（如抗原、抗体、DNA等）或生物体本身（如组织、细胞等）固定在一器件。生物传感器具有灵敏度高、选择性好、成本低、分析速度快、能在复杂体系中进行在线连续监测等优点，是发展生物技术不可缺少的一种先进的检测及监控方法，同时也是对物质在分子水平上进行快速和微量分析的方法之一2。生物传感器36作为一门新兴高科技技术，它涉及的多种学科包括生物、物理、化学、材料、医学、电子技术等在内，在生物、医学、食品检测、环境监测、军事等领域的应用潜力有着巨大的，已经成为二十一世纪生命科学和信息科学发展的一个重要方向。111生物传感器的概念、组成及分类生物传感器是将一种生物材料（如组织、细胞、细胞器、酶、抗原、抗体、DNA等）或生物衍生材料、生物模拟材料等与物理化学传感器或传感微系统紧密结合或联系起来，发挥其分析功能7。生物传感器由生物敏感膜（分子识别元件）、信号转换器及信号处理器三部分构成（如图11所示）。其中，生物敏感膜主要有酶、抗体、DNA聚合物、细胞受体、细胞、组织等生物活性单元，它们均具有特异选择性作用的功能。信号转换器8主要有电化学电极、光敏管、热敏电阻、场效应管、压电晶体和表面等离子共振器件等。信号转换器是将被测物与生物敏感膜特异性结合后所产生的生物的、化学的和物理的等信息转变成电信号、光信号、热信号等，通过检测这些信号就能达到分析检测被测物的结果。图11生物传感器的结构FIG11THESTRUCTUREOFBIOSENSORS生物传感器生物敏感元件的特异选择性决定了生物传感器的选择性，而它的整体组成则对它的其他性能存在影响。关于生物传感器的分类方法很多中，其中，根据生物物质分类，可分为酶传感器、微生物传感器、细胞器传感器、组织传感器、免疫传感器、基因（DNA）传感器等9；根据转换器分类，可分为半导体式、光敏电阻式、热敏电阻式、电化学电极式、压电晶体式、等离子体共振式等（如图12所示）。图12生物传感器的分类FIG12THECLASSIFICATIONOFBIOSENSORS112生物传感器的工作原理生物传感器是一门高新技术，它涉及多个学科及领域，其基本原理是当被分析物质经扩散作用进入生物敏感元件，经分子识别，发生生物学反应；这些反应所产生的信息继而被相应的换能器转变成可定量和可处理的声、光、电等信号，再经检测放大器放大并输出，便可知道被分析物质的量或浓度10（如图13所示）。图13生物传感器的原理FIG13PRINCIPLEOFOFBIOSENSORS113生物传感器的特点在生物、食品检测、环境监测、医学和军事等领域，生物传感器有着相当重要的应用价值。与其他方法技术相比，生物传感器具有以下优点（1）测定范围广泛；（2）成本低；分析速度快；（3）准确度高；（4）灵敏度高；（5）操作系统，易于实现自动分析；（6）专一性强，不易受其他因素，如颜色、浊度等的影响；（7）可进入生物体内。114免疫传感器免疫传感器是生物传感器中重要的、新兴的一种，由于它的高度特异性、敏感性和稳定性受到关注，它的问世给传统的免疫分析带来了很大的发展。免疫传感器是将传统的免疫测试和新兴的生物传感技术结合在一起，从而具有两者的许多优点，不仅能够提高灵敏度及测试精度，还可以减少分析时间，也可以使测定过程变得更加简单，更容易实现自动化。基于这些特点，免疫传感器的应用前景非常广阔，应加大力度发展11。1141免疫传感器的概念免疫传感器的概念是在20世纪90年代首次由HENRY等提出的，它是在特异性免疫放映的技术上，引入了高灵敏的传感技术，将两者结合起来，检测抗原抗体特异性反应的生物传感器，它的生物敏感膜上偶联有抗原或抗体分子，与信号转换器相结合，构成了一种新型的生物传感器12。免疫传感器的测定原理是基于抗原（或半抗原）和其特异性抗体发生免疫反应，从而形成稳定的复合物。抗原和抗体结合而发生的免疫反应，特异性很高，即它是具有极高的选择性和灵敏度。在此基础上发展起来的免疫传感器也具有了选择性高、灵敏度高以及快速、操作简便等特点。随着研究的不断发展，现代的免疫传感器以广泛的应用在各个领域。1142免疫传感器的分类免疫传感器按是否进行标记，主要分为标记免疫传感器和非标记免疫传感器13。在检测前就对被测物进行了标记，通过对标记物的量变监控免疫反应的免疫传感器，被称为标记免疫传感器。这种传感器的非特异性影响小，但检测过程很复杂。非标记免疫传感器是通过直接测定抗原抗体的复合物形成时的物理化学变化，能够极大地简化制备及操作的过程（如图14所示）。非标记免疫传感器已成为生物传感器的一个重要发展方向。近几年来，石英微天平型免疫传感器、表面等离子共振型免疫传感器以及电容型免疫传感器成为研究的热点1415。图14非标记免疫传感器的原理FIG14PRINCIPLEOFLABELFREEIMMUNOSENSOR免疫传感技术结合了生物学、物理学、化学与医学为一体，有着巨大的发展潜力，将影响临床、食品卫生和环境监测等诸多领域里的实用性研究。随着生物技术、纳米技术、材料科学、光电子技术、计算机科学等技术的发展及其在实际应用领域的迫切需要，免疫传感器在各个方面将会得到改进，实现进一步的发展16。115DNA生物传感器DNA生物传感器与免疫生物传感器相同，都是20世纪90年代逐渐发展起来的一种新的传感器技术。从其发明至今，DNA传感器一直引起了人们的广泛的关注，这是由于它简单、无毒、快速、成本低、灵敏度高、可用于活体检测等优势1718。特别是近几年来，DNA传感器成为当今生物传感器领域中的前沿性课题之一。它是以DNA作为生物敏感元件，与相应的换能器结合，实现对特定化学物质的作用，产生相应的可检测信息（如热效应、电效应、光效应、场效应及质量变化等）19的传感装置。1151DNA生物传感器的工作原理DNA生物传感器和其他生物传感器一样，包含两部分分子识别元件（DNA）和信号转换器。通过一些生物、化学或物理作用，待测物、分子识别元件以及信号转化器件之间彼此相互联系。识别元件主要用来感知样品中待测物质的含量；转换器则将识别元件（DNA）感知的信号转化为可以观察记录的信号（如电流