中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂对大鼠脑出血作用的实验研究(可编辑)

中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂对大鼠脑出血作用的实验研究密缀一分类号一一娶缫一一一一一一。重庆医科大学硕士学位论文燃譬姚黼麟镛鬻霎蒸裂榭犬竺作者姓名一一夔熊一董森教授糍导羲师鲢囊鼗称、单链毫替重痰医料大学莲学院药理夔望建学秘、专建毫拣芬理学串靖学位缀粼硬建文誉辩年冀一型生墨曼一黼牮月重庆医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料,与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任黄轴学位论文作者签名学位论文版权使用授权书本人完全了解熏庆医科大学有关保护知识产权的规定,即研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学本人保证毕业高校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容保密内容除外,可以采用影印、缩印或其他手段保存论文论文作者签名妻垫指导教师签名二菱墨日期兰坚垒哩二重庆医科大学硕士研究生学位论文符号说明英文缩写英文全称中文名称脑出血一多型核白细胞中性粒细胞弹性蛋白酶垃髓过氧化物酶西维来司钠核因子急性肺损伤锄细胞间黏附分子诱导型一氧化氮合酶砒盯脑含水量一氧化氮毫克缺血/再灌注摩尔纳摩尔蛋白质磷酸盐缓冲甲基天冬氨酸重庆医科大学硕士研究生学位论文中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂对大鼠脑出血作用的实验研究摘要背景与目的脑出血,是指非外伤性的脑实质内出血,是严重危害老年人的一种常见病、多发病,且发病率、死亡率和致残率都很高,是急性脑血管病中的危重类型,脑出血性卒中占全部脑卒中的。脑出血时,除了血肿的占位性病变外,患者还会出现一系列继发性脑损伤,如脑水肿、缺血、炎症反应、血肿周围组织能量代谢紊乱及氧自由基损伤。由于脑出血病理生理机制复杂,病因学尚未完全清楚,多数患者仍然以内科保守治疗为主,至今还没有特效的治疗方法】。研究证实,中性粒细胞与脑缺血/再灌注,后的继发性脑损伤有密切联系鲫】。大脑在脑缺血/再灌注后中性粒细胞被激活,可释放多种蛋白水解酶,其中,是中性粒细胞释放的中性粒细胞弹性蛋白酶一种重要的丝氨酸蛋白水解酶,可以降解基底膜和其它重要的细胞间基质,能增加细胞因子的产生、黏附分子表达,和脑组织水肿也密切相关。重庆医科大学暖士研究生学位论文西维来司钠是一种小分子中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂,能选择性地抑制弹性蛋白酶,目前主要用于急性肺损伤的治疗【。实验证明,西维来司钠不仅在体外能抑制弹性蛋白酶引起的肺血管内皮细胞对蛋白通透性的增加,而且静脉滴注能抑制弹性蛋白酶引起的大鼠的出血性肺损伤。在各种急性肺损伤模型中,预防性或治疗性静脉滴注西维来司钠均能够改善肺泡出血、蛋白渗出及肺血管通透性增加等病理改变。近年国外有报道西维来司钠能够改善脑缺血/再灌注引起的脑水肿、脑损伤及炎症反应。也能改善脊索损伤引起的脑内的炎症反应、减少神经元损伤【。但西维来司钠对脑出血引起的脑组织损伤是否有保护作用,目前国内外尚未见相关报道。由于脑出血与脑缺血引起的脑组织损伤有许多相似之处,都有脑组织的炎症、水肿以及局部脑血流的变化。我们可以推测,西维来司钠可能对脑出血也具有保护作用。本研究的目的旨在从行为学、神经病理学和神经生化三个方面,来探讨的含量和脑出血关系以及西维来司钠对大鼠脑出血模型的保护作用及其机制。实验方法采用尾状核微量注射胶原酶所诱导大鼠模型,观察大鼠脑组织内含量、脑含水量的动态变化观察西维来司钠对大鼠的行为学改变、脑组织病理改变、脑含水量变化的影响观察西维来司钠对表达、活性以及及含量的影响。重庆医科人学硕士研究生学位论文结果和结论大鼠脑组织含量明显增加,即升高,达最高峰,以后逐渐下降大鼠脑组织含水量也明显升高,达高峰,两者呈正相关。的增加是脑水肿形成的主要原因之一。西维来司钠能促进大鼠神经功能缺损症状的改善减轻脑水肿及病理损伤,呈剂量依赖性。表明西维来司钠对胶原酶所引起的大鼠脑组织有保护作用。西维来司钠能减少大鼠脑组织内含量和的过量表达阻止活性的增加及含量的增多。表明西维来司钠是通过这几个机制来实现对脑出血的保护作用。关键词脑出血,中性粒细胞弹性蛋白酶,西维来司钠重庆医科大学曛士研究生学位论文,重庆医科大学硕士研究生学位论文,/,/,。,、重庆医科大学硬士研究生学位论文,/,重庆医科丈学碗士研究生学位论文中性粒细胞弹性蛋白酶及其抑制剂对大鼠脑出血作用的实验研究刖昂脑出血,是严重危害老年人的一种常见病、多发病,其发病率约占脑卒中病人的,是所有脑卒中患者中病死率最高的类型之一。脑出血发生后,患者脑组织出现一系列复杂的病理生理改变,如脑水肿、炎症反应、血肿周围组织能量代谢紊乱及氧自由基损伤等。对于脑出血,目前临床上仍然以内科治疗为主,主要是对症治疗,包括脱水,降低颅内压、调整和稳定血压、改善脑营养代谢和防治并发症,对脑出血量大且有手术指征者可采取手术治疗。由于脑出血病理机制复杂,病因学尚未完全清楚,至今还没有特效的治疗方法,因而病死率和致残率都很高,存活的患者常遗留神经功能障碍【”】。目前的研究表明,后脑组织内存在中性粒细胞和巨噬细胞浸润、小胶质细胞激活和炎性因子参与的炎症反应【嘲。,是种内源性蛋白酶,人体中性粒细胞弹性蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类,在生理情况下位于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中,主要参与对杆菌的杀灭作用,同时也参与中性粒细胞迁移,促进炎症因子如,一、等的表达,调节炎症反应,因此它对机体防御功能非常重要。但在炎症情况下,激活的中性粒细胞释放大量的弹性蛋白酶至细胞外,引起机体组织器官的弹性蛋白、蛋白多糖和胶原等降解,从而导致组织、细胞和血管基底膜损伤。和脑损伤密切相关,】等人的实验发现缺血/再灌注损伤的大鼠脑组织含量明显升高,而抑制剂能减轻脑组织损伤。西维来司钠又名一,是一种小分子中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂,能选择性地抑制弹性蛋白酶。由日本小野制药株式会社最早研制,于年月在我国进入临床研究阶段,用于治疗“非典”,引起的急性肺损伤。重庆医科大学颂士研究生学位论文实验证明,西维来司钠不仅在体外能抑制弹性蛋白酶引起的肺血管内皮细胞对蛋白通透性的增加,而且静脉滴注能抑制弹性蛋白酶引起的大鼠的出血性肺损伤。在各种急性肺损伤模型中,预防性或治疗性静脉滴注西维来司钠均能够改善肺泡出血、蛋白渗出及肺血管通透性增加等病理改变。多项研究表明,本品用于治疗的作用机制可能包括以下几个方面】直接抑制的释放,减少活化的中性粒细胞介导的肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的损伤降低肺血管内皮细胞的通透性,减少血栓调节素的释放,降低肺动脉压和肺的通透性抑、肿瘤坏死因子的制人单核细胞的致炎症细胞因子如产生抑制上皮层的黏液分泌抑制抗原诱导的气道微血管渗漏。除了治疗外,近年国外也有报道西维来司钠能够改善脑缺血/再灌注引起的脑水肿、脑损伤及炎症反应”,能改善脊索损伤引起的脑内的炎症反应、减少神经元损伤【。但西维来司钠对脑出血引起的脑组织损伤是否有保护作用,目前国内外尚未见相关报道。基于以上背景,本课题旨在研究与脑出血的关系,以及从神经生化、组织病理形态学和行为学观察其抑制剂西维来司钠是否对胶原酶所诱导的模型具有保护作用,并探讨其作用机制。论文共分三部分第一部分在实验性脑出血大鼠脑组织中的动态变化第二部分西维来司钠对大鼠脑出血保护作用的实验研究第三部分西维来司钠对大鼠脑出血保护作用相关机制的实验研究重庆医科大学硕士研究生学位论文第一部分在实验性脑出血大鼠脑组织中的动态变化是存在于中性粒细胞中的蛋白酶,在生理情况下,它对机体防御功能非常重要。在炎症情况下,激活的中性粒细胞释放大量的弹性蛋白酶至细胞外,可损伤组织、细胞和血管基底膜。近年来的研究发现,与脑血管疾病的关系密切,在脑组织损伤的过程中有重要作用。国外的文献报道表明与大鼠脑缺血/再灌注所引起的脑损伤有关,但是其与脑出血后的继发性脑损伤是否有关目前还未见报道。本研究选用目前最常见、造模成功率较高的胶原酶诱导产生的大鼠脑出血模型,检测脑出血后,血肿周围脑组织的以及脑组织含水量的动态变化,探讨脑组织的变化对脑出血后的继发性脑损伤的影响及其两者间的关系。材料和方法一、实验材料一实验动物健康大鼠,雄性,体重,由重庆医科大学实验动物中心提供,术前禁食,自由饮水。二主要试剂和药品胶原酶型美国公司水合氯醛苏州正兴化工厂三主要仪器设备国营西北光学仪器厂大鼠脑立体定位仪微量注射器上海保西玻璃仪器厂电子分析天平,恒温干燥箱重庆实验仪器厂重庆医科大学硕士研究生学位论文二、实验方法一实验动物分组动物随机分为两个大组,即假手术组和模型组。其中每个组又分、五个时间点。二大鼠模型建立大鼠适应性喂养天后,参照等造模方法,将大鼠以的水合氧醛按/体重腹腔麻醉后,剪去颅顶切口区毛,俯卧位固定在大鼠脑立体定位仪上,按照包新民等报道的定位方法使齿沟平面比耳间线平面低,这样大鼠前囟和后囟在同一平面。酒精消毒后,头皮正中切口,暴露前囟,于前囟后、中线向左旁开处用五号针头钻透颅骨,钻直径约为的小孔,用固定于立体定位仪上的微量注射器沿针孔垂直进针尾状核位置后,将胶原酶型用生理盐水配成/缓慢匀速注入脑组织,留针后缓慢退出,缝合切口。假手术组注射等体积生理盐水,其余操作同。术后动物按组分笼饲养,正常进食进水,室温控制在左右。三检测指标血肿周围脑组织的测定各实验组大鼠分别于手术后的相应时间点,经水合氯醛麻醉后,快速断头取脑,取血肿周围脑组织精确称重,置于。保存备测。测定时将脑组织用生理盐水在冰浴环境内以玻璃匀浆器制成的脑组织匀浆。的测定用法。原理本试剂盒采用双抗夹心法。抗大鼠单抗包被于酶标扳上,大鼠标本中的会与单抗结合,加入生物素化的抗大鼠二抗,它将与结合在单抗上的大鼠结合而形成的免疫复合物,未结合的将被洗去,辣根过氧化物酶标记的将与二抗的生物素结合,多余的物质会被洗掉,加入显色,大鼠的浓度与成正比。步骤加入标准品于相应板的标准孔中。加入以稀释标本于相应板样品孔中。轻轻摇动秒,在环境温育。重庆医科大学硕士研究生学位论文洗板甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板每孔内加入洗涤液,并去除水滴,反复洗涤三次。每孔加入温,轻轻混匀秒,在育。洗板甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板每孔内加入洗涤液,并去除水滴,反复洗涤三次。每孔加入,轻轻混匀秒,温育耐为浓缩酶联物。洗板甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板每孔内加入洗涤液,并去除水滴,反复洗涤三次。每孔加入显色液,轻轻混匀秒,也温育。,轻轻混匀秒,内在每孔加入终止液处读取值。以值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线,根据样品的值,在标准曲线上查出其浓度,单位为/。脑含水量测定各组动物在脑出血后的预定时间点,经水合氯醛麻醉后,迅速断头取脑,将取出的脑组织放在用生理盐水浸润过的滤纸上,以防止水分蒸发。去除软脑膜和血迹,以进针孔为中心,切取周围脑组织,精密称重精确到。从取脑到称重完成的时间控制在以内。将脑组织置于恒温烘箱,再称取干重。按公式计算脑含水量湿重一干重/湿重三、统计学处理实验数据以均数标准差表示,用统计软件进行检验,显著性水平。重庆医科大学颂士研究生学位论文结果一、实验性脑出血大鼠血肿周围脑组织中含量的动态变化实验结果表明假手术组各个时间点的含量基本保持在同一水平,而大鼠脑组织的含量随着脑出血时间的延长而逐渐升高,含量与假手术相比即有明显增加,达最高峰,之后又缓慢下降。组各个时间点含量与假手术组相应时间点比较均有显著性差异,见和。表大鼠脑出血后,、脑组织含量的动态变化,哪一一工眦州时卜图大鼠脑出血后、脑组织含量的动态变化,重庆医科大学硕士研究生学位论文二、实验性脑出血大鼠血肿周围脑组织的含水量的动态变化本实验结果显示假手术组各时问点脑组织含水量基本维持在同一水平,而组大鼠脑组织含水量则随时间推移逐渐增加,含水量已经商于对应的假手术组,在达最高峰,随后开始缓慢下降。模型组脑组织中各时间点的含水量与假手术组相比均有显著性差异,见和。表大鼠脑出血后、脑组织含水量的动态变化,/。啕。堕阻眩鲫豫一葶一时事州面口卜他图犬鼠脑出血后、脑组织含水量的动态变化、重庆医科大学硕士研究生学位论文讨论脑出血,系指非外伤的脑实质内出血,发生后除了血肿本身的占位性损害外,尚有周围脑组织血液循环障碍、局部脑血流量的下降、代谢紊乱、炎症反应等,从而导致脑组织的继发性损伤、神经功能的障碍【。】等人的实验也发现后脑组织内存在中性粒细胞浸润、小胶质细胞激活和炎性因子参与的炎症反应以及水肿,神经功能缺损等。脑出血的实验研究始于世纪年代,最初的研究包括颅内压、脑水肿和组织学改变,继而研究神经元、神经胶质和自细胞方面的变化,血凝块的吸收和星形细胞胶质疤痕的形成以及脑血流改变和血肿区水肿的出现等。自世纪年代以来,人们采用大鼠脑出血模型着重对局部脑血流、大脑灌注压、血脑屏障的完整性和占位效应等进行了研究,不同的研究目的对动物的要求、出血的部也不尽相同。大鼠由于廉价、易获取、脑体积小,易于进行组织学和病理学方面的研究,已积累了大量成熟的生理,病理生理、药理和形态学等方面的实验资料,且其脑血管解剖结构与人类相似,因此大鼠脑出血模型的应用日益广泛,方法渐趋成熟。目前常用的实验性脑出血模型有以下种自体血注入法胶原酶诱导法微球囊充胀法自发性脑出血等。自体血注入法用于大动物时,产生的血肿大小和形态较为一致,但用于大鼠时的重复性差,尤其是注血量、血肿大小与部位都难以掌握,其原因主要是注血速度稍快,血流往往顺针道溢出,进入蛛网膜下腔和硬脑膜下腔,且易破人脑室。故其造模成功率较低。微球囊充胀法的制作方法是将微球囊置于号针内,经立体定向植入大鼠尾状核,稳定后,在的压力下于秒内将球囊充胀,造成脑出血占位效应,充胀一定时间后去充胀。然而,这种模型并未涉及到出血和脑实质之间的重要关系,且由于无血管活性因子的作用,占位灶周围缺血性损伤不明显,显然这种机械性损伤与实际脑出血病理生理和组织学改变相差甚远【嗡,尽管这种模型制作方法简单、易操作、重复性好且无注入自体血模型的诸多弊端,但由于其与临床脱节太多,除用于脑出血血肿清除方面的研究外,较少应用。自发性脑出血模型被认为是目前研究高血压动脉硬化性脑卒中的较理想的模型,但它有严格的遗传局限性,易变种或断种、难于饲养,价格昂贵、重庆医科大学硕士研究生学位论文来源困难,尽管与临床脑出血的病理生理接近,但由于其遗传性血管损害以及制作模型的不稳定性、所需时间的不确定性、病灶大小的易变性以及模型的不可比性,使其应用大大受限。胶原酶诱导脑出血模型是目前国内外最为常用的方法之一。胶原酶是一种金属蛋白酶,可降解间质和基底膜的胶原,从而造成出血,此模型在某些方面最接近临床。等认为,此模型在脑水肿、组织学和行为学方面的病理与脑内出血相一致。该方法注入脑内的液体量少,几乎没有药液本身的压迫占位效应,较自体血注入脑内造膜方式为佳,大鼠尾状核是脑内最大核团,易于定位,且位于基底节,是人类高血压脑出血的好发部位,当注入胶原酶时大鼠几乎都可以存活,出血点周围可见明显水肿,而胶原酶用量达时,大鼠几乎全部于内死于脑水肿和脑疝,因此被选作常规应用剂量。本实验采用尾状核内胶原酶注射制作大鼠脑出血模型,脑内立体定向注射胶原酶后模型组动物尾状核均形成典型血肿,同时出现神经功能缺损体征,较好地模拟了同部位脑出血的临床体征。该模型最大的优点是造膜成功率高、重复性好,对于新药研究是一种较为理想的模型。弹性蛋白酶是体内重要的蛋白水解酶,直接参与了体内各种生理和病理过程,在感染性疾病发生、组织损伤和炎症等诸多方面起着重要介质作用,其活性受和巨球蛋白,抗胰蛋白酶,所抑制。各种体液或组织中弹性蛋白酶水平的高低可以很好地反映该组织损伤的严重程度。在正常生理情况下,由巨噬细胞、中性粒细胞释放的弹性蛋白酶很少,并不断与抗蛋白酶系统如。和结合形成复合物而被巨噬细胞、中性粒细胞吞噬清除,蛋白酶和抗蛋白酶之间保持着一种动态平衡,不会引起正常组织的破坏和损伤。但当机体受到外源或内源性伤害如创伤、烧伤等时,中性粒细胞、巨噬细胞等被激活可分泌大量的弹性蛋白酶,降解邻近组织的弹性蛋白、多粘蛋白、基底膜和胶原纤维,而使组织遭受到破坏和损伤。近年来的研究发现,各种急性肺损伤的发病和中性粒细胞聚集于肺血管内皮细胞或迁移至血管外释放的大量的有关口一。中性粒细胞释放的弹性蛋白酶能降解弹性蛋白、胶原、蛋白多糖等细胞基质主要构成成分,造成组织的损伤。”等人发现在脑缺血,再灌注大鼠血浆中显著升高,用抑制剂西维来司钠治疗后,脑组织损伤有明显改善。重庆医科大学硕士研究生学位论文脑水肿是脑出血后重要的继发性脑损伤之一,是颅内压增高的主要原因,也是继发病理生理变化的主要因素”。测定脑含水量在一定程度上反映的严重程度和药物的治疗效果。本研究观察了假手术组和模型组大鼠脑组织中含量和脑组织含水量的动态变化。结果显示脑出血大鼠血肿周围脑组织的及脑含水量与假手术组相比均有显著升高,含量于明显升高,在达高峰,以后又逐渐下降。脑组织含水量时程变化与相似,也随时问延长而逐渐升高,在达高峰,用统计软件分析后发现两者间呈正相关,相关系数为。本实验结果提示实验性脑出血大鼠脑组织内含量的升高与大鼠脑出血后脑组织水肿密切相关,增加可能是脑出血后早期引起血脑屏障开放、血管源性脑水肿形成的重要原因之一。在脑出血发生的过程中,脑出血使脑组织产生炎症反应,大量中性粒细胞浸润,激活的中性粒细胞释放大量的弹性蛋白酶,从而降解弹性蛋白、蛋白多糖和胶原,导致组织、细胞和血管基底膜的损伤,因此推测它们是引起微血管损伤的重要因素,甚至是各种原因引起微血管损伤最终的必由之路,是脑出血后继发性脑水肿形成的主要原因此外,弹性蛋白酶还可以促进中性粒细胞游走因子等的产生,引起中性粒细胞的的进一步迁移、聚集,如此导致重复性进行性恶性循环,加重脑组织的损伤。根据本实验结果我们认为含量的升高可能是后大鼠继发性脑损伤、脑水肿的主要原因之一,这一发现将为我们治疗脑出血开辟一新的途径。重庆医科大学硬士研究生学位论文第二部分西维来司钠对大鼠脑出血保护作用的实验研究西维来司钠是一种小分子中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂,能选择性地抑制弹性蛋白酶,主要用于急性肺损伤的治疗。近年国外有报道西维来司钠能够改善脑缺血/再灌注引起的脑水肿、脑损伤及炎症反应,也能改善脊索损伤引起的脑内的炎症反应、减少神经元损伤”。但西维来司钠对脑出血引起的脑组织损伤是否有保护作用,目前国内外尚未见相关报道。第一部分的实验结果显示,大鼠脑组织损伤与的增加密切相关。据此我们推测抑制剂西维来司钠可能对大鼠脑组织损伤有保护作用。本实验选用目前最常用、造模成功率较高的胶原酶诱导产生的脑出血模型,通过观察西维来司钠对大鼠行为学变化、脑含水量变化以及病理学改变的影响来评价其对大鼠是否有保护作用。材料和方法一、实验材料一实验动物健康大鼠,雄性,体重,由重庆医科大学动物中心提供。术前禁食,自由饮水。二主要试剂和药品胶原酶型美国公司水合氯醛苏卅正兴化工厂西维来司钠重庆医药工业研究院三主要仪器设备大鼠脑立体定位仪国营西北光学仪器厂微量注射器上海保西玻璃仪器厂重庆医科大学硬七研究生学位论文电子分析天平,显微镜日本酶标仪恒温干燥箱重庆实验仪器厂二、方法一实验动物分组动物随机分为五个组假手术组组生理盐水组/组/组/组。生理盐水、于造模前经尾静脉给药,缓慢注射,总量控制在/体重。二大鼠模型建立参照实验一的方法。观察指标神经病学评分动物造模后,各组均按照等口的神经缺损分级评分标准稍加改进进行神经功能缺损评分。标准见。表大鼠模型神经病学评分标准脑含水量测定各组动物造模后,经水合氯醛腹腔麻醉后,迅速断头取脑,将取出的脑重庆医科大学硬士研究生学位论文组织放在用生理盐水浸润过的滤纸上,以防止水分蒸发。去除软脑膜和血迹,以进针孔为中心,切取周围脑组织,精密称重精确到。取脑到称重完成时间控制在内。然后置于恒温烘箱,再称取干重。按公式计算脑含水量湿重一干重/湿重组织病理学观察每组随机取只大鼠于造模后以/水合氯醛腹腔麻醉后,剪开胸腔,暴露心脏,剥离心包膜,用手术钳钳夹腹主动脉,将号输液针头插入左心室,同时剪开右心耳。先快速注入生理盐水,后缓慢注入多聚甲醛/,实施内固定脑组织。然后迅速将大鼠断头取脑,切取含血肿的脑组织片约,立即放入的多聚甲醛液体中,固定后经乙醇剃度脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋,切片,染色,封片,光镜下观察病变区及附近脑组织病理改变。三、统计学处理各组测定值均用均数标准差表示,用统计软件作单因素方差分析,显著性水平。结果一、对大鼠神经病学评分的影响动物于造模后立即进行神经病学评分,由表可以看出假手术组神经病学评分均为分,模型组和治疗组动物均有不同程度神经功能缺损症状,神经病学评分均高于分,其中模型组的神经病学评分最高,而各治疗组神经病学评分均底于模型组,其中高剂量和中剂量与模型组相比差异有显著性或,而低剂量差别没有显著显著性意义。重庆医科大学硬士研究生学位论文表对大鼠脯出血后神经病学评分的影响,犯/由【西西。州【,二图对大鼠脑出血后神经病学评分的影响/,/蛐重庆医科大学硕士研究生学位论文二、对大鼠脑出血后脑组织含水量的影响结果如表所示,大鼠脑出血后其脑组织含水量明显升高,与假手术相比具有显著性意义,治疗组大剂量和中剂量大鼠脑组织含水量虽然也较高,但与模型组相比却有明显降低,差别也具有显著性意义,而低剂量于模型组相比差别没有显著性。表对失鼠脑出血后脑组织含水量的影响国/扣协,蝌一希一时事口卜昭跎叭为侣”伯佰弘图对大鼠脑出血后脑组织含水量的影响喀辅/,/重庆医科大学硕士研究生学位论文三、对大鼠脑出血病理形态的影响病理切片染色后在光镜下观察可见假手术组大鼠脑组织内没有出血灶,可见正常的神经细胞和胶质细胞,没有明显的炎症细胞浸润。大鼠可见明显的病理改变,有明显的出血灶,血肿周围出现软化带,组织疏松,血肿周围脑组织高度水肿,液化坏死,大量炎症细胞浸润,以分叶核的中性粒细胞为主,成群分布,神经元明显变性坏死,核结构模糊。西维来司钠治疗组大鼠脑组织病理改变与模型组相比有明显改善,水肿和炎症细胞浸润都不如模型组明显,神经细胞损伤与模型组相比也明显减轻。药物剂量越大,脑组织损伤改善越明显,里剂量依赖性。讨论西维来司钠是一种小分子中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂,能选择性地抑制弹性蛋白酶。目前主要用于治疗“非典”,引起的急性肺损伤。实验证明,西维来司钠不仅在体外能抑制弹性蛋白酶引起的肺血管内皮细胞对蛋白通透性的增加,而且静脉滴注能抑制弹性蛋白酶引起的大鼠的出血性肺损伤。在各种急性肺损伤模型中,预防性或治疗性静脉滴注西维来司钠均能够改善肺泡出血、蛋白渗出及肺血管通透性增加等病理改变。研究表明本品治疗作用机制可能包括直接抑制的释放,减少活化的中性粒细胞介导的肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的损伤降低肺血管内皮细胞的通透性,减少血栓调节素的释放,降低肺动脉压和肺的通透性抑制人单核细胞的致炎症细胞因子如、肿瘤坏死因子师一的产生抑制上皮层的黏液分泌抑制抗原诱导的气道微血管渗漏。除了治疗外,近年国外也有报道西维来司钠能够改善脑缺血/再灌注引起的脑水肿、脑损伤及炎症反应【。等人的研究也发现西维来司钠能改善脊索损伤引起的脑内的炎症反应、减少神经元损伤。通过第一部分的实验我们已经知道与大鼠脑出血有密切联系,与大鼠的继发性脑损伤有关,因此我们推测抑制剂西维来司钠对所致的脑组织损伤可能会有一定疗效重庆医科大学硕士研究生学位论文本实验通过神经病学评分发现大鼠有明显的神经功能缺损症状,其神经病学评分明显高于假手术组,而可以剂量依赖性地降低大鼠的神经病学评分,改善大鼠的神经功能缺损症状。这表明对大鼠的神经损伤有明显的保护作用。脑水肿是继发性脑损伤的主要并发症之一,通常随着的发生而迅速出现。动物实验研究发现,大鼠后数小时出现脑水肿,天达高峰,持续一周,两周内开始逐渐消散【】。脑水肿通常在的急性期和亚急性期形成,能进一步加剧神经元功能改变,影响疾病的预后和康复。近年来通过动物实验研究和临床观察已经阐明一些有关脑水肿形成的机理,并进行药物干预,取得一定的效果。等【人的实验发现能减轻缺/再灌注大鼠的脑组织损伤及脑水肿。本实验结果显示,能剂量依赖性地降低大鼠的脑含水量,这与前面的研究结果相似。说明可以通过减轻大鼠脑水肿来达到对脑组织的保护作用。病理切片常常能直观地反映出脑组织的病理变化情况。本实验研究发现治疗组大鼠脑组织病理改变与模型组相比水肿和炎症细胞浸润有明显改善,神经细胞损伤与模型组相比也明显减轻,这一结果更加直观地证明了对大鼠脑组织的保护作用。综上所述,本部分实验的结果表明,西维来司钠/和/对胶原酶所致的大鼠模型脑组织有明显的保护作用,能明显改善其神经功能缺损症状,减少炎症细胞浸润,减轻脑水肿及脑组织的病理改变。重庆医科大学顼士研究生学位论文第三部分西维来司钠对大鼠脑出血保护作用相关机制的实验研究从前面实验结果显示,西维来司钠对大鼠脑组织有明显的保护作用,我们推测其保护作用与其抑制的生成有关,但具体影响了此环节中的哪些相关因素或者还通过其它环节而达到其保护作用,尚有待迸步探讨。因此在本部分实验中,我们继续采用胶原酶诱导的模型,观察西维来司钠对大鼠脑组织中的表达,对活性及和含量的影响来探讨其对大鼠的保护作用机制。材料和方法一、实验材料一实验动物健康大鼠,雄性,体重,由重庆医科大学动物中心提供。术前禁食,自由饮水。主要试剂和药品胶原酶型美国公司苏州正兴化工厂水合氯醛重庆医药工业研究院西维来司钠试剂盒南京建成公司南京建成公司试剂盒北京中山公司抗体试剂盒南京建成公司三主要仪器设备大鼠脑立体定位仪国营西北光学仪器厂微量注射器上海保西玻璃仪器厂重庆医科大学颂士研究生学位论文电子分析天平超低温冰箱德国低温离心机电热恒温水浴箱重庆四达科仪紫外分光光度计上海光电免疫组化分析系统成都泰盟科技公司二、方法一实验动物分组同第二部分二大鼠模型建立参照第一部分的方法观察指标各实验组在造模后,经水合氯醛麻醉,快速断头处死,取脑,切取针孔周围脑组织,精密称重,置于一。保存。测定时将脑组织以生理盐水为匀浆介质,在冰浴环境中以玻璃匀浆器制成的匀浆,倒入“的离心管,取上清液测定,用于、及的测定。/,离心大鼠脑组织含量的测定方法同第一部分。大鼠脑组织含量的测定具体操作见试剂盒说明书,蛋白定量用双缩脲法。测定原理化学性质活泼,在体内代谢很快转为和,而又进一步转化成,本法利用硝酸还原酶特异性将还原为,通过显色深浅测定其浓度高低。含量气测定管的吸光度一空白管吸光度/标准管吸光度一空白管吸光度标准品浓度样本的蛋白含量大鼠脑组织含量的测定测定原理中性粒细胞中存在有髓过氧化物酶,每个细胞所含的酶的量是一定的,约占细胞干重的,该酶具有使过氧化氢还原的能力,利用这一特点可重庆医科大学硕士研究生学位论文以分析酶的活力,并定量测定中性粒细胞的数目。一复合物复合物供氢体一产物通过供氢体邻连茴香胺供氢后生成黄色化合物,在处通过比色测定产物的生成量,从而推算出的活力及减少的量和白细胞的数目。计算公式。单位,克湿片型重署詈刍要辜筹大鼠脑组织的表达各组动物随机选取只,于造模后以水合氯醛麻醉,剪开腹腔,暴露心脏,用手术钳钳夹腹主动脉,将号输液针头插入左心室,同时剪开右心耳。先注入生理盐水,后注入的多聚甲醛对脑组织进行内固定。然后迅速将大鼠断头取脑,切取含血肿的脑组织片约,立即放入的多聚甲醛中,固定后经乙醇剃度脱水,二甲苯透明,浸蜡,包埋,连续冠状切片。组织切片粘贴于经多聚赖氨酸处理过的载玻片上,待作免疫组化染色。具体操作步骤如下组织切片放入二甲苯中浸泡,更换二甲苯后再浸泡无水乙醇中浸泡乙醇中浸泡乙醇中浸泡蒸馏水冲洗三次去离子水孵育缓冲液浸泡次重庆医科大学顼研究生学位论文把切片放入枸橼酸钠缓冲液加热至左右次取出切片冷却至室温滴加试剂封闭用正常山羊血清工作液孵育,倾去,勿洗滴加适当比例稀释的一抗,过夜缓冲液浸泡次滴加试剂生物素标记山羊抗兔,孵育缓冲液浸泡次滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素工作液,孵育缓冲液浸泡次显色自来水充分冲洗脱水、透明、封片三、统计学处理各组测定值均用均数标准差表示,用统计软件作单因素方,显著性水平。差分析重庆医科大学硬士研究生学位论文结果一、对大鼠脑出血后脑组织含量的影响大鼠后其含量明显升高,与假手术组相比差别具有显著性意义,能够减少的含量,如表所示,治疗组大剂量和中剂量大鼠脑组织含量与模型组相比有所降低,差别也具有显著性意义。小剂量组含量与模型组相比没有显著性意义。表对大鼠脑出血后脑组织含量的影响抽钕钢/们拱撑觇瞄/,/蝴娜一【一州一图孓对大鼠脑出血后脑组织含量的彰响珊牌/,【重庆医科大学硕士研兜生学位论文二、对大鼠脑组织含量的影响大鼠后其脑组织内含量明显增加,与假手术相比有显著性意义,而能够减少大鼠脑组织内的含量,其中大中剂量组含量与模型组相比差别具有显著性意义,小剂量组含量与模型组相比没有显著性意义。见和表对大鼠脑出血后脑组织含量的影响,呦矧椭押恤/协舯,押/黼目蛐帆珏堋以/群槲曼董言三图协对大鼠脑出血后脑组织舍量的影响榔旧/,帆蛔扛“,咖岫删重庆医科大学硕士研究生学位论文四、对大鼠脑组织的表达的影响的表达,模型组大鼠脑组织内出现假手术组脑组织内几乎无的表达与模型组相比有的大量表达,大剂量和中剂量治疗组大鼠脑组织所降低,差别具有显著性或,小剂量组虽然也能降低的表达,但与模型组相比不具有统计学意义。表达的影响表对大鼠脑撑栅如缸/槲嵴如一一一兰衢历加垢对呈图对大鼠脑表达的影响槲群/,/重庆医科大学硬士研究生学位论文讨论过去认为出血性损伤主要是由于血肿占位效应,导致局部微血管床和远端结构的压迫伴随微量出血和中线移位,甚至产生脑疝。但无论是在临床研究,还是动物实验中,迅速清除血肿并不能改善脑出血的神经功能缺损,表明脑出血还存在比较严重的继发性损伤。因此探讨脑出血的继发性损伤机制,有可能为脑出血的治疗提供新途径。第一部分的实验已经证明与脑出血引起的脑损伤有关,大鼠脑组织含量明显增加第二部分试验从神经功能评分、脑含水量及病理学三方面肯定了抑制剂西维来司钠对脑出血大鼠的保护作用本部分实验继续探讨西维来司钠的脑保护作用机制。一、西维来司钠减少的生成是一种内源性蛋白酶,生理情况下位于中性粒细胞嗜苯胺蓝颗粒中,主要参与对杆菌的杀灭作用,同时它也参与中性粒细胞迁移,促迸炎症因子如、等的表达调节炎症反应,因此它对机体防御功能非常重要。但在炎症情况下,激活的中性粒细胞释放大量的弹性蛋白酶至细胞外,引起弹性蛋白、蛋白多糖和胶原等的降解,从而导致组织、细胞和血管基底膜损伤。国外的文献报道与大鼠脑缺血,再灌注引起的脑损伤有关,用西维来司钠治疗可以明显改善脑组织损伤,其作用机制可能与其减少的生成有关。通过第二部分的试验我们已经知道了西维来司钠对脑出血大鼠有保护作用,本部分试验结果显示抑制剂西维来司钠以剂量依赖性的方式降低大鼠的脑组织含量,与模型组比较有显著性意义口,这些研究结果表明西维来司钠对大鼠脑组织保护作用可能与其抑制的生成有关。二、西维来司钠抑制的表达、降低活性,核因子一是一种重要的细胞核转录调节因子,它广泛参与炎症反应、肿瘤细胞的增殖与凋亡及人类的多种疾病。目前,已经成为抗炎、抗肿瘤治疗的重要靶因子之一。目前发现在哺乳动物中家族共有个成员,包括,/,/。尽管在细胞质中组合有多种形式,但的主要形式是由个蛋白和个蛋,组成的异源二聚体,其中是其主要活重庆医科大学硕士研究生学位论文性成份。参与细胞信号转导,在许多细胞中,与其抑制蛋白结合处于失活状态,存在于胞浆中。当细胞受到某些特定的因素刺激而被刺激激活后,被磷酸化、泛素化,随后降解,释放,后者易位细胞核,与胞核内某些基因增强子的“黜叮”序列结合,诱导依赖的基因转录,如编码,家族如一,等及等前炎症细胞因子的基因,这些细胞因子又会促进基因的表达,形成正反馈环路,从而参与外科感染、休克、自身免疫性疾病等的病理过程。近年的研究显示的活化与神经损伤密切相关。等利用脑冲击伤的大鼠脑损伤模型观察在大鼠脑皮质内的水平,发现大脑皮质受伤区域均有增加,显示脑外伤后即可以出现活化。等采用流体打击装置复制了大鼠脑损伤模型,结果发现损伤早期在轴突被激活,在神经元的细胞质及细胞核内以及受伤皮质的小胶质细胞/巨噬细胞及星形胶质细胞内被激活,激活的在创伤后也会出现在脑血管内皮细胞内。脑出血时,除脑组织本身产生的炎性介质外,血肿释放的大量炎性介质如肿瘤坏死因子、自介素等进入脑组织,这些都是激活的最重要的诱导因子,从而诱导表达上调和的表达不仅诱导的激活,而且由活化对其进行转录调控。活化后可增强和基因的转录,后者水平升高又更加促进的活化,形成正反馈。而的活化可以产生以下效应诱导粘附分子、的表达增加,通过与淋巴细胞功能相关抗原相互作用介导白细胞与血管内皮细胞的黏附,进而贴壁、滚动,嵌塞微血管,损伤内皮细胞并游出到周围组织,从而引起脑组织内大量炎症细胞浸润。等研究也表明凝血酶通过激活途径诱导的表达,可以促进白细胞的黏附】诱生和激活,导致其活性大大增加,合成大量的,成为组织损伤的重要因素诱导细胞因子、一、等的表达,加重炎症反应。髓过氧化物酶存在于中性粒细胞中,约占细胞于重的,该酶具有使过氧化氢还原的能力,因此通过分析活性可已反映中性粒细胞的数目的多少即炎症细胞浸润情况。炎症细胞的浸润与细胞因子的介导有关。本研究发现脑出血后血肿周围组织表达增加、活性明显增加,这两者之间存重庆医科大学顿研究生学位论文在紧密联系。结合前人的实验研究结果我们可以推测大鼠脑内活性的增加是由于表达增强,引起表达增加,从而导致大量炎症细胞浸润。使用可以剂量依赖性地降低表达、活性,与模型组比较有显著性意义或。由以上我们可以得出两者之间的关系西维来司钠对大鼠脑组织的保护作用可能与其减少的表达,从而抑制表达,减少炎症细胞的浸润表现为的活性降低有关。三、西维来司钠减少的生成在体内是由左型精氨酸通过一氧化氮合酶催化,与分子氧反应生成的,现已知的产生除内皮细胞外,神经和胶质细胞亦可产生。研究发现除了具有舒张血管的作用外,还具有抑制血小板聚集与黏附【】,介导兴奋性氨基酸及与超氧基团发生