【doc】整合素β3亚单位胞内区在骨桥蛋白诱导血管平滑肌细胞黏附和迁移中的作用

整合素3亚单位胞内区在骨桥蛋白诱导血管平滑肌细胞黏附和迁移中的作用ISSNL0077626CN113870/Q中国生物化学与分子生物CHINESEJOURNALOFBIOCHEMISTRYANDMOLECULARBIOL2006年1月221916整合素IL3亚单位胞内区在骨桥蛋白诱导血管平滑肌细胞黏附和迁移中的作用李菁菁,温进坤,韩梅,陈英珠河北医科大学基础医学研究所,河北省医学生物技术重点实验室,石家庄050017摘要为阐明整合素G3亚单位胞内区及其不同保守序列在骨桥蛋白OPN诱导血管平滑肌细胞VSMC黏附和迁移中所起的作用,构建了整合素3亚单位胞内区肽段真核表达载体PEGFPC3133CD,并人工合成了含有P3亚单位胞内区不同保守序列NXXY的寡肽肽747和肽759,通过导入VSMC,观察它们对OPN诱导VSMC黏附和迁移的影响结果显示,整合素G3胞内区在VSMC中强制性表达可使细胞在OPN上的黏附和迁移明显下降分别为对照组的343和317导入肽747,肽759和肽747肽一759均可显着抑制VSMC的黏附和迁移,其中肽747肽759的作用更强分别为对照组的364和31,1免疫荧光结果显示,在转染PEGFPC3G3CD或肽747肽759的VSMC中,黏着斑蛋白的磷酸化水平降低,黏着斑形成明显减少研究结果表明,整合素G3亚单位胞内区及其NXXY保守序列在黏着斑相关蛋白募集,黏着斑形成及VSMC黏附和迁移方面发挥重要作用关键词整合素3亚单位胞内区寡肽黏附迁移黏着斑中图分类号Q256ROLEOFCYTOPLASMICDOMAINOFINTEGRINP3SUBUNITINREGULATINGADHENSIONANDMIGRATIONOFVASCULARSMOOTHMUSCLECELLSINDUCEDBYOSTEOPONTINLIJINGJING,WENJINKUN,HANMEI,CHENYINGZHUHEBEILABORATORYOFMEDALBIOTECHNOLOGY,NSTEOFBASICMEDICI,HEBEIMEDICALUNIVERSITY,SHIIAZHUANG050017,CHINAABSTRACTTOINVESTIGATETHEEFFECTOFCYTOPLASMICDOMAINOFTHEINTEGRIN83SUBUNITANDITSCONSERVEDNXXYMOTIFONTHEADHENSIONANDMIGRATIONOFVASCULARSMOOTHMUSCLECELLSVSMCSINDUCEDBYOSTEOPONTINOPN,THEEUKARYOTICEXPRESSIONVECTOR,PEG一C3一G3ID,HARBORINGTHECYTOPLASMICDOMAINOFHUMANINTEGRING3SUBUNITCDNAWASCONSTRUCTEDANDTHEPEPTIDE747ANDPEPTIDE759INCLUDINGTHENXYMOTIFWERESYNTHESIZEDTHEREAFTERTHEYWERETRANSFECTEDINTOVSMCS,THERESULTSSHOWEDTHATCOMPAREDWITHCONTROL,THEADHENSIONANDMIGRATIONOFVSMCSINDUCEDBYOPNWEREOBVIOUSLYDECREASEDTO343AND317,RESPECTIVELY,WHENTHECYTOPLASMICDOMAINOFINTEGRING3WASOVEREXPRESSEDINTHESECELLSANDTHESETWOACTIVITIESOFVSMCSWEREALSOINHIBITEDBYTRANSFECTIONOFPEPTIDE747,PEPTIDE759ESPECIALLVCOTRANSFECTIONOFPEPTIDE一747PEPTIDE一759MARKEDLYDOWNREGULATEDTHEADHESIONANDMIGRATIONOFVSMCTO364AND311,RESPECTIVELY,COMPAREDWITHCONTRO1IMMUNOFLUORESCENCEREVEALEDLOWERDHOSPHORYLATION收稿13期20050407,接收13期20050621国家自然科学基金NO90208014和NO30270499,河北省自然科学基金NO303455和高等学校博士学科点专项科研基金NO20040089018资助项目联系人L031186265563EMAILWJKHEBMUEDUCARECEIVEDAPRIL7,2005ACCEPTEDJUNE21,2005SUPPOAEDBYNATIONALNATURALSCIENCEFOUNDATIONOFCHINANO90208014ANDNO30270499,NATURALSCIENCEFOUNDATIONOFHEBEIPROVINCENO303455ANDSPECIALIZEDRESEARCHFUNDFORTHEDOCTORALPROAMOFHIGHEREDUCATIONNO20040089018CORRESPONDINGAUTHORTEL031186265563,EMAILWJKHEBMUEDUCAL0中国生物化学与分子生物22卷OFFOCALADHENSIONPROTEINSANDFEWERNUMBEROFFOCALADHENSIONINVSMCSTRANSFECTEDBYPEGFPC33CDORPEPTIDE一747PEPTIDE759COMPARINGWITHCONTRO1THESERESULTSSUGGESTTHATTHECYTOPLASMICDOMAINOFINTEGRIN3SUBUNITCOULDPLAYAKEYROLEINTHERECRUITMENTOFFOCALADHENSIONRELATEDPROTEIN,THENTHEFORMATIONOFFOCALADHENSIONANDTHEADHENSIONANDMIGRATIONOFVSMCSTHROUGHTHECONSERVEDNXXYMOTIFKEYWORDSCYTOPLASMICDOMAINOFINTEGRIN3SUBUNITOLIGOPEPTIDEADHENSIONMIGRATIONFOCALADHENSION血管平滑肌细胞VASCULARSMOOTHMUSCLECELL,VSMC的黏附,增殖与迁移是高血压,动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等血管重塑性疾病的细胞病理学基础近年研究表明,多种生长因子和细胞外基质EXTRACELLULARMATRIX,ECM成分如骨桥蛋白OSTEOPONTIN,OPN,纤连蛋白等均参与VSMC黏附,增殖与迁移的调节过程“整合素INTEGRIN作为ECM蛋白的受体不仅介导细胞与ECM之间的相互作用,而且还具有双向信号转导功能业已证明,整合素是由A和亚单位组成的异源二聚体跨膜受体,目前已发现17种不同的A亚单位和8种不同的B亚单位,它们可组合成24种不同的整合素,VSMC主要表达整合素AVB3我室以往的研究表明,VSMC受到OPN刺激时,整合素B3亚单位胞内区通过与细胞骨架蛋白形成黏着斑而募集FAK,SRC等酪氨酸激酶以及其它信号分子,由此构成整合素介导信号转导的结构基础为了进一步揭示整合素B3亚单位胞内区及其不同的保守序列在介导细胞黏附和迁移中的功能,本文构建了整合素B3亚单位胞内区肽段真核表达载体PEGFPC3一B3CD,并人工合成了含有3胞内区不同保守序列的寡肽,通过导入VSMC,观察B3亚单位胞内区及其不同区段在OPN诱导VSMC黏附和迁移功能中所起的作用1材料和方法11材料111质粒和菌株携带整合素B3亚单位CDNA的重组质粒PCDNA3INTEGRIN133由美国SCOTTDBLYSTONE博士惠赠,真核表达载体PEGFPC2,DEGFPC3及JM109菌株由本室保存112主要试剂各种工具酶,DNA回收试剂盒,质粒提取试剂盒购自PROMEGA公司脂质体ESCORT1V细胞转染试剂盒购自SIGMA公司PROJECT蛋白导入试剂盒购自PIERCE公司M199培养基购自GIBCO公司羊抗人整合素B3胞内区单抗,鼠抗酪氨酸磷酸化单抗PY一99和化学发光试剂盒购自SANTACRUZ公司绿色荧光蛋白GREENFLUORESCENTPROTEIN,GFP及其抗体,OPN由本室制备12方法121整合素B3亚单位胞内区真核表达载体的构建参照GENBANK公布的人整合素3亚单位胞内区CDNA序列,设计扩增3亚单位胞内区CDNA22582380BD的引物上游引物序列为5TCAAGCTIACCATCCACGACCGAAAAGAA3下游为5TCC1GCAGTNAG1GCCCCGGTACG1GATA3上,下游引物5端分别引入HINDIII和FI酶切位点以PCDNA3一INTEGRINB3为模板,按常规方法对整合素B3亚单位胞内区CDNA进行扩增扩增产物经HIND和FI酶切后插入真核表达载体PEGFPC3,构建成PEGFPC3B3CD重组体对重组质粒进行扩增和纯化后,送上海生工公司测序122细胞培养及重组质粒转染取5周龄SD大鼠胸腹主动脉,按贴块法分离培养VSMC,025胰蛋白酶消化传代,取36代细胞进行实验传代培养的VSMC生长到5060汇合时,应用ESCORTIV脂质体转染试剂质粒与脂质体的比例为16,将PEGFPC3一B3CD转染VSMC,用荧光显微镜和WESTERN印迹对表达产物GFP一33CD进行检测,以PEGFPC2转染VSMC作为空白对照123寡肽导入含整合素B3亚单位胞内区保守序列NXXY的9肽NANNPLYKEATMC肽一747和NTNITY7RGT762_C肽一759由美国GENEMED公司合成传代培养的VSMC生长到5060汇合时,用PROJECT蛋白导入试剂分别将不同浓度的肽一747,肽一759和两种肽的混合物肽一747肽759导入VSMC,导入后4H进行黏附和迁移分析同时以与肽一747和肽一759结构无关的13肽NGRGDSVVYGLRSKC为对照,检查两个寡肽的特异性,以PROJECTFITC一抗体为阳性对照,检查导入效率124黏附实验将转染PEGFPC3133CD,PEGFPC2,以及导入肽一759,肽一747,肽一747肽759和13肽的VSMC用胰第1期李菁菁等整合素P3亚单位胞内区在骨桥蛋白诱导血管平滑肌细胞黏附和迁移中的作用11酶消化后,离心收集细胞将细胞重悬于含1NCS的培养基中,调整细胞浓度为5104个/ML后,接种于用20MG/LOPN包被的96孔板,50L/孔,每组5孔,37温育2H,PBS冲洗3遍后,依次用4多聚甲醛固定10MIN,05甲苯胺蓝染色15MIN,经1SDS裂解细胞后,595NM测吸光度值125跨膜迁移实验用改良的BOYDEN小室进行,ISOPORETM滤膜孔径为8IL1将被转染的VSMC分别以105个/孔接种于上层小室,下室加入20MG/LOPN,培养24H后,取出滤膜用棉拭子擦掉正面的细胞,膜用甲醇固定10MIN,苏木精染色,高倍100显微镜下随机计数5个视野中的细胞数,实验重复3次126免疫荧光观察黏着斑的形成生长在玻片上的被转染VSMC,经4多聚甲醛室温固定30MIN,1TRITONX100抗原修复15ITIIN,山羊血清室温封闭10MIN,依次与抗酪氨酸磷酸化抗体125,FITC标记二抗1200进行结合反应,各步骤间均用PBS充分漂洗,80甘油封片,于LEICA激光共聚焦显微镜下观察细胞内被荧光标记的颗粒127统计学处理实验数据用均数标准差表示,采用SPSS100统计分析软件进行组间及组内方差分析2结果21整合素亚单位胞内区表达载体的构建及其在VSMC中的表达测序结果表明,重组质粒PEGFPC3P3CD中插入的亚单位胞内区CDNA片段的长度为123BP,核苷酸序列与人整合素B3亚单位胞内区CDNA22582380BP相一致FIG1ATCAAGCTTACCATCCZZSSACGACCGAAAAGUATTCGCTAAATTTGAGGUAGUACGCGCCAGAGCAAAATG鱼坠鱼丛丛盟丛坠垒鱼鱼TTAACTGCAGTCGAB60708090100110120130TCAGCTTCCATCCCGCCGAAGATTCGCTAATTTGGGAGACGCGCCAGAGCATGGGCACAGCCAAL40150L60L70180L90200210CACCCACTGTITAAGAGGCCCGTCTCCTTCACCAATATCACGTACC0GGGCACTTACTGCAGTCGACGGTACCG6F曜1SEQUENCEANALYSISOFTHEPEGFPC3CDPLASMIDATHESEQUENCEOFPEGFPC3一CDBTHECHROMATOGRAMOFSEQUENCEOFPEGFPC3一B3CD转染PEGFPC3CD质粒24H后,荧光显微镜下可见VSMC胞内有弥散分布的绿色荧光,由于所表达的亚单位缺乏跨膜区而未能定位于胞膜上FIG2A,见14页彩版转染PEGFPC2的VSMC内也可产生绿色荧光FIG2BWESTERN印迹分析结果显示,用抗整合素胞内区单抗可在转染PEGFPC3CD的VSMC中检出分子量为32KD的清晰条带,转染24H时,其表达达到高峰FIG3A在转染PEGFPC2的细胞中未检测出阳性条带用抗GFP抗体进行检测时,转染PEGFPC2的细胞中有GFP蛋白的表达27KD,而在转染PEGFPC383CD的细胞,其阳性条带的位置稍滞后约32KD,说明表达产物为GFPB3CD融合蛋白FIG3B第1期李菁菁等整合素亚单位胞内区在骨桥蛋白诱导血管平滑肌细胞黏附和迁移中的作用13A759747FIG7EFFECTOFPEPFIDE747ANDPEPTIDE759ONVSMCADHESIONAANDMIATIONB150MOL/L2100MOL/L3200MOL/L4500MOL/LVALUESAL“EISOFFIVETHREEEXPERIMENTSPO05,COMPAREDWITLLCONTROLBFIG8EFFECTOFPEPTIDE747ANDPEPTIDE759COTRANSFECTIONONVSMCADHESIONAANDMIGRATIONBA1CONTROL213PEPTIDE100TMOL/L3PEPTIDE一759100MOL/L4PEPTIDE一747100TANOL/L5PEPTIDE一759PEPTIDE一747100/NNOL/LB1CONTROL213PEPTIDE200/MOL/L3PEPTIDE一759200BORNOL/L4PEPTIDE747200/ANOL/L5PEPTLDE759PEDE一747200LAMOL/LVALUESARE哥SOFFIVETHREEEXPERIMENTSP005COMPAREDWITHCONTROLVSMC黏附和迁移的抑制作用是特异的,且2个序列的共同作用强于其中任何一个的单独作用24整合素亚单位胞内区和肽747,肽759对黏着斑形成的影响整合素被ECM蛋白活化后发生聚集,并募集多种不同蛋白质分子形成黏着斑黏着斑一般沿胞膜内侧分布,在信号转导及细胞形态调节方面行使重要职能如FIG9所示,未经OPN处理的VSMC用抗酪氨酸磷酸化抗体进行免疫荧光染色后,胞质内出现散在点状分布的细小荧光颗粒用OPN处理细胞24H后,荧光颗粒变粗大,且在胞膜内侧形成黏着斑的轮廓在被PEGFPC3B3CD转染的VSMC内,黏着斑形成明显减少,胞质内荧光颗粒减少,荧光强度变弱肽747和肽759共同导入也明显影响黏着斑的形成,但转染PEGFPC2对黏着斑形成和胞质内的荧光颗粒不产生明显的影响3讨论整合素介导的细胞黏附和迁移是血管重塑的关键内容之一OPN,纤连蛋白,层黏连蛋白,玻连蛋白等ECM蛋白作为整合素的配体,通过与VSMC胞膜上的整合素受体结合而引起整合素局部募集,由于整合素本身不具有激酶活性,它需要通过B亚单位的胞内区与下游的接头蛋白如TALINJ,PAXILLIN,P1OIJ,PO甍岛一GU32O0OO一毛U日蔫一蚰OPI,P葛岛一GI10U432OOOOOSL1OQ口G0一I,P1TIR1DTRFINURCILLL2II,F_LR1R,一CI,】F【1FII,LLIC【IIIJA1INRR川NEMCIENLYIOFPTIDFI_LL,EIMII_JII【YLRR【II,J【L_IAIIB第1期李菁菁等整合素亚单位胞内区在骨桥蛋白诱导血管平滑肌细胞黏附和迁移中的作用15FAK和整合素连接激酶INTEGRINLINKEDKINASE,ILK等相互作用,使其募集到胞膜内侧,共同形成黏着斑复合物,并启动多条信号转导途径,从而导致细胞骨架重组引,引起VSMC的黏附和迁移以往采用删除整合素B3亚单位胞内区的方法证实该亚单位胞内区对整合素的功能至关重要本文构建整合素亚单位胞内区的表达载体,通过使其在VSMC中过表达来竞争性抑制内源性B3胞内区的功能,进一步研究其在ECM蛋白诱导VSMC黏附和迁移中所起的作用通过细胞黏附和迁移分析发现,整合素B3亚单位胞内区过表达可以特异性地抑制VSMC的黏附和迁移分别为对照组的343和317我们推测,过量表达的整合素B3胞内区多肽可以竞争性地与参与黏着斑形成的下游信号蛋白相结合,但因其没有胞外区而不能接受配体的信号刺激,从而干扰了整合素介导的细胞黏附和迁移过程整合素胞内区由41个氨基酸残基所组成,在其结构中含有两个在不同B亚单位中均存在的高度保守的NXXY序列为进一步研究这两个保守序列在调节细胞黏附和迁移中的作用,我们用含保守序列NXXY的两种寡肽,即肽一747和肽一759导人VSMC,观察其对细胞黏附和迁移的影响实验结果表明,肽一747和肽一759都可以显着抑制VSMC的黏附和迁移,且具有剂量依赖性,当寡肽的浓度为100TLMOL/L时,对VSMC在OPN上的黏附作用抑制最明显分别下降了591和522,当寡肽的浓度为200TMOL/L时,对VSMC的迁移抑制最明显分别下降了661和548BOETTIGER等报道,配体对整合素的活化依赖于83亚单位Y的磷酸化和Y与细胞内相关蛋白的相互作用我们发现,虽然肽747和肽759都可抑制VSMC黏附,但前者的抑制作用更明显,这可能与YJ7的磷酸化位于Y7辨与细胞内蛋白相互作用的上游,肽747通过结合下游激酶,干扰了激酶对内源性Y的磷酸化有关而肽759只是干扰Y与细胞内蛋白的相互作用,所以抑制作用低于肽747另外,同时导人肽747和肽759对细胞黏附和迁移具有更显着的抑制作用,说明两个保守序列在细胞黏附和迁移中都发挥一定的功能,且具有协同作用通过与转染PEGFPC3G3CD的VSMC比较,发现两个寡肽共同作用的结果与完整P3胞内区基本一致,提示整合素3胞内区对VSMC黏附和迁移功能的调节主要是通过两个NXXY序列而实现的本文还观察了整合素B3胞内区过表达以及肽一747肽一759共导人对黏着斑形成的影响黏着斑复合物连接ECM一整合素一细胞骨架蛋白,介导细胞与细胞及细胞与ECM的黏附,维持细胞形态,调节细胞黏附,迁移,吞噬等功能用抗酪氨酸磷酸化抗体进行免疫荧光分析的结果显示,在OPN诱导下,VSMC中黏着斑蛋白磷酸化水平升高,黏着斑数量增多导人外源性整合素B3胞内区蛋白后,细胞内阳性染色颗粒的数量和黏着斑形成明显减少肽一747和肽一759共同导人也同样影响黏着斑蛋白的磷酸化和黏着斑形成由此提示,整合素P3胞内区通过影响黏着斑相关蛋白向胞膜下的募集及干扰黏着斑形成,而起到抑制VSMC黏附和迁移的作用该研究为开发抑制VSMC黏附和迁移的抗血管重塑药物奠定了实验基础参考文献REFERENCES1LIGH,CHENYF,STAEEYSK,OPARILS,THOMPSONJAESTROGENATTENUATESINTEGRIN83DEPENDENTADVENFITIALFIBROBLASTMIGRATIONAFTERINHIBITIONOFOSTENPONTINPRODUCTIONINVASCULARSMOOTHMUSCLECEL1CIRCULATION2000,101294929552XUQJ,YAHB,LISH,DUANCMFIBRONECTINBINDSINSULIN1IKEGROWTHFACTORBINDINGPROTEIN5ANDABOLISHESITSLIGANDDEPENDENTACTIONONCELLMIGRATIONJBIOLCHEM,2004,2796426942773马进整合素的研究进展上海第二医科大MAJINPROGRESSOFINTEGRINRESEARCHACADJRGSECONDMEDUNIV,2004,24111134刘智敏,韩酶,温进坤细胞外基质促血管平滑肌细胞迁移及83整合素和黏着斑激酶表达中国病理生理杂志IJUZHIMIN,HANMEI,WENJINKUNTHERELATIONSHIPBETWEENEXPRESSIONOF83INTEGRIN,FOCALADHESIONKINASEANDMIGRATIONOFVASCULARSMOOTHMUSCLECELLSSTIMULATEDBYEXTRACELLULARMATRIXCHINJPATHOVHYIOT,2003,1921631665WENJK,HANM,ZHENGB,YANSLCOMPARISONOFGENEEXPRESSIONPATTERNSANDMIGRATIONCAPABILITYATQUIESCENTANDPROLIFERATINGVASCULARSMOOTHMUSCLECEILSTIMULATEDBYCYTOKINEL/FESCI,2002,7077998O76柴锡庆,郑斌,韩梅,杨淑丽,温进坤骨桥蛋白的制备及功能研究中国老年学杂志CHALXIQING,ZHENGBIN,HANMEIYANGSHULI,WENJINKUNPREPARATIONANDCHARACTERIZATIONOFOSTENPONTINCHINJGERONT,2004,2487257277DATTAA,HUBERF,BOCTFIGERDPHOSPHORYLATIONOFBETA3INTEGRINCONTROLSLIGANDBINDINGSTTHJBIOLCHEM,2002,2776394339498ULMERTS,CALDCCMOEDDA,GINSBERGMHCAMPBELLIDDOMAINSPECIFICINTERACTIONSOFTALLNWITHTHEMEMBRANEPROXIMALREGIONOFTHEINTEGRINBETA3SUBUNITBIOCHEMISTRY,2003,4227830783129YOGANNTHANTN,COSTEILOP,CHELAXY,JABALIM,YANJ,LENNGD,ZHANGZH,YEEA,DEDHARS,SANERAJIMEGRINLINKEDKINASEILKA“HOT“THERAPEUTICTARGETBIOEHEMPHARMAEOL,200060816中国生物化学与分子生物22卷中国生物化学与分子生物第五届编辑委员会名单THEFIFTHEDITORIALBOARDOFCHINESEJOURNALOFBIOCH