pcr技术在[生物工程] 寄生虫学研究上的应用概述

1PCR技术在寄生虫学研究上的应用概述【摘要】近年来，越来越多的分子生物学技术应用到寄生虫学与寄生虫病学研究领域，PCR技术因其敏感性高、特异性强等优点得到了广泛应用。目前，寄生虫病在我国有逐渐流行的趋势，分子生物学的发展及其在寄生虫学上的应用无疑对寄生虫病的诊断、防制起到十分重要的作用，本文就PCR技术的最新研究进展及其在寄生虫学方面的应用作一介绍。【关键词】PCR技术；寄生虫；分子生物学技术PCRTECHNOLOGYINPARASITOLOGYYANCHAO,ZHAOGUANGHUI,ZHUXINGQUANCOLLEGEOFVETERINARYMEDICINE,SOUTHCHINAAGRICULTURALUNIVERSITY,GUANGZHOU510642【ABSTRACT】INRECENTYEARS,MOREANDMOREMOLECULARBIOLOGICALTECHNOLOGIESHAVEBEENAPPLIEDTOTHEFIELDOFPARASITOLOGYINPARTICULAR,POLYMERASECHAINREACTIONPCRCOUPLEDAPPROACHESHAVEFOUNDBROADAPPLICABILITYBECAUSEOFTHEIRHIGHSENSITIVITYANDSPECIFICITYANDINRECENTYEARS,PARASITICDISEASESHAVEBECOMEMOREPANDEMICANDSERIOUS,HOWEVER,MOLECULARBIOLOGICALTECHNOLOGIESCANPLAYANIMPORTANTROLEINTHEDIAGNOSIS,PREVENTIONANDCONTROLOFPARASITICDISEASESOFHUMANANDANIMALSTHEPRESENTARTICLEBRIEFLYREVIEWSSOMEDEVELOPMENTSANDAPPLICATIONSOFTHEPCRTECHNOLOGYINPARASITOLOGY【KEYWORDS】PCRTECHNOLOGY；PARASITE；MOLECULARBIOLOGICALTECHNOLOGY近年来，寄生虫病流行日趋猖獗，严重威胁人类健康，也给畜牧业发展带来了巨大损失。寄生虫病的流行促使人们寻找新的、快速准确的工具进行诊断防制。自1985年KERRYMULLS创立DNA聚合酶链式G2465应G708POLYMERASECHAINREACTION，PCRG709技术G1209来，G4439G5062G6116G1038分子生物学领域最G5132用的方G8873G1055一。PCR技术G7171一G20045G1319G3818G3534因快速G6205G3698技术，G11013G1122其特异性G3921、G9801敏G5242高等优点，G5062G17817速G13792广泛G3332应用G1122寄生虫学与寄生虫病学研究领域。特G2047G7171近G1972年来，G19555G11540分子生物学技术的G993断发展，新PCR技术G993断G9056G10628，G13792G7099PCR技术也在G993断G6925G14403，G17837G1038寄生虫病的诊断、防制G6564G1391了有G2159工具。G18504G1122G8504，G12520G13785对近G1972年来G1209PCR技术G1038G3534G11796的分子生物学G7828G8991G2656G18504G4462方G8873在寄生虫学上的应用G1582一G13520G17860。G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G66G6621分子遗传标记广G1053的分子G17963G1268G7643G16772G7171G6363G2499G17963G1268G5194G2499G7828G8991的DNAG5219G2027G6122G15519G11345G17148。G10433G1053的分子G17963G1268G7643G16772G7171G6363G14033G2465G7156生物G1022G1319G6122G12193G13688G19400G3534因G13464G1025G7588G12193G5058异的特异性DNAG10267G8585。G19555G11540分子G17963G1268G7643G16772的G993断发展，G7692G12970G1319DNAG708RDNAG12的G1881G17728G5417G19400G19560G2318G11INTERNALTRANSCRIBEDSPACER，ITSG12、G13459G12902G1319DNAG11MTDNAG12G2656G2499G2476G6980G18339G12628G2345重G3809G5219G2027G708VARIABLENUMBERTANDEMREPEATS，VNTRG709等G17963G1268G7643G16772G1038寄生虫学G4490进行寄生虫G12193G4658G18504G4462、G13007G13491发G13958与进G2282研究、G17963G1268多G7691性分G7524、分子分类G1047G14279G1122其G6251G14659性等G6564G1391了G10714G5831G7643G16772。11核糖体DNAG11507G7692生物的G85DNAG7171一G1022G11013G16780多重G3809G5219G2027G11G17902G5132G6980G11346G12G1030G13864G13464G6116的G5234大的多G3534因G4490G7075，G17902G5132G6116G3254G10378聚G19610在特异性G7591G14406G1319G1025。RDNAG17902G5132G7171G11013G13546G11733小亚G3534RRNAG3534因G11如18SG12G2656大亚G3534G85RNAG3534因G11如28SG12的G3534因G1030G13864G13792G6116，两G1022大小亚G3534G1055G19400存在G19400G19560G2318G5219G2027，G4439包括两G1022G1881部G17728G5417G19400G19560G2318G11ITS1G2656ITS2G12G265658SRRNAG3534因。G11013G1122ITSG2318G993加入G6116熟G7692G12970G1319，所G1209受到的选择压G2159较小，进G2282速率较快，加G1055G3534因G17902过G993等价交换G11UNEQUALCROSSINGOVERG12G2656G3534因G17728G2476G11GENECONVERSIONG12等方式G13792经历快速的协同演G2282G11CONCERTEDEVOLUTIONG12A1A0A2A3A4，从G13792导致了重G3809G2345位在G993同G3534因G13464G1025的一致性，即具有高G5242保守性。ZHU等A1A5A4运用PCRSSCP技术分G2047对欧洲源G2656G1025国源的异尖G13459虫G85DNA的ITS1及ITS2进行了G18504G4462，结果证明了RDNA的ITSG7171一G12193G10714G5831的分子G17963G1268G7643G16772，G14033够有效G2318分G18504G2047G993同G12193G4658及来源的异尖G13459虫。PRASAD等A1A6A4运用PCR技术对布氏姜G10267吸虫RDNA的ITSG2318域G5219G2027进行了G8991G5219分G7524，发G10628其虫卵G2656G6116虫G85DNA的ITSG5219G2027在其G13464G6116G2656长G5242上没有G5058异，表明布氏姜G10267吸虫的G85DNA的ITSG5219G2027及其G13464G6116G993因其发G13958阶G8585G993同G13792存在G5058异，具有高G5242保守性，进一步证明了G85DNA的ITSG2318域G7171一G12193有效的分子G17963G1268G7643G16772。12线粒体DNAG11013G1122G13459G12902G1319DNA的G17963G1268方式G1038母G13007G17963G1268，其G3534因G13464的G7588些G2318域如细胞G14406素C氧G2282酶3G1022亚G3534的G13546G11733G3534因COX1，COX2，COX3，NADH氧G2282还原酶7G1022亚G3534的G3534因NAD1，NAD2，NAD3，NAD4，NAD4L，NAD5，NAD6G2656ATP酶2G1022亚G3534的G13546G11733G3534因ATPASE6，ATPASE8的G5219G2027G2656G13464G6116具有高G5242保守性，加G1055取材方便、无G13464织特异性等优点，被人们广泛用G1582分子G17963G1268G7643G16772的对象。GONZLEZ等A7A8A9G17902过对西班牙G993同宿主G1319G1881的52株细G12902棘球绦虫的NAD1G2656COX1进行PCRG6205G3698G2656G8991G5219，结果进一步证实了G1783752株细G12902棘球绦虫G1025存在两G12193G3534因型G1SHEEPDOGSTRAING12G2656G7G11PIGDOGSTRAING12，与G1055前运用PCRRFLP得到的结果一致，从G13792证实了PCRRFLPG8873G7171一G12193G18504G4462G2656G2318分细G12902棘球绦虫G3534因型的有效方G8873。RODRGUEZ等A7A10A9用ITSG2656NAD4G1582分子G17963G1268G7643G16772，证实了淡黄蚋存在四G1022G993同NAD4的等位G35343因，同时ITSG2318域G3534因G5219G2027在G12193G1881及G12193G19400存在G5058异。13可变数量简单重复序列VNTR主要包括小卫星DNAG2656微卫星DNA。小卫星DNAG7171一些G11013G6980十G1022到G6980G11346G1022碱G3534对G13464G6116的G1030G13864重G3809G5219G2027，其G6980目因G1022G1319的G993同G13792有所G5058异，因G8504运用一G4462的方G8873G708如RFLPG709将其G5058异性表G10628出来，则表G10628出G1022G1319G6122G12193G4658的多态性。微卫星DNA又称G12628G2345重G3809G5219G2027G708SINGLESEQUENCEREPEAT，SSRG12，与小卫星DNA类似，也G14033够产生多态性，其产生多态性的机制被认G1038G7171DNAG3809制过程G1025产生了链滑动G6122DNAG3809制G2656修G3809时发生了错配，从G13792导致一G1022G6122G1972G1022重G3809G2345位的插入G6122缺失等A7A11A9。2以PCR为基础的分子遗传标记技术在寄生虫分子鉴定上的应用21随机扩增多态性DNARANDOMAMPLIFIEDPOLYMORPHICDNA，PCRRAPDRAPD是WILLIAMS和WELSH于1990年同时报道的一种以PCR为基础的基因分析方法。与G7643准PCRG993同，RAPD的引物G7171根据模板DNA最同源的部位G19555机设计的，对G3534因G13464DNAG6205G3698，经琼脂凝胶电泳G6122聚丙G9923G18244G14030凝胶电泳分G12175，在G7591G14406G6122G6930G4568自G7186G5445技术G7477G1226G991G7186G12046多态性G10267G8585，G16825G10267G8585多态性则G2465G7156了G16825G10267G8585G3534因G13464的多态性。与G5132G16280PCRG11468G8616，RAPD具有G12628便、快速，G6116本G1314，G2494G19668微G18339DNA即G2499进行G6205G3698等优点，G2499对G6984G1022G3534因G13464DNA进行多态性分G7524，G1817分G6593G12046G3534因G13464DNA所G2559的G1461G5699A12A13A14。211RAPD在寄生虫种内不同个体的多态性分析中的应用G8506文G7492A15A16A17运用RAPD技术分G2047对G14020G19432G11436吸虫G2656G14120G19432G11436吸虫进行G3534因G13464G6205G3698G16809G20576，G993G1306G12591选出了G14033够对G14020G19432G11436吸虫G2656G14120G19432G11436吸虫G3534因G13464DNAG6205G3698的引物，G13792G1000G2045用上G17860结果对5G2494G14020G19432G11436吸虫G3534因G13464G6205G3698，分G7524了G993同G1022G1319G19400的DNA多态性。G5852小G4459等A18A19A20A21运用G16825技术研究了日本G15892吸虫大G19482株G3534因多态性分G7524，G17902过G19555机G6205G3698的28G23G1022G10267G8585分G7524发G10628我国大G19482G993同G3332域G15892吸虫G2476异程G5242较小，具有G11468对的G17963G1268G12295G4462性。OLIVEIRA等A18A19A19A21分G2047运用RAPDG2656PCRSSR对2G23株亚G20544G17886G2045G1172G7376原虫分G12175株的ITSG5219G2027进行G17963G1268多G7691性分G7524，发G10628G4625G12661其G5430态G11468同，G1306G12193G1881存在G17963G1268多G7691性。212RAPD在寄生虫种群鉴定上的应用对G1122G5430态上G11468似、G17963G1268G17329G12175较近的G12193G13688，我们G5468G19602用G5132G16280方G8873进行G18504G4462。G11013G1122RAPD技术G14033G7186G12046其多态性，从G13792G1038G12193G13688的G18504G2047G6564G1391了G1393据。G5364G19189文等A22A23A24A25应用G53G36G51G39G2033步分G7524了G7043氏G13966吸虫G2656G2338G6915G11602吸虫G3534因DNA多态性，RAPD结果G7186G12046G7043氏G13966吸虫G2656G2338G6915G11602吸虫明G7186G993同的RAPD带型。22扩增片段长度多态性AMPLIFIEDFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM,AFLP）AFLP技术是基于PCR技术而发展起来的扩增体外DNA限制性片段的技术，基因组4DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术的优点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。该方法具有分辨率高、可靠性好、重复性好、样品用量少、适用性广、对模板浓度的变化不敏感等优点；但也存在对DG49A的G13443度和内切酶的G17148量G16213G8726G17751高，AG41G47PG7643G16772是G7186性G7643G16772、不G14033G2318分G13443合G4388和G7446合G4388，不适用于G3835G16280模的G10317G5334位点G12591G17885，G16809G20576G16809G2070和G16786G3803G6116G7424相对G17751高，G16809G20576G7477G1226G16213G8726G17751为G14511G2063等G13582点。G3自从1993年G14667G1860学G13785ZABEAUG2656VOS创立G17837G12193G7828G8991DNA多态性的方G8873G1209来，AFLPG5062经得到了广泛应用，在寄生虫上的应用主要G19610G1025在分子G17963G1268学及分类学方面，ELSHEIKHA等A26A27A28A29运用AFLPG7643G16772对G13666国G20544源的G1315G13917G4406子虫进行多态性分G7524，结果发G10628其G3534因G13464G5058异G7186G14891，G7171一G12193高G5242G2499G2476的虫G12193，从G13792证实了AFLPG7171一G12193有效的分子G17963G1268G7643G16772，G14033够G1038G1315G13917G4406子虫及其G11468近G12193G4658G6564G1391G13007G13491发生学等方面的G1461G5699。OSTEN等A26A27A30A29对G6479G17728G15892G11695G13459虫的G989G12193G7692DNAG7643G16772技术G11AFLP、微卫星及G17728G5243子插入技术G12进行了研究，表明G6479G17728G15892G11695G13459虫具有高G5242的G3534因多态性。在分类学方面，G11013G1122G16825技术G14033G6593G12046G12193G1881G993同株的细微G5058G2047，从G13792G5369G15929了表型分类的G993G17287A26A27A31A29。G247623基因突变检测方法231聚合酶链式反应连接的单链构象多态性POLYMERASECHAINREACTIONLINKEDSINGLESTRANDCONFORMATIONPOLYMORPHISM,PCRSSCPPCRSSCPG7171在PCRG6205G3698的G3534G11796上，G3534G1122G2345链DNA分子的电泳G17813G12239率G993G1177与DNAG10267G8585的长G5242有G1863、G13792G1000还与G2345链DNA所G5430G6116的G12366G19400G7512象有G1863G13792设计的。G5415G7477G1226最G1351时，对G1122G11468同长G5242的G2345链DNA来G16840，因其G7692G14539G18252G13464G6116G6122G20046G5219G993同，G1262产生G993同的G12366G19400G7512象，从G13792导致在G19762聚丙G9923G18244G14030凝胶G1025的电泳G17813G12239率发生G6925G2476。根据G17813G12239率的G993同，G2499将G993同G17813G12239率的G2345链DNA带从电泳胶上G2011G991来G6122G256G2062G257G991来，重新进行PCRG6205G3698G5194G8991G5219，G1209确G4462G7692G14539G18252G2476异。PCRG16G54G54CP分析法的优点在于G29G6817作G12628G2345，不G19668G16213G10317G2047G1214G3132，技术G4493G7143G6496G6581，PCR产物变性后G7092G19668G10317G8542G3800G10714G4613可G11464接G11017G8903；G4466G20576G8505G20600少，G2620G7411G11713；G6164用G16809G2070常见，G6116G7424G17751G1314；可用G19762同位G13044方法G7828G8991；适合于G3835样G7424G12591G7609，在G1582G8991序G1055G2081，G3926G14033G18331用G8504法，可G3835G3835G18003G1825G11462G11458G8991序G6164G5114来的G5049作量，G2164G5567G8991序G17907度；G7094G14033分析DG49AG3的G3822G5589性，G2460可G7828G8991DG49A片G7041G1025的G2520种G12373变，G17836可G5224用于基因制G3282等G20058G3507。G13582G19531在于不G14033G16794G2047G12373变位G13634，G1000G5415G11909基G17728G6454G6122G20084G6454不G5445G2721DG49AG7512G1699时G7828G1998率G17751G1314，G3926G5415G42G16G55G1055G19400的G17728G6454，G1866G7828G1998率为G24G26G8，而G1000G12373变位点G2620G3272序列的变化对G54G54CP分析结G7536G5445G2721G19762常G4579，G7828G8991存在G1563G19464性；对5于G3835于G2200G69G83的DG49A片段随着长度的增G2164，G7828G8991的敏感性也逐渐降G1314。G3近年来，PCRSSCPG11013G1122技术G12628便、快速、G6116本G1314，G5062在G16780多研究领域得到广泛应用。寄生虫学G4490也G5332G3999将G17837G12193方G8873用G1122寄生虫的分类、G18504G4462及G17963G1268结G7512研究G1025。G19484G15437G15437等A32A33A34A35对来自G19750G9035G9258的G21077G17959G3839对G11462G3230G13459虫G11CONTRACAECUMRUDOLPHIIG12进行了PCRSSCP分G7524，发G10628我国G19750G9035G9258的G21077G17959G3839对G11462G3230G13459虫与来自G5859大G2045的G21077G17959G3839对G11462G3230G13459虫G37型具有一G7691的SSCP带型，G993同G1122G21077G17959G3839对G11462G3230G13459虫G36型。G18113G1987文等A32A33A36A35对我国11G1022G993同G3332域株的日本G15892吸虫的G17963G1268G2476异进行了研究，G1194们用特异引物对NAD1G2656COX1G3534因进行PCRG6205G3698G2465应，G9994G2530进行SSCP分G7524，发G10628NAD1有7G12193带型，COX1有8G12193带型，G17837G16840明我国G2520G3332域株的日本G15892吸虫发生了G993同程G5242的G2476异。232变性梯度凝胶电泳（DENATURINGGRADIENTGELELECTROPHORESIS,DGGE）G7692G14539G18252G5058异G2499导致DNAG10267G8585的G10088G16311性G6925G2476，在高G9213G7477G1226G991DNAG17902过G2559G7811G5242G2476性G2070的聚丙G9923G18244G14030凝胶电泳G13792分G12175。G5415一G1022DNAG10267G8585G17902过凝胶G13792G12239动时，G4439将G17947到G8999G5242逐渐G3698加的G2476性G2070，在凝胶G1025G7588一位G13634，G16825DNAG10267G8585将部分G6122G4448全G2476性，发生G2476性的DNA分子的电泳G17813G12239率明G7186降G1314，DNA分子在凝胶G1025G2476性的位G13634G11013其G7692G14539G18252G5219G2027及碱G3534G13464G6116所决G4462。G17837G7691分子G18339G11468同G1306碱G3534G5219G2027G993同的DNA分子G10267G8585在G993同位G13634G2476性，G5194得到凝G19610。G16825技术明G7186的优点G7171G14033够G7828G8991出G1972乎全部的G3534因突G2476，G5194G1000无G19668使用任何G7643G16772方式，便G2499直接用G1122G3534因G13464DNA多态性的G7828G8991，将分G12175G5332的G7477带回收G2499用G1122直接G8991G5219。SATOH等A37A38A39A40用DGGEG8873对微小隐G4406子虫G708CRYPTOSPORIDIUMPARVUM），安氏隐G4406子虫G11CANDERSONIG12，鼠隐G4406子虫G708CMURISG12G2656日本源鼠隐G4406子虫G3534因型G708CMURISJAPANESEFIELDMOUSEGENOTYPEG709进行了G18504G4462G2318分，证明了DGGEG8873G14033够方便G3332G18504G4462G2318分隐G4406子虫G4658的G993同G12193及其G3534因型。值得注G5859的G7171，近G1972年来，G19555G11540对DDGEG2465应G7477G1226的G6925进，出G10628了恒G4462G2476性凝胶电泳G11CONSTANTDENATURANTGELELECTROPHORESIS,CDGEG709、瞬时G9213G5242G7811G5242电泳G11TEMPORALTEMPERATUREGRADIENTGELELECTROPHORESIS,TTGEG12G2656G9213G5242G7811G5242凝胶电G11TEMPERATUREGRADIENTGELELECTROPHORESIS,TGGEG12，G17837些G6925进使得G16825技术更加G2499靠、G12295G4462、快速。如G11013G2476性G2070G5430G6116的G7811G5242G2499被G11013微处G10714器控制的G9213G5242G7811G5242所代替，与DGGEG11468G8616，更加G12295G4462G2499靠。24聚合酶链式反应连接的限制性片段长度多态性POLYMERASECHAINREACTIONLINKEDRESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISM,PCRRFLPPCRRFLP技术G7171在G51CG53G6205G3698的G3534G11796上，用一G12193G6122两G12193限制性G1881G2011酶进行酶G2011，将酶G2011产物G17902过琼脂G12970凝胶G6122聚丙G9923G18244G14030凝胶电泳，得到大小G993同的限制性G10267G8585，根据G17837G12193多态性分G7524目的G3534因的分子G17963G1268G10378况。与G1268G13491的RFLPG11468G8616，G16825方G8873的优点在6G1122快速G12628便；G6116本较G1314；G2494G19668将微G18339的DNAG6205G3698，G13792G1000对G7691品的纯G5242要求G993高，也G993G19668要用G6930G4568性G7643G16772探针G1582杂交。241PCRRFLP在寄生虫流行病学分析上的应用NAGAMANI等A41A42A43A44在对印G5242的隐G4406子虫病流行病学调查分G7524G1025，运用PCRRFLP技术发G10628在G232G1022阳性G7691品G1025，有29G1022G70869G709G7691品的G3534因型G1038人隐G4406子虫G708CHOMINISG709，8G1022G70819G709G3534因型G1038微小隐G4406子虫G708CPARVUMG709，5G1022G11119G12G1038两G13785的混合感G7591。242PCRRFLP在寄生虫虫种鉴定上的应用ROMSTAD等A45A46A47A48将PCRRFLP方G8873用G1122G18504G2047人的肠G17959寄生虫存在G1122多哥G2656加纳的双叉食G17959口G13459虫G11OESOPHAGOSTOMUMBIFURCUMG12G2656G13666洲板口G13459虫G11NECATORAMERICANUSG12。RAMACHANDRAN等A49A50A51A52采用PCRRFLP方G8873G18504G2047了类圆G13459虫G11STRONGYLOIDESG12的3G1022G12193。ZHU等A49A50A50A52选择G85DNA的ITS1、ITS2G265658SDNAG1582分子G17963G1268G7643G16772，经PCRRFLP技术G2656PCRSSCP技术，证实G17837两G12193分子G7643G16772技术均G14033有效G2318分犬首弓蛔虫G2656猫弓首蛔虫。25微卫星锚定PCR（SIMPLESEQUENCEREPEATANCHOREDPCR,SSRPCR）在G11507G7692生物G1319G1025存在G11540大G18339G12628G2345重G3809G5219G2027，约占G6984G1022G3534因G13464的5左右，呈G1030G13864重G3809散在分布A53A54A55A56，SSRPCR就G7171根据重G3809G5219G2027两端的保守G5219G2027设计一对特异引物，G6205G3698每G1022位点的微卫星G5219G2027，再经聚丙G9923G18244G14030凝胶电泳，G8616较G6205G3698产物的长短G2476G2282，即G2499G7186G12046G993同G3534因型的G1022G1319在每G1022微卫星DNA位点的多态性。除了具有一般PCR优点G3818，SSRPCRG11013G1122G7171在高G5242严谨G7477G1226G991进行的G6205G3698G2465应，因G13792具有重G3809性G3921的优点，G5194G1000G14033够避免引物竞争G13792引起的G1314重G3809G5219G2027G2656假阳性。冯有仁等A57A58A59A60认G1038SSRPCR用G1122G3534因G5058异分G7524要优G1122RAPD方G8873。郑彬等A57A58A61A60采用SSRPCRG6205G3698微小按蚊G2345蚊G3534因DNA，G5194用G13491计分G7524软G1226发G10628微小按蚊G12193G13688G1881部存在较高的G17963G1268G2476异，其G1025元江源G2476异程G5242较G1314，G13792潞西源G2476异程G5242较高，从G13792证明了G13688G1319G19400G17963G1268G17329G12175部分与亲缘G12193分类有G1863，G13792与G3332G10714G17329G12175无G1863。26单核苷酸多态性SINGLENUCLEOTIDEPOLYMORPHISMS,SNPSSNPSG7171G6363G3534因G13464DNAG5219G2027G1025G2345G1022碱G3534替换G13792导致的多态性，其G1025最少一G12193等位G3534因在G13688G1319G1025的频率G993小G11221，因G8504G4439G5194G993包括碱G3534的插入G6122缺失G13792引起的G5058异。G16825方G8873被认G1038G7171继RFLPG2656微卫星G2530的第G989代分子G7643G16772技术。G4439包括存在G1122G3534因G13546G11733G2318的功G14033性突G2476CSNPSCODINGREGIONSSNPS及G19555机分布G1122G3534因G13464的大G18339G2345碱G3534G2476异。CSNPSG2499分G1038同G1053CSNPSSYNONYMOUSCSNPSG2656G19762同G1053CSNPSNONSYNONYMOUSCSNPS26。与前两代分子G7643G16772G11468G8616，SNPSG11013G1122具有G6980G18339多、分布广，易G1122实G10628自动G2282G1209及G17963G1268G12295G4462、7多态性G3921等优点，被生物学G4490们广泛应用G1122G17963G1268多G7691性分G7524、G3534因G7643G16772、连锁图谱的G7512建、G3534因G13464结G7512与功G14033等研究领域27。在寄生虫学方面，SARA等28对G993同疟原虫病流行G2318的23株G19400日疟原虫PVMDR1G3534因的两G1022G10267G8585进行了SNPS分G7524，结果G7186G12046G10267G85851没有G19762同G1053突G2476，G1000G2494有2G1022G7691品在173处发生了同G1053突G2476，G10267G85852分G2047在976G26561076处发生了G19762同G1053突G2476，其G1025976处发生的突G2476率G103826，1076处的突G2476率G103861。VANDER29对肿孔古柏G13459虫G708COOPERIAONCOPHORAG709的MTDNA进行了SNPS分G7524，G1194们绘制了426G1022SNPS，发G10628每32BP就有1BP多态性，最G5132见的SNPS多发生在G/A，G1000同G1053突G2476率远远大G1122G19762同G1053突G2476率，从G13792G1038进一步研究G13546G11733G15519G11345、RRNA、TRNAG2656G19762G13546G11733G15519G11345G3534因的G17963G1268G5058异G6564G1391了G3534G11796。FENG等30分G7524了G19400日疟原虫100KB左右的G11468邻G7591G14406G1319G10267G8585，发G10628有191G1022SNPS，G1306G4439们G5194G993均衡分布，主要近63分布在G3534因G19400G2318，G3534因G1881G2318G8616G3534因G19400G2318少G5468多。3PCR技术的最新进展31实时定量PCRREALTIMEQUANTITATIVEPCR,QTPCR实时G4462G18339PCR技术G7171在PCRG2465应G1319G13007G1025加入荧光G3534G3254，G2045用荧光G1461号积累实时监G8991G6984G1022PCR进程，最G2530G17902过G7643准曲G13459对未知模板进行G4462G18339分G7524的方G8873A62A63A64A65A63A66A65A63A63A67。G4439克服了G1268G13491PCR的一些缺点，具有特异性G3921、G4462G18339准确、G9801敏G5242高、所G19668时G19400短、高G17902G18339等优点，在肿瘤及其G11468G1863G3534因表达研究、病原分子生物学诊断、G3534因表达研究、G3534因的G2345G7692G14539G18252多态性G2656G17963G1268性疾病诊断等领域得到了广泛应用A62A63A68A67。G16825技术也使得寄生虫诊断上了一G1022新台阶。GAMA等A62A63A69A67对疟原虫进行了实时G4462G18339PCRG7828G8991，发G10628G16825方G8873G14033够G7828G8991出阳性的最G1314阈值G103805G1022虫G1319/每G1022G7691品，对临G5214G11163G10378G1038阳性的G7828出率G1038100。KIM等A62A63A70A67对经G1319G3818G3533G1871的G8900G2214虫进行实时G4462G18339PCRG7828G8991，发G10628其G9801敏G5242G103815G1022G6116虫/每G1022G7691品，高G1122G7234G17902PCR，G1194们又对从G20544G15892G1025得G4658特异性引物G2656TAQMAN探针，克G19546目的G10267G8585绘制G7643准曲G13459。结果表明，G16825方G8873G14033快速、有效G3332G4462G18339G7828G8991G5194G14033G2318分多G12193重要的G10287、G13662G9052G2282G17959寄生虫。32环介导的等温DNA扩增LOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONG17837G7171日本学G13785NOTOMIA71A72A73A74等发明一G12193新型的G1319G3818G6205G3698DNA的方G8873，与G1268G13491的PCRG993同，G16825方G8873G7171G2045用链G13634换G2465应G2656G10627介导进行G3534因G6205G3698，用G23G1022G61226G1022引物对DNA的6G1022G61228G1022G2318域进行目的G10267G8585G6205G3698。本技术G2465应G7477G1226在恒G9213G991进行，G993G19668要G5502G10627G1214等G7126G17161G1214器，具有G12628便、快速G708大约G1177G196681G1022多小时便出结果G709、G1314G5277、准确等特点，G11013G1122克服了G1268G13491PCRG993G14033在实G20576G4472G3818进行的缺点，具有广泛的应用价值。目前，G16825技术G5062应用到人A75A76A77A78、畜G12177A75A79A80A78G2656G8712生动物A75A79A81A78的多G12193病原G1319G7828G8991，在国G3818，ISEKI等A79A82A78G5062将G16825技术应用G1122G10287G5064G171378G7043虫的G7828G8991，G14033够G18504G4462G10287G5064G17137G7043虫G2656双G14481G5064G17137G7043虫两G1022G993同的虫G12193，其G9801敏G5242G7171G1268G13491PCR的10A76G79410A83G1505。G4625G12661国G1881在寄生虫领域对G16825技术研究的较少，G1306G7171我们G11468G1461G19555G11540G16825技术的G993断G6925进，G4439一G4462G1262在寄生虫病诊断、寄生虫G18504G4462等方面得到广泛应用。33依赖核苷酸序列的扩增G708NUCLEICACIDSEQUENCEBASEDAMPLIFICATION，NASBAG709与G7234G17902PCRG993同，NASBAG993G1177G17878合DNAG6205G3698，也同G7691G17878合RNAG6205G3698。G4439G7171在1对G2559有G557G2563动子G5219G2027的引物引导G991，进行连G13505的、等G9213G708G231G263的恒G9213G7477G1226G991G709的酶聚合G2465应，G2465应原G7021G1038模板G708DNAG6122RNAG709、G2465G17728G5417酶、G3136G14752G1319G557G7692G12970G7692G18252聚合酶、G7692G12970G7692G18252酶G43及2G7477设计的G4533G7692G14539G18252引物，其G1025上G9228引物5G10G7423端G2559有G3136G14752G1319G557的G1393G1719