吉首大学2011届学士毕业论文树脂纯化AB8型大孔吸咐树脂纯化马比木喜树碱工艺研究doc

吉首大学2011届学士毕业论文论文题目AB8型大孔吸咐树脂纯化马比木喜树碱工艺研究学生姓名杨通学号20074192017学院生物资源与环境科学学院专业年级2007级植物科学与技术指导教师赵东亮职称讲师吉首大学毕业论文1目录摘要3关键词3ABSTRACTS3KEYWORDS31前言32材料、仪器与试剂421材料422仪器423试剂53实验部分531马比木喜树碱的提取532大孔树脂预处理533静态吸咐5331上样液浓度的选择532上样液PH值的选择5333上样温度的选择6334洗脱剂的选择6335洗脱剂浓度的选择634动态吸附实验6341上样流速的选择6吉首大学毕业论文2342树脂吸附量的测定6343洗脱流速的确定64结果与讨论741上样液浓度对树脂吸附率影响742不同PH值对树脂吸附率的影响743温度对树脂吸附率的影响844洗脱剂对洗脱效果的影响845洗脱剂浓度对洗脱效果的影响846上样流速对树脂吸附的影响947树脂吸附量的测定1048洗脱流速对洗脱效果影响105结论11参考文献12致谢14吉首大学毕业论文3AB8型大孔吸咐树脂纯化马比木喜树碱工艺研究杨通指导老师赵东亮吉首大学生物资源与环境科学学院湖南吉首416000摘要本文采用乙醇溶液常温浸提的方法从马比木中提取喜树碱粗品；并用AB8大孔吸咐树脂纯化，通过对喜树碱的上样液的浓度、上样PH、上样温度、洗脱剂、洗脱剂浓度的筛选，以及对上样液流速、洗脱剂流速和树脂吸咐量的研究。结果表明吸附和洗脱的最佳工艺参数为样液质量浓度0300MG/ML，最佳上样温度为20，最佳上样PH为4；上样流速25BV/H；每克树脂吸咐量为24MG；以70乙醇为洗脱剂，洗脱液流速15BV/H。关键词马比木；喜树碱；大孔吸附树脂；吸咐；洗脱MACROPOROUSRESINADSORPTIONFORPURIFICATIONOFCAMPTOTHECINYANGTONGSUPERVISORZHAODONGLIANGCOLLEGEOFBIOLOGYANDENVIRONMENTALSCIENCES,JISHOUUNIVERSITY,JISHOUHUNAN,416000ABSTRACTSCAMPTOTHECINECRUDEPRODUCTSWEREGAINEDFROMPITTOSPORUMLINOTHAPODYTESWITHETHANOLSOLUTIONINNORMALTEMPERATUREAB8MACROPOROUSRESINWASCHOSENFORPURIFICATIONTHROUGHSIFTINGTHESAMPLESOLUTIONCONCENTRATION,SAMPLEPH,SAMPLETEMPERATURE,ELUTIONCONCENTRATION,ANDSTUDYINGTHEFLOWRATEFORADSORPTIONANDDESORPTION,THEOPTIMALADSORPTIONANDDESORPTIONCONDITIONSOFPITTOSPORUMLINOTHAPODYTESCAMPTOTHECINEONTOAB8RESINWEREDETERMINEDASFOLLOWSCONCENTRATIONOFSAMPLESOLUTIONIS0300MG/ML,THEBESTSAMPLETEMPERATUREIS20,THEBESTSAMPLEPHIS4FLOWRATEFORADSORPTION25BV/H,THERESINADSORPTIONOFPERGRAMIS24MG，ANDTHEOPTIMALETHANOLCONCENTRATIONANDFLOWRATEFORTHEDESORPTIONOFPITTOSPORUMLINOTHAPODYTESCAMPTOTHECINEWERE70AND15BV/HKEYWORDSPITTOSPORUMLINOTHAPODYTES，CAMPTOTHECINE，MACROPOROUS，ADSORPTION，ELUT1前言马比木NOTHAPODYTESPITTOSPOROIDESOLIVSLEUM,为茶茱萸科假柴龙属植物，灌木或小乔木，分布于贵州、湖南、湖北、四川等地1。喜树碱CAMPTOTHECIN,CPT是我国特有树种喜树CAMPTOTHECAACUMINATADECNE中所含有的喹啉类衍生物生物碱,具有显著的抗癌活性,目前已有4种以喜树碱为前体合成的喜树碱衍生吉首大学毕业论文4物获得美国食品和药物管理局FDA批准用于临床治疗结肠癌、直肠癌和复发性卵巢癌23。1966年WA11等首次从喜树植物中分离出喜树碱之后，人们对喜树碱的生物和化学性质进行了大量的研究，主要是针对抗肿瘤研究领域。目前对其抗癌作用机理的研究已经取得了一定的进展。喜树碱的抗癌作用，起初的认为是喜树碱通过抑制核酸合成，导致癌细胞内DNA降解，近年来研究结果否定了这一观点，研究发现喜树碱主要是通过抑制癌细胞DNA复制酶，阻碍癌细胞的增殖。1988年又进一步发现喜树碱主要是通过阻断DNA拓扑异构酶I合成，发挥细胞毒性的独特抗癌机理4。但受喜树碱的自身毒性及其化学特性的影响，其临床应用受到一定限制。目前，人们主要是以喜树碱为母体进行化学修饰，来获得具有抗癌活性的衍生物。在美国，喜树碱一11和TPT已经批准用于实体瘤的临床治疗。喜树碱已经成为继紫杉醇之后第二个由植物衍生的重要抗癌药物。近年来，喜树碱在农药领域的应用研究也在逐步深入。有研究发现喜树碱能造成家蝇和马尾松毛虫不育，而且对甘蔗黄螟亦有毒杀作用5。喜树碱自WALL等首次从喜树植物中分离出以来，国内外有关喜树碱提取分离和含量测定的研究已有许多报道613，喜树碱的生产也一直是以喜树的种子为原料。然而近年来，许多喜树碱生产厂家却改用马比木的根提取制备喜树碱。本文以马比木根为原料，乙醇为提取剂，提取喜树碱粗提物采用AB8吸附树脂纯化，探究上样液浓度、上样PH、上样温度、洗脱剂、洗脱剂浓度、上样液流速、洗脱剂流速对纯化效果的影响，确定喜树脂纯化最佳工艺。2材料、仪器与试剂21材料马比木经张代贵老师鉴定），AB8大孔树脂（安微三星树脂科技有限公司），PH试纸，滤纸。22仪器UV160A紫外可见分光光度计日本，岛津，EB340HW电子天平日本，岛津，DP32真空干燥箱日本，YAMATO，BS220恒温水浴锅日本，岛津，R215旋转蒸发仪瑞士，步琪。吉首大学毕业论文5A0A023试剂无水乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇、浓盐酸、氢氧化钠（以上试剂为国产分析纯）。3实验部分31马比木喜树碱的提取取干燥马比木根粉碎混匀后，过40目筛，取一定量粉末置于1000ML的烧杯中用无水乙醇浸泡23天后过滤，滤渣再加无水乙醇浸泡23天后过滤，重复34次，合并滤液，得喜树碱提取液14。将喜树碱提取液置于旋转蒸发仪浓缩，温度为3715。将浓缩液置于真空干燥箱内干燥至质量不再变化，得喜树碱固体粗提物。32大孔树脂预处理大孔吸附树脂先用去离子水浸泡，洗清，再用无水乙醇浸泡24H，蒸馏水洗净，然后用5HCL浸泡，蒸馏水洗至中性，再用2NAOH溶液浸泡，用蒸馏水洗至中性，去离子水浸泡备用。33静态吸咐331上样液浓度的选择分别取00109G、00205G、00306G、00403G、00505G喜树碱粗品，用1ML甲醇助溶17，配成浓度分别为01MG/ML、02MG/ML、03MG/ML、04MG/ML、05MG/ML的喜树碱水溶液将上述溶液分别加入到装有活化AB8树脂500G的5个150ML三角瓶中，室温静态吸附24H，在UV160A型紫外分光光度计上于254NM波长处测量上清液的吸光度，计算树脂对不同浓度的喜树碱溶液吸附率。吸附率100A0吸附前吸光值A吸附后吸光值332上样液PH值的选择分别称取已活化的AB8湿树脂500G，加入35MLPH值为4、5、6、7、8、9、10的喜树碱溶液，室温下静态吸附24H，在波长254NM处测量其上清液的吸光吉首大学毕业论文6度，计算吸附率。333上样温度的选择称取500G已活化AB8湿树脂6份，分别加入40ML喜树碱溶液，分别在15、25、25、30、35、40温度下静态吸附24H，在254NM处测量上清液的吸光度，计算吸附率。334洗脱剂的选择分别取500G已吸附喜树碱的AB8树脂4份于三角瓶中，分别加入甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇40ML，对其在常温下静态洗脱，每30分钟取一次上清液；测洗脱液在254NM处的吸光度。335洗脱剂浓度的选择分别称取500G已吸附了喜树碱的AB8湿树脂8份置于150ML三角瓶中，分别加入浓度为30、40、50、60、70、80、90、100的乙醇溶液40ML，静置2H，在波长254NM处测定各上清液的吸光度。34动态吸附实验341上样流速的选择将AB8树脂浸没在蒸馏水中，按湿法装柱，树脂加到柱体积3/4后，再用蒸馏水反复过柱，装好的树脂柱静止放置过夜，备用。取浓度为03MG/ML的喜树碱溶液流经AB8树脂柱脂柱,流速分别控制为15BV/H、20BV/H、25BV/H、30BV/H，每10ML收集一管流出液，测定其吸光值A。342树脂吸附量的测定称取湿重为10G的AB8树脂湿法装柱后，用蒸馏水反复过柱，装好的树脂柱静止放置过夜，备用。取喜树碱浓度为03MG/ML、PH为4的上样液在20上柱。每10ML收集一管流出液，测定其吸光值A。343洗脱流速的确定取体积分数为70乙醇溶液洗脱饱和吸附的树脂，流速分别控制为15BV/H、20BV/H、25BV/H、30BV/H，每10ML收集一管流出液,测定其吸光值A。吉首大学毕业论文74结果与讨论41上样液浓度对树脂吸附率影响由图1知随着喜树碱浓度的升高，树脂吸附率先有一个上升趋势，当浓度到03MG/ML时较好，随着喜树碱浓度的继续增大，吸附率呈现下降的趋势，故选择浓度为03MG/ML的喜树碱溶液为最佳上样液。图1不同喜树碱浓度下的树脂吸附率FIG1RESINADSORPTIONRATEOFDIFFERENTCAMPTOTHECINCONCENTRATION42不同PH值对树脂吸附率的影响由图2不同PH值对树脂吸附率的影响FIG2EFFECTOFPHVALUEOFSAMPLESOLUTIONONADSORPTIONPERCENTAGEOFRPCFONTOAB8RESIN由图2可见，上样液的PH值对吸咐率有影响，当PH为4时，吸附效果最好，吉首大学毕业论文8增大PH值吸咐率下降。由于强酸性对工业生产要求严格，不利于生产，所以本文末继续探究PH小于4的吸附情况，选择PH为4是最佳上样PH。43温度对树脂吸附率的影响温度影响树脂吸附效果，结果如图3，当温度升高，树脂的吸附率增加，当温度为20时吸附效果最明显，继续升高温度，吸附率下降。故20为最佳上样温度。图3温度对树脂吸附率的影响FIG3THEEFFECTOFTHEAB8RESINABSORPTIONFROMTHEDIFFREENTTEMPERATURE44洗脱剂对洗脱效果的影响由表1可知30分钟时甲醇为最好的洗洗脱剂，30分钟后正丁醇和乙醇洗脱效果都很好。由于正丁醇相对乙醇沸点高，价格贵，所以本文选乙醇洗脱剂。表1洗脱剂的筛选TABLE1ELECTIONOFELUANT洗脱液各时段洗脱液吸光值30MIN60MIN90MIN甲醇391439763976乙醇347339363941丙酮375938533904正丁醇34734019403445洗脱剂浓度对洗脱效果的影响结合目标化合物极性与乙醇的特点，根据柱层析吸附与解吸附原理，实验选择不同体积分数的乙醇为洗脱剂，结果见图5，随着乙醇体积分数的升高，洗脱吉首大学毕业论文9效果先有一个上升趋势，到乙醇体积分数70时，随着乙醇体积分数的继续增大，洗脱效果趋向平稳。为工艺生产节约成本，故本文选用体积分数为70的乙醇为最佳洗脱剂浓度。图4乙醇体积分数对解吸咐的影响FIG4EFFECTOFETHANOLCONCENTRATIONONDESORPTIONPERCENTAGEOFRPCFFROMAB8RESIN46上样流速对树脂吸附的影响图5不同上样流速与树脂吸附效果关系FIG5THERELATIONSHIPBETWEENDIFFERENTSAMPLEVELOCITYANDEFFECTOFRESINADSORPTION由图5可以看出，在一定范围内,随着上样流速的增大，泄漏提前，当上样液流速为15BV/H时,喜树碱约在500ML处开始泄漏，当上样液流速为20BV/H吉首大学毕业论文10时，喜树碱泄漏点大约在440ML处，当流速为25BV/H和30BV/H时喜树碱泄漏大约在300ML处。随流速的增大,树脂周围的喜树碱分子过多,使得部分喜树碱没来得及被吸附就流出来,树脂的吸附量降低。但流速过慢不利于生产，故上样液流速确定为20BV/H47树脂吸附量的测定由图6可知以喜树碱浓度为03MG/ML的样液上样，流出液的吸光值在500ML处有渗漏，当上样液体积大概在820ML处吸光值不再增加，树脂吸附饱和。每克树脂的吸附量约为24MG。图6上样液体积与吸光值的关系FIG6THERELATIONSHIPBETWEENSAMPLELIQWIDVALNEANDABSORBLIGHTVALUE48洗脱流速对洗脱效果影响由图7可知，洗脱液的吸光值随着洗脱液体积的增加出现先平缓再下降再平缓的规律。洗脱相同质量的喜树碱，不同流速洗脱时所用的乙醇体积不同。当洗脱流速为15BV/H时，曲线大约在720ML处开始平缓，所用的乙醇体积最少。所以以15BV/H为最佳洗脱流速。吉首大学毕业论文11图7不同洗脱流速与洗脱效果的关系FIG7EFFECTOFELUTIONRATEONDESORPTIONPERCENTAGEOFRPCF5结论实验采用静态吸附实验和动态吸附实验，选用AB8型大孔树脂纯化；调节喜树碱溶液的浓度为03MG/ML，PH值为4左右,在20通过上柱动态吸附,并控制上样流速为20BV/H每克树脂的吸附量为24MG。吸附完毕后用70的乙醇以15BV/H的流速洗脱,洗脱效果明显。综上所述,用AB8型大孔树脂分离纯喜树碱,其工艺较简单、收率高、成本低,适合工业化生产。吉首大学毕业论文12参考文献1中国科学院中国植物志编辑委员会中国植物志第四十六卷M北京科学出版社1989，492GREEMERSJP,DESPASR,FAVALLIG,ETALTOPOTECANANACTIVEDRUGINTHESECONDLINETREATMENTOFEPITHELIALOVARIANCANCERRESULTSOFALARGEEUROPEANPHASESTUDYJJCLINONCOL1996ORENCEA,NESSLERCLCAMPTOTHECINOVERFOURDECADESOFSURPRISINGFINDINGSJPHYTOCHEMISTRY2004,65273527394HIANGYH，HERIZBERGR,HECHTSANDLIULFCAMPTOTHEEININDUEESPROTEINLINKEDDNABREAKSVIAMAMMALIANDNATOPOISOMERASEJBIOLCHEM1985，26014873一148785徐汉虹杀虫植物与植物性杀虫剂M北京中国农业出版社2001，2676尹文仲,童学飞,陈科力不同海拔条件下竹节参中人参皂苷含量的比较J北京民族学院学报医学版2006,23212147冉先德中华药海上册M哈尔滨哈尔滨出版社1993，13168向极钎,杨永康,覃大吉,等竹节参人工栽培技术研究J中药研究与信息2005,7526289瞿万云家种与野生竹节人参化学组分的薄层色谱比较分析J湖北民族学院学报医学版2003,202121410蔡平,邱小星,肖倬殷川产竹节参皂苷元的薄层光密度扫描测定J四川医