流感病毒的分离鉴定二课件

1、流感病毒的分离鉴定二1 实验十实验十 流感病毒的分离鉴定流感病毒的分离鉴定 （二）（二） 1 1、血细胞凝集实验、血细胞凝集实验 2 2、血细胞凝集抑制试验、血细胞凝集抑制试验 流感病毒的分离鉴定二2 目的：熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。目的：熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。 原理：流感病毒颗粒表面有血凝素原理：流感病毒颗粒表面有血凝素,具有使鸡、豚鼠具有使鸡、豚鼠 等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待 检的鸡胚尿囊液或羊水中，如出现血细胞凝集现象，检的鸡胚尿囊液或羊水中，如出现血细胞凝集现象， 即表示有病毒存在；如

2、血凝阳性，则可进一步用血凝即表示有病毒存在；如血凝阳性，则可进一步用血凝 抑制试验进行病毒鉴定，流感病毒的血凝性，可被免抑制试验进行病毒鉴定，流感病毒的血凝性，可被免 疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用，疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用， 借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。 流感病毒的分离鉴定二3 实验材料实验材料 (1)接种流感病毒的鸡胚。接种流感病毒的鸡胚。 (2)质量分数为质量分数为05的鸡红细胞悬液。的鸡红细胞悬液。 (3)流感病毒型与亚型免疫血清。流感病毒型与亚型免疫血清。 (4)碘酒，酒精消毒棉球。碘酒

3、，酒精消毒棉球。 (5)灭菌的镊子、剪刀。灭菌的镊子、剪刀。 (6)无菌小试管，毛细滴管，吸管。无菌小试管，毛细滴管，吸管。 (7)生理盐水。生理盐水。 (8)试管、试管架。试管、试管架。 流感病毒的分离鉴定二4 实验方法：实验方法： 1、血细胞凝集实验、血细胞凝集实验 (1)收获尿囊液：鸡胚孵育收获尿囊液：鸡胚孵育3d后后,放放4度冰箱过夜度冰箱过夜,次日次日 取出鸡胚取出鸡胚,消毒气室端卵壳消毒气室端卵壳,用小镊子在无大血管处用小镊子在无大血管处 撕破卵膜撕破卵膜,以无菌毛细管吸取尿囊液以无菌毛细管吸取尿囊液,放入无菌试管放入无菌试管 中。中。 (2)取尿囊液取尿囊液01mL,作作1：10

4、稀释。稀释。 流感病毒的分离鉴定二5 流感病毒的分离鉴定二6 (3)取取10支小试管，按给各管加入生理盐水支小试管，按给各管加入生理盐水0.2mL。 (4)取取1：10稀释的尿囊液稀释的尿囊液02mL，加人第，加人第1个试管个试管 中，混匀后，再吸出中，混匀后，再吸出02mL加入第加入第2个试管中；个试管中； 混匀后，从第混匀后，从第2个试管吸出个试管吸出02mL加入第加入第3个试个试 管管依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第依次作倍比稀释至第九管，混匀后自第9 个试管中取出个试管中取出02mL弃掉。这样各管液体量均弃掉。这样各管液体量均 为为02mL，从第，从第1-9个试管的尿囊液稀释度为个试

5、管的尿囊液稀释度为 1:20，1:40，1:5120，第，第10个试管为生理个试管为生理 盐水对照管。盐水对照管。 (5)稀释完毕后加人体积分数为稀释完毕后加人体积分数为05的压积鸡红的压积鸡红 细胞悬液，每管细胞悬液，每管02mL,室温放置室温放置3060mn。 流感病毒的分离鉴定二7 流感病毒血凝试验 试管号试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 生理盐水生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 病毒液病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃弃0.2 病毒稀释度病毒稀释度 1:

6、20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对对 照照 0.5%鸡红细胞鸡红细胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 摇匀置室温摇匀置室温6090分钟分钟 结结 果果 + + + + + + + 流感病毒的分离鉴定二8 试管号试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 生理盐水生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 病毒液病毒液

7、(1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃弃0.2 病毒稀释度病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对照对照 0.5%鸡红细胞鸡红细胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 摇匀置室温摇匀置室温6090分钟分钟 结结 果果 + + + + + + + 流感病毒的分离鉴定二9 (6)结果观察结果观察 观察时要轻拿、勿摇，首

8、先观察对照管应无凝集，然观察时要轻拿、勿摇，首先观察对照管应无凝集，然 后再观察试验管，各管出现的凝集程度以后再观察试验管，各管出现的凝集程度以“+”、 “+”、“+”、“+”、“”表示，判断标准如下：表示，判断标准如下： “+”：全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，：全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底， 边缘不整齐。边缘不整齐。 流感病毒的分离鉴定二10 “+”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不 凝，在管底中心形成小红点。凝，在管底中心形成小红点。 “+”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不：约有

9、半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不 凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。 “+”：只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小：只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小 圆点，凝集的红细胞在小圆点的周围。圆点，凝集的红细胞在小圆点的周围。 “”：不凝集，红细胞沉于管底，呈一边缘整齐的致密圆点。：不凝集，红细胞沉于管底，呈一边缘整齐的致密圆点。 流感病毒的分离鉴定二11 凝集效价：能使红细胞呈能使红细胞呈“+”凝集的病毒最高稀释凝集的病毒最高稀释 度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。 如表，第如

10、表，第6个试管为个试管为“+”，且病毒稀释度最高，则该病，且病毒稀释度最高，则该病 毒悬液效价为毒悬液效价为1:640，即该病毒悬液稀释到，即该病毒悬液稀释到1：640时，每时，每 02mL中含有一个血凝单位，配制中含有一个血凝单位，配制4个血凝单位的病毒悬个血凝单位的病毒悬 液时，病毒液应稀释成液时，病毒液应稀释成(1：640)X4，即，即1：160。 流感病毒的分离鉴定二12 2、血细胞凝集抑制试验 试试 管管1 待测待测 2 待测待测3 血清对照血清对照4 抗原对照抗原对照5 红细胞对照红细胞对照 生理盐水生理盐水 1：5血清血清 4u病毒液病毒液 0.5鸡红鸡红 细胞细胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.4 0.2 按表加入材料和试剂按表加入材料和试剂 流感病毒的分离鉴定二13 结果观察结果观察 先观察先观察3支对照管，如抗原对照管出现完全凝集，血清对照和红支对照管，如抗原对照管出现完全凝集，血清对照和红 细胞对照不发生凝集，再观察试验管。细胞对照不发生凝集，再观察试验管。 血凝抑制效价：完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度，即该血凝抑制效价：完全抑制红细胞凝集的血清最高稀释度，即该 血清的抑制效