微小牛蜱4D8基因原核表达及免疫原性分析

1、动物医学进展 ,2009 ,30 (10) :11214 pro gre s s i n vet e ri na r y me dici ne 3微小牛蜱 4d8 基因原核表达及免疫原性分析宏 3,罗建勋 3刘军龙 ,关贵全 ,李有全 ,马米玲 ,刘爱红 ,任巧云 ,殷(家畜疫病病原生物学国家重点实验室 ,农业部草食动物疫病重点实验室 ,甘肃省动物寄生虫病重点实验室中国农业科学院兰州兽医研究所 ,甘肃兰州 730046)摘要 :按 ge nba nk 已知微小牛蜱的 4d8 基因核苷酸序列设计 1 对表达引物 。提取微小牛蜱幼蜱总rn a ,反转录合成双链 cdn a ,用设计的表达引物扩增出

2、 4d8 基因 ,扩增得到的核苷酸长 486 bp ,编码 161 个氨基酸 ,该蛋白预计分子质量为 18 k u 。将该基因亚克隆到原核表达载体 p gex4 t21 ,构建重组原核表达 载体 p gex4 t2124d8 ,转化 bl 21 宿主菌 ,经 ip t g 诱导 ,可成功表达 。重组融合蛋白分子质量为 45 k u 左 右 ,与预期大小一致 。we st e r n blo t 显示 ,兔抗微小牛蜱唾液腺 、肠道和卵巢抗体能够识别重组表达蛋白 。关键词 :微小牛蜱 ;4d8 基因 ;原核表达中图分类号 : q786 ; s852 . 746文献标识码 : a文章编号 :1007

3、25038 (2009) 1020011204微小牛蜱是动物的一种重要外寄生虫病 ,它广泛存在于我国华北 、华中 、华东 、华南和西南地区的 大部分省区 。微小牛蜱作为一种外寄生虫和一些病原的传播媒介 ,它本身和它传播的多种疾病给人类和动物生产造成了极大的危害 ,例如莱姆病 、埃里克 体病和人无形体病等 ,动物性疾病有巴贝斯虫病 、泰 勒虫病等 。现在对蜱的防控主要应用杀虫剂灭杀 ,但蜱抗药性 、食品和环境污染问题使药物灭杀方法 的应用越来越谨慎 。因此 ,人们对蜱的防控转移到 免疫学方法 ,1989 年微小牛蜱 b m86 基因的发现 1 , 在抗蜱疫苗的研究中具有突出的意义 ,b m86

4、疫苗在 国外已经商品化并在澳大利亚和古巴广泛应用 223 ,在微小牛蜱的防治上发挥了重要作用 。随着抗蜱疫 苗研究的深入 ,拥有良好抗原性的蛋白不断被发现 。 ri di ng j a 等 4 发现微小牛蜱 b m91 抗原 ,澳大利亚 的 pet e r 等将 b m91 抗原与 b m86 抗原的联合免疫 , 免疫效 果 明 显 优 于 b m86 单 独 免 疫 效 果 5 。co n2suelo 等在肩板硬蜱幼虫的 cdn a 文库中发现 4d8 基因 ,用 4d8 基因表达的蛋白免疫动物表明 4d8 表 达蛋白对蜱的吸血与产卵都有明显的影响 6 。相关 研究表明 4d8 基因存在于多

5、种蜱内 , rn a 干扰试验 表明该基因对蜱的消化和生殖系统具有一定 的作用 7 。本研究对微小牛蜱的 4d8 基因进行克隆表达 , 并对表达产物进行免疫原性分析 ,为该基因在微小 牛蜱疫苗的研究提供依据 。材料与方法11 . 1 材料1 . 1 . 1 微小牛蜱 采自四川省甘孜州黄牛体表的 微小牛蜱饱血雌蜱 ,经传代培养成饥饿幼蜱 。1 . 1 . 2 载体 、菌株和血清 大肠埃希菌 j m109 购 自 宝 生 物 工 程 ( 大 连 ) 有 限 公 司 ; 表 达 载 体 p gex4 t21 、大肠埃希菌 bl 21 购自 a mer sha m 公 司 ,牛抗微小牛蜱唾液腺 、肠道

6、和卵巢血清为本试验 自行制备 。trizol 总 rn a 提取试剂盒购自 in21 . 1 . 3试剂vit ro ge n 公 司 ; u niver sal ri bo clo ne cdn a 合成 试剂盒购自 pro me ga 公司 ; 菌种 bl 21 及原核表达载 体 p gex24 t21 均由中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃省寄生虫重点实验室保存 ;p gem2t ea sy 克 隆载体 、限制性内切酶 eco r 、n ot 、t4 dn a 连 接酶 、pcr 试剂盒 、dn a 凝胶回收试剂盒 、dn a 质 粒 提 取 试 剂 盒 、dn a ma r ke r (

7、 dl 2 000 和 dl 15 000) 、异丙基22d2硫代半乳糖苷 ( ip t g) 均购 自宝生物工程 (大连) 有限公司 。1 . 2 方法1 . 2 . 1微小 牛蜱 4d8 基 因 表达 引物 设 计根 据ge nba n k 公布的 4d8 基因序列 ,运用 oligo ( d t) 软件设计并合成以下引物 :上 游 引 物 : 52 c g ga a t tc a t gg c t t gt gc g a ca t ta a g c gga2 3收稿日期 :2009205218基金项目 :国家自然科技资源共享平台项目 (2005d ka21100) ;国家“十一五”科技支

8、撑计划项目 (2007bad40b06)作者简介 :刘军龙 (1980 - ) ,男 ,河北保定人 ,研究实习员 ,硕士 ,主要从事蜱及蜱传病学研究 。 3 通讯作者3下游 引 物 : 52 t gg c ggcc g c t ta c ga c中分别加入 5 sd s 上样缓冲液混匀后煮沸 5 mi n ,稍加离心取 10 l 进行 sd s2pa ge 检测 。电泳结 束后 ,用考马斯亮蓝 g2250 染色约 2 h 。脱色后观察 结果 ,并与蛋白质 ma r ke r 比较 ,计算目的蛋白分子 质量 。1 . 2 . 4 . 2 we st er n blo t 检测 将表达产物经 sd

9、 s2pa ge 电泳分离并转印到 n c 膜上 。取下 n c 膜 ,置 于含 50 g/ l 明胶的 tb s t 中封闭 2 h 后 , 用 tb s t 漂洗 3 次 ,每次 10 mi n 。将膜置于 1 100 稀释的兔 抗微小牛蜱阳性血清中 , 37 振摇孵育 2 h 。同前漂洗后加入 1 10 000 稀释的碱性磷酸酶标记的羊 抗兔 ig g 中 ,37 轻微振摇孵育 2 h 。同前漂洗后 置显色液 ( 含 nb t 和 b cip 各 4 l / ml ) 中显色 , 当绛紫色阳性带出现时用蒸馏水漂洗终止 。同时用 未经微小牛蜱感染的家兔血清作阴性对照 。a a a t gg

10、c t gggc g ta gca t gc t ca g cca t t t gt c gta a g2 3a c gcc上下游引 物 中 下 划 线 部 分 分 别 为eco r 和n ot 酶切位点宝生物工程 (大连) 有限公司合成 。1 . 2 . 2 目的基因的克隆和原核表达1 . 2 . 2 . 1 目的基因的克隆 应用 trizol 方法提取 微小牛蜱幼 蜱总 r rn a , 称 取 100 mg 微 小牛 蜱幼 蜱 ,加入 1 ml trizol 试剂研磨后离心 ,取上清液用 氯仿抽提 ,异丙醇沉淀 , 再用 750 ml / l 乙醇洗涤 ,最 后 将 提 取 的 rn a

11、 重 溶 于 无 rn a se 水 中 , 置- 70 保存 。以微小牛蜱总 rn a 为模板 ,利用 u2niver sal ri bo clo ne cdn a 合 成 试 剂 盒 合 成 的 cd2n a 。并以此 cdn a 为模板 ,利用表达引物扩增目的 基因 。反应体系为 50 l : 灭菌去离子水 37 . 7 l , dn t p 混合 物 ( 2 . 5 mmol/ l ) 4 l , 上 、下游 引物 (10 p mol/l ) 各 1 l , 10 pcr 缓冲液 5 l ,模 板 1 l , taq dn a 聚合酶 0 . 3 l 。扩增程序为 :96 3 mi n

12、预变性 ; 92 1 mi n 、58 1 mi n 、72 1 mi n ,35 个循环 ;72 延伸 10 mi n 。扩增结束后 ,取 5 l 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测 。1 . 2 . 2 . 2 pcr 产物的连接与鉴定 用胶回收试剂 盒回收 pcr 产物 。把回收产物与 p gex4 t21 载体 用 eco r 和 n ot 酶 37 酶切 5 h ,利用 dn a 凝 胶回收试剂盒回收目的基因片段和线性化载 体片段 ,并将此带有黏性末端的目的基因与线性化载体 连接 ,构建表达载体 。将连接产物转化 bl 21 感受态 细胞 ,挑取单菌落增菌提取质粒 ,再次进行 pcr 和 酶

13、切鉴 定 。重 组 质 粒 命 名 为 p gex24 t2124d8 。鉴 定正确的阳性菌液进行测序分析 。1 . 2 . 3重组菌的诱导表达及表达产物的电泳分析 用 p gex24 t2124d8 质粒转化 e. col ibl 21 感受态 细胞 ,挑单个菌落接种于含氨苄青霉素的 lb 液体 培养基中 ,37 培养过夜 。按 1 50 的比例将此菌 液接 种 于 30 ml 的 2 yt 诱 导 培 养 基 中 ( 含50 g/ ml 氨苄青霉素) 37 培养 3 h , 然后 加入 ip t g 至终浓度 1 mmol/ l 诱导 4 h , 12 000 r/ mi n 离心 3 m

14、i n 后收集菌体进行表达产物的检测 ,并以 空载体在相同的条件下诱导作为对照 。1 . 2 . 4 表达产物的检测结果22 . 14d8 基因的获得pcr 方法从微小牛蜱幼蜱 cda n 中扩增得到480 bp 左右的条带 ,与预期结果一致 (图 1) 。m. dn a 标准 dl 2 000 ;14 . pcr 扩增产物m. dn a ma r ker dl 2 000 ;124 . pcr p ro duct s图 1 pcr 产物电泳结果fig . 1 elect rop ho re si s resul t of pcr p ro duct s2 . 2微小牛蜱 4d8 基因的分析4

15、d8 基因测序结果由 486 个核苷酸碱基组成 , 编码 162 个氨基酸 ,氨基酸分子质量为 27 k u 。测序 所得的 4d8 基因序列与国外已发表的微小牛蜱 4d8 基因序列同源性分别为 98 % , 98 . 2 % , 编码氨基酸 的同源性为 99 . 3 % 。2 . 34d8 基因表达产物的 sds2pa ge 检测和 west2ern blot 分析2 . 3 . 1sd s2pa ge 电泳检测电泳检测结果表明 ,4d8 基因表达的蛋白与 p gex24 t21 载体共同表达45 k u 的融合蛋白 ,通过对菌体超声破碎的沉淀和上1 . 2 . 4 . 1sd s2pa g

16、e 检测将上述所得菌体重悬于 pb s (p h 7 . 4) 中 , 反复冻融数次后经超声裂解 ,在 4 以 12 000 r/ mi n 离心 10 mi n ,分离细菌裂解 液上清液备用 。将沉淀混悬在 9 倍体积含 pb s 的 缓冲液中 。向上述细菌裂解液上清和洗涤所得沉淀清电泳检测 , 表明此融合蛋 白以 包 涵体 形式 存在 。根据 p gex24 t21 载体的谷胱甘肽 ( gs t) 标签 ,用谷胱甘肽的亲和层析 纯化 融合 蛋白 p gex24 t2124d813刘军龙等 :微小牛蜱 4d8 基因原核表达及免疫原性分析(图 2) 。2 . 3 . 2 表达产物的 we st

17、 e r n blo t 检测 表达产物 经 sd s2pa ge 电泳后转移至 n c 膜上进行免疫印 迹分析 。结果显示 ,表达产物可与兔抗微小牛蜱唾液腺 、肠道和卵巢的血清反应 ,表明该融合蛋白具有抗原性 ,同时表明 4d8 基因在微小牛蜱的唾液腺 、肠 道和卵巢都有分布 (图 3) 。m . 蛋白分子质量标准 ;1 . 菌体超声沉淀 ; 2 . 菌体超声上清 ;3 . 纯化的融合蛋白m . 蛋白分子质量标准 ;1 . 重组蛋白与兔抗蜱唾液腺血清作用 ;2 . 重组蛋白与兔抗蜱卵巢血清作用 ; 3 . 重组蛋白与兔抗蜱肠道 血清作用 ;4 . 重组蛋白与阴性兔血清作用m . prot e

18、i n molecula r wei ght ma r ker ; 1 . reco mbi na nt p ro t ei n react ed wit h t he ra bbit a nti tick salivar y gland ser u m ;2 . reco mbi na nt p ro t ei n react ed wit h t he ra bbit a nti tick o va r y ser u m ;3 . reco mbi na nt p ro t ei n react ed wit h t he ra bbit a nti tick gut ser u m ;

19、4 . reco mbi nant p ro t ei n react ed wit h t he negative ser um图 3 表达产物的免疫印迹分析fi g. 3 we st er n2blo t a nal ysi s of 4d8 reco mbi nant p rot ei nm . pro t ei n molecular weight ma r ker ;1 . precipit atio n of ult ra so nicbact eria ;2 . super nat a nt of ult ra so nic bact eria ;3 . purified p r

20、o t ei n图 2 表达产物的 sds2pa ge 分析fig. 3 sds2pa ge a nal ysi s of t he exp re ssed p ro duct基因沉默导致变异革蜱的唾液腺 、肠道和生殖系统发育不良 。鉴于 4d8 基因在蜱吸血和产卵过程中发 挥的作用 ,会影响到下一代蜱的发育生长 , de la fu2e nt e j 等将 4d8 基因命名为 subole si n 。饱 血雌 蜱4d8 基因的沉默 , 也会导致微小牛蜱 、肩板硬蜱 、变讨论自从微小牛蜱 b m86 重组蛋白成功用于微小牛 蜱防控以来 ,蜱疫苗的研制就集中到了蜱保护性抗 原的筛选工作上 。很

21、多具有良好保护性的抗原相继 被发现 ,例 如 微 小 牛 蜱 b m91 、b m95 蛋 白 和 b m t1 抑肽酶 829 ,具尾扇头蜱 64 p 胶结蛋白 10 ,长角血蜱 p 29 蛋白和 hl 34 蛋白等等 11212 。这些蛋白在蜱的 生长过程中发挥着不同作用 ,它们的发现为蜱疫苗 的研制奠定良好的基础 。但这些蛋白存在的位置一 定 ,而且在蜱的生长过程中之发挥某种特定的作用 , 为加强免疫效果 ,很多情况下是采用多种蛋白联合 免疫达到加强免疫效果的目的 。4d8 基因在 2005 年 首次 在肩 板硬 蜱 的 cdn a 文库中筛选出来 ,通过 4d8 基因表达蛋白的免疫试

22、验 ,该蛋白对肩板硬蜱的产卵量有明显影响 。de lafue nt e j 证实 4d8 基 因在 多种 蜱 体 内 存 在 。通 过 rn a 干扰试验使 4d8 基因沉默 ,试验结果表明肩板 硬蜱 、变异革蜱 、边缘革蜱 、美洲钝缘蜱和血红扇头 蜱饱血雌蜱的重量 , 产卵量和活力 都 有影 响 。4d83 13214 异革蜱 和美 洲 钝 眼 蜱 的 卵 发 育 不 良。赵 金 国 15 等 成功获得小亚璃眼蜱 4d8 基因 ,并进行了原核表达 ,免疫印迹结果表明小亚璃眼蜱 4d8 基因表达 产物可与半饱血小亚璃眼蜱唾液腺抗原免疫兔血清 反应 。本试验成功获得微小牛蜱 4d8 基因 ,同源

23、性分析表明 ,获得的 4d8 基因同国外已报道的微小牛蜱4d8 基因同源性在 97 . 7 %以上 ,表达蛋白的同源性 为 99 . 3 % ,说明 4d8 基因种内具有较高保守性 。通 过 we st er n blo t 对重组蛋白分析表明 , 重组蛋白具有很好的抗原性 ,能够与兔抗微小牛蜱的唾液腺 、肠道和卵巢的血清反应 ,说明该蛋白同时存在于微小 牛蜱多个位置 ,并可能参加微小牛蜱的叮咬 、消化和生殖过程 。该结果与 de la fue nt e j 研究结果一致 ,为 4d8 在微小牛蜱疫苗的研制奠定了一定的基础 。参考文献 :si st a nt to i mmunizatio n

24、 wit h bm86 i n cat tle vacci nat ed wit h t he reco mbi na nt anti gen b m95 i solat ed f ro m t he cat tle tick , boo p hi l us m ic ro p l us j . vacci ne ,2000 ,18 :2275222787 . 9 a ndreot ti r , go mes a , malavazi2piza k c , et al . b m ti a nti2gen s i nduce a bo vi ne p ro t ective i mmune r

25、e spo n se agai nstboo p hi l us m ic ro p l us tick j . int immunop ha r macol , 2002 , 2 :5572563 . 1 willadsen p , ridi ng g a , mc kenna r v , et al . clo ni ng a nd exp re ssio n of a p rot ective a ntigen f ro m t he cat tle tick boo p hi l us mic ro p l us j . proc natl acad sci u sa , 1989 ,

26、 86 : 965729661 .ro drguez m , rubiera r , penichet m , et al . high level ex2 p re ssio n of t he boo p hi l us m ic ro p l us bm86 a ntigen i n t he yea st pic hi a p ast oris fo r mi ng highl y i mmuno genic p a rticle s fo r cat t lej . j biot echnol ,1994 ,33 :1352146 .phillip j s , ber nie v m

27、 , do nal d r j s , et al . chro mato grap hy a nd generatio n of sp ecific a nti sera to synt hetic p ep tides f ro m a p rot ective boo p hi l us m ic ro p l us a ntigen j . j chro mato grap hy a ,1990 , 512 :1892202 .ridi ng g a , j a r mey j , mc kenna r v ,et al . a p ro t ective co n2cealed a

28、ntigen f ro m boo p hi l us m ic ro p l us : p urificatio n , locali sa2tio n a nd po ssi ble f unctio n j . j immunol , 1994 , 153 : 515825166 .willadsen p , smit h d , co bo n g s. et al . co mp a rative vacci na2 tio n of cat t le agai n st boo p hi l us m ic ro p l us wit h reco mbi na nt a n2 t

29、igen bm86 alo ne o r i n co mbi natio n wit h reco mbi na nt bm91 j . pa ra sit e immunol , 1996 , 18 : 2412246 .al maza n c , koca n k m , blo ui n e f , et al . vacci natio n wit h reco mbi nant tick a ntigens o r t he co nt rol of i x o des sca p ul a ris a2 dul t i nf e st atio nsj . vacci ne ,2

30、005 , 23 :529425298 .de la fuent e j , al maza n c , bla s2machado u , et al . the tickp rot ective a nti gen , 4d8 , i s a co n ser ved p ro t ei n i nvol ved i n mo dulatio n of tick bloo d i nge stio n a nd rep ro ductio n j . vac2 ci ne , 2006 , 24 :408224095 .ga rca j c , mo nt ero c , redo ndo

31、 m , et al . co nt rol of ticks re2 2 10 tri mnell a r , hail s r s , n ut t all p a . dual actio n ectop a ra2 sit e vacci ne t a r geti ng expo sed a nd co ncealed a ntigen sj . vacci ne ,2002 ,20 : 356023568 .mulenga a , sugi mo to c , sa ko y , et al . molecula r charact er2izatio n of a hae m a

32、 p h y s al is l on g icornis tick saliva r y gla nd2a s2 sociat ed 292kilo dal to n p rot ei n a nd it s eff ect a s a vacci ne agai nst tick i nf e st atio n i n rabbit s j . inf ect immun , 1999 , 67 : 165221658 .tsuda a , mulenga a , sugi mo to c , et al . cdn a clo ni ng , cha ract erizatio n a

33、 nd vacci ne eff ect anal ysi s of hae m a p h y s al isl on g icornis tick saliva p rot ei ns j . vacci ne , 2001 , 19 : 428724296 .nij hof a m , tao ufi k a ,de la fuent e j ,et al . gene silenci ng of t he tick p rot ective anti gen s , bm86 , bm91 a nd subole si n , i n t he o ne2ho st tick boo

34、p hi l us m i c ro p l us by rn a i nt erf erence j . int j pa ra sitol ,2007 ,37 : 6532662 .kocan k m , manza no2ro ma n r , de la fuent e j . tra nso va rialsilenci ng of t he subole si n gene i n t hree2ho st i xo did tick specie s af t er i njectio n of replet e f emale s wit h subolesi n dsrn a

35、 j . pa ra sitol re s , 2007 ,100 :141121415 .赵金国 ,曾巧英 ,殷 宏 ,等. 小亚璃眼蜱 4d8 基因的克隆与原核表达j . 中国兽医科学 ,2008 ,38 ( 6) :4612464 . 3 11 4 12 5 13 6 14 7 15 8 prokaryot ic expression andimmunogen ic ity anal ysis of4d8 gene ofb oo p hi l us m i c ro p l usl iu j un2lo ng , gu a n gui2qua n , l i yo u2qua n , ma mi2li ng , l iu ai2ho ng ,r en qiao2yu n , yin ho ng , l u o j ia n2xu n( ke y l abor at or y o f v et e ri na r y pa rasi t ol o g y o f gans u p rov i nce , ke y l aborat or y o f graz i n g a ni m al d ise