完整版蛋白纯化AKTA操作说明

1、AKTA pure操作说明分子筛层析操作步骤：1. 开机：翻开AKTA pure开关,看指示灯,泵同步泵内有注入液体的声音.2. 翻开系统：翻开电脑：双击 Unicorn 7.0翻开系统,进入log on界面,用户名默认为Default,输入密码：default,点ok键,出现提示对话框,继续点确定,进入系统.注意：进入系 统时会弹出 三个界面：System Control界面, Evaluation界面和 Administration界面.其中system Control界面为主操作窗口,所有的设置选项都是在 该界面下完成： Manual-Execute Manual instruction

2、s-; Evaluation 界面为结果数据查看及处理窗口 ；Administration界面为Unicorn 7.0系统设置界面.3. 洗泵：把A1泵头从20%乙醇中取出,用去离子水冲洗,放入分子筛缓冲液中,在 SystemControl 界面下,点击 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash- 点 开 inlet,选择 A1-Excuse.4. 设置系统参数：设柱压： Alams-alam systerm pressure-high alam- 设置柱压 -Execute ;设流速： Pumps-System flow -设置

3、 system flow 1mL/min -Execute o注意：流速和柱压设置参照“ GE蛋白纯化柱表,不要超出最高限制.5. 装柱子先上后下：接柱子的上面：拧下连接进样阀和检测器之间的线,等进样阀出口有液体流出时,拧开 柱上面线头的螺帽,将它连到进样阀出口；接柱子的下面：去掉柱下端连接的注射器,连上接头,连上一段线,待液体滴出滴出液 体滴到检测器上的连接口的洞里,滴满,将接头连到检测器的连接口里.6. 平衡柱子：分子筛buffer平衡柱子,一般要两个小时左右,盐离子浓度到达5.5%左右.7. 设置系统及收集参数：命 名：先 end-Manual instructions,点击 brows

4、e,弹出 select result name&location 界 面,点开文件夹"defaultHome ",找到文件夹"labdata",点开,选择自己名字 首字母缩写文件夹已创立,在界面下方"name指令框进行命名. 注意：命名时要标明 日期,柱子型号,样品名称.设流速： Pumps-System flow-设流速1 mL/min -Execute ;设柱压： Alams- alam systerm pressure-high alam- 设置柱压-点击 Execute;洗 A 泵：Pumps-Pump A wash-点开 in

5、let,选择 A1-Excuse ;紫外调零：Monitors-Auto zero UV-Execute ;设置收集体积:Fracton collection-peak fractionation-fraction size-设置收集体积-Execute;一般设为1 mL可根据实际情况调整.设置收集水平: Fracton collection-peak fractionation parameters-Start level- 设置起女台 收集水平-Execute.注意：对于初次纯化的蛋白,由于蛋白含量未知,起始水平可设低些, 如10 mAU,预防损失蛋白.8. 上样：冲洗Loop环：取5mL

6、注射器,吸取5 mL分子筛不能有气泡,从进样口注射 2倍 Loop体积的分子筛来清洗Loop环；蛋白样品处理：取出蛋白样品 2 mL, 12000 rpm离心3 min,把上清转移至新的离 心管管,重复一次,以去除沉淀,预防堵塞系统；手动蛋白上样：把蛋白样品转移至注射器内,从进样口把样品注射入 Loop环内； 注意：上样时应小心操作,首先弹出注射器内的气泡,随后稍推注射器,使注射器出口处悬挂一样品液滴别太用力,导致液滴滴落,然后把注射器插入进样口,把蛋白样品推入Loop环中.Inject:点击 Flow path-injection valve- 点开 position 选项-inject-E

7、xecute- 走 2 倍 Loop 体积的分子筛缓冲液；Load:点击 Flow path-injection valve- 点开 position 选项-manual load-Execute , 调回 Load状态.9. 收集目标蛋白：参照标准蛋白曲线,估计样品出峰位置,收集蛋白样品,做好标记,过完后,peak fracstop 900停止收集.10. 20%乙醇平衡柱子：等精氨酸峰出来,离子浓度平衡后,点击pause,进分子筛的buffer的泵头用去离子水洗,放入20%的乙醇中,continue-洗泵A1泵,平衡柱子.20%的乙醇平衡柱子, 一般要两小时左右,盐离子浓度到达0%.11.

8、 收柱子先下后上：调节流速至0.5 mL/min,拧下柱下面的接头,连上注射器,再调流速至1 mL/min ,注射器内吸入3-5 mL 20%乙醇,取下柱上面的接头看是不是往外流液体,由于注射器内 有压力,液体会倒流,盖子内滴满液体,立即拧上盖子,预防进气泡,将进样阀的线接 到检测器上.12. 关闭系统：点击End关闭系统界面,关闭 AKTA pure电源,关电脑.AKTA pure操作说明离子交换蛋白纯化步骤RESOURCE Q/S 1. 开机：翻开AKTA pure开关,看指示灯,泵同步泵内有注入液体的声音.2. 翻开系统：翻开电脑：双击 Unicorn 7.0翻开系统,进入log on界

9、面,用户名默认为 Default,输入密 码：default,点ok键,出现提示对话框,继续点确定,进入系统.注意：进入系统时会弹出三个界面：System Control界面,Evaluation界面和Administration界面.其中system Control界面为主操作窗口,所有的设置选项都是在该界面下完成： Manual-Execute Manual instructions- ; Evaluation 界面为结果数据查看及处理窗口； Administration界面为 Unicorn 7.0系统设置界面.3. 洗泵：点击pause暂停系统-去离子水冲洗 A1,B1进液泵头-分别放

10、入A , B液中；洗 B 泵： 选择 System Control 界面 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash-点开 inlet,选择 B1-Excuse ;洗 A 泵： 选择 System Control 界面 manual-Execute Manual instructions-Pumps-Pump A wash-点开 inlet,选择 A1-Excuse,洗泵结束后调 B 至 100%, 0min-Execute.4. 设置系统参数：设柱压： Alams-alam systerm pressure-high alam-设

11、置最高柱压 -Execute o 设流速： Pumps-System flow-设置 system flow 1 mL/min -execute; 注意：流速和柱压设置参照“ GE蛋白纯化柱表,不要超出最高限制.5. 安装RESOURCE柱先上后下：装离子柱时先拧开离子柱上面, 连上来自进样阀的线, 边拧紧上面边拧松柱下面, 在离 子柱子下端出口连上转接头, 接上一根较短的先并连到检测器上 流出液体,滴满检测 器上的连接口的洞里,再拧紧.6. 平衡 RESOURCE 柱：等 B 液平衡后,点击 Pumps-gradient-Target-调 B 至 0%, 0min-Execute.等平衡后,

12、 记录最高和最低盐离子浓度：离子交换 B液盐离子浓度约为 84%,离子交换 A液盐离 子浓度约为1.7% o7. 设置系统及收集参数：命 名：先 end-Manual instructions,点击 browse,弹出 select result name&location 界面, 点开文件夹"defaultHome ",找到文件夹"labdata",点开,选择自己名字首字 母缩写文件夹已创立,在界面下方"name指令框进行命名. 注意：命名时要标明 日期,柱子型号,样品名称.设流速： Pumps-System flow-设流速1 mL

13、/min -Execute;设柱压： Alams-alam systerm pressure-high alam- 设置柱压 -,点击 Execute;紫外调零：Monitors-Auto zero UV-Execute ;设置收集体积：Fracton collection-peak fractionation-fraction size-设置收集体积 -Execute；一般设为1 mL 可根据实际情况调整.设置收集水平:Fracton collection-peak fractionation parameters-Start level- 设置起女台收集水平-Execute.注意：对于初次

14、纯化的蛋白,由于蛋白含量未知,起始水平可设低些, 如10 mAU ,预防损失蛋白.8. 上样：冲洗Loop环：取5 mL注射器,吸取5 mL分子筛不能有气泡,从进样口注射 2倍 Loop体积的分子筛来清洗Loop环；蛋白样品处理：取出蛋白样品 2 mL, 12000 rpm离心3 min,把上清转移至新的离心管管,重复一次,以去除沉淀,预防堵塞系统；手动蛋白上样：把蛋白样品转移至注射器内,从进样口把样品注射入Loop环内；注意：上样时应小心操作,首先弹出注射器内的气泡,随后稍推注射器,使注射器出口处悬挂一样品液滴别太用力,导致液滴滴落,然后把注射器插入进样口,把蛋白样品推入Loop环中.Inj

15、ect:点击 Flow path-injection valve-点开 position 选项-injectexecute-走 2 倍Loop体积的分子筛缓冲液；Load:等流穿峰出来后,点击Flow path-injection valve-,点开 position 选项-manualload-Execute,调回 Load 状态.注意：流穿峰蛋白先别丢弃,它有可能是样品没有挂上柱子而直接流出来的目标蛋白.9. 洗脱目的蛋白：Pumps-Gradient target 50% , length 50 min 可调-Execute ,自离子柱上洗脱结合的 蛋白10. 收集目标蛋白：收集洗脱下来的蛋白样品,做好标记,过完后,peak fracstop 900停止收集.11. B液平衡离子柱：Pumps-Gradient target 50% , length 0 min- Execute ,至盐离子浓度到达最高且平衡.如继续纯化其他蛋白样品：要用A液再平衡后再上样,步骤同上1-11.如不再纯化其他蛋白样品：点击pause暂停系统-