生理指标的测定1

1、一叶绿素的测定-丙酮乙醇提取比色法参照张宪政(1986)的方法：1、先配制乙醇：丙酮=1:1的混合溶液(80%:80%)装入棕色瓶中保存。2、取叶片0.5-1g剪碎，放入50的培养瓶中，再加入 20的配制好的上述混合液，盖上瓶盖，置于 冷库避光存放36 h(直到叶片泛白)，其间摇晃2-3次，使叶绿素充分溶解在混合液中。3、 避光保存36 h后，过滤混合溶液，以提取液作为对照， 在紫外分光光度计下分别测定 处的吸光值。4、计算公式652 、 66310C和645/50叶绿素 a 的含量二(12.7* 663-2.69* 645)/50+(22.9* 663-4.68* 645)叶绿素b的含量二(

2、22.9* 663-4.68* 645) /50总叶绿素的含量二(20.2* 645+8.02* 663)*1000*W或总叶绿素的含量=(A52 /34.5)*1000*W ( 叶绿素a和叶绿素b在652下有相同的吸光系数，为34.5)其中V为提取液体积，W为叶片重量，叶绿素含量单位为().二、维生素C含量的测定李合生，2000年，比色法：常规测定抗坏血酸的方法是采用2, 6二氯酚靛酚滴定法，但因某些叶片中花青素量较高，当用酸提取时呈红色，因而无法滴定。本实验采用二甲苯萃取比色法，测不受花青素的干扰。1、 原理：向一定量提取液中加入过量的2, 6 二氯酚靛酚染料溶液与维生素 C作用后，多余染

3、料用二甲苯萃取比色。待测液中抗坏血酸的含量与二甲苯萃取的颜色呈线性负相关，即待测液中抗坏血酸含量越多，未被还愿的染料就越少，二甲苯萃取的颜色也就越浅。由于水溶性的花青素不溶于二甲苯，因而不影响测定结果。2、 试剂(按照定容100计算)(1) 1%草酸，称取1.4g ；2%草酸，称取2.8g ；30%硫酸锌，称取53.4g ；15%亚铁氰化钾，称取17.2g ；(5) 染料溶液：称取1002，6 二氯酚靛酚和82碳酸氢钠溶于约 60热水中，过滤定容至 100容量瓶中，倒入棕色试剂瓶存放于冰箱内。使用时稀释4倍，此溶液每毫升约相当于0.1的维生素Co(6) 抗坏血酸标准溶液：精确称取100分析纯抗

4、坏血酸，溶于1%酸，定容至100,再从中吸取5,用1%草酸再稀释至100,稀释后每毫升含抗坏血酸0.05 (标准溶液在使用前临时配置)(7) 二甲苯，分析纯(本法使用过的二甲苯可用20中和后，蒸馏回收)。3、实验步骤(1)标准曲线去具塞大试管6个，分别吸取抗坏血酸标准溶液0、1、2、2.5、3、4，用1%草酸补充至4,各管中抗坏血酸含量相应为 0、0.05、0.10、0.125、0.15、0.20。各管中加入染料溶液2，随即加入二甲苯 5,迅速摇动约0.5,静置后二甲苯与水层分离，将上层二甲苯萃取液轻轻倒入比色杯，在500波长下测定吸光度。以二甲苯作空白调零，求得标准系列抗坏血酸毫克数与相应的

5、吸光度值的回归方程。样品提取2g样品放置研钵中，加入 32%草酸研钵130%硫酸锌，1%草酸定容至刻度，摇匀后过滤到干净小取新鲜蔬菜洗净，擦干，在玻板上用不锈钢刀切碎混匀。称取至匀浆，然后将匀浆倒置 100容量瓶中，残渣用1%草酸冲洗，洗液一并倒置容量瓶中，加入 摇动容量瓶，再加入115%亚铁氯化钾，以除去脂溶性色素，再用 烧杯中。（3）测定4的可用1%1酸补足至4）至具塞大试管取上述提取液4（若抗坏血酸含量高，可适当减少取量，不足中，依次加入染料2、二甲苯5，按照标准曲线的方法测定吸光度。（4）计算根据测定液的吸光度值，按回归方程计算出抗坏血酸的毫克数，然后按下式计算样品中的抗坏血酸的 含量

6、，以每百克鲜样含抗坏血酸毫克数（）表示。每克鲜样的抗坏血酸含量*（W*）（）W为样品鲜重g ;为测定用体积量。式中；X为4提取液中含抗坏血酸的毫克数；为提取液总体积；三、蛋白质的测定一考马斯亮蓝法1、称取10牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100，制成100卩g/的原液。称取100考马斯亮蓝G 250， 溶于50 90 %乙醇中，加入85 %（ m/ v）的磷酸100，最后用蒸馏水定容到 1000。标准曲线的制作：取 6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。操作项目管号123456标准蛋白质溶液()00.20.40. 60.81.0蒸馏水（）1.00.80.60.40.20250试剂（）各5蛋白

7、质含量（卩g)020406080100盖上塞子，摇匀。放置 2后在595波长下比色测定（比色应在 I h内完成）。以牛血清白蛋白含量（卩g） 为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。2、称取样品0.51.0 g，放入研钵中，加入 5蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000 r /，10 ），将上清液倒入10容量瓶，再向残渣中加入2蒸馏水，悬浮后再离心10，合并上清液，定客至刻度。另取1支具塞试管，准确加入 0样品提取液，再加入 0.9蒸馏水，5考马斯亮蓝G- 250试剂，充分混合，放置 2后，以标准曲线1号试管做参比，在595波长下比色，记录吸光度。根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得

8、相应的蛋白质含量（卩g），按下式计算：样品蛋白质含量（卩g/g鲜重）=（查得的蛋白质含量（卩g）x提取液总体积（）/（样品鲜重（g）X测定时取用提取液的体积（）四、可溶性糖的测定一蒽酮比色法1、原理：糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖 的定量测定。该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测 所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖 而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量， 实际上是

9、溶液中全部可溶性碳水化合物总量。 在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因 此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入 反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较 浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖 类时，则可避免此种误差。糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为620 ，故在此波长下进行比色。2、试剂葡萄糖标准溶液（100 g

10、 ）：准确称取100 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至10 倍（100 g ）1.0 g 蒽酮，溶于80%浓硫酸（将98%浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用23周。买100，使用时再稀释 蒽酮试剂：称取到蒸馏水中）100098酸进行稀释。经查 两种方法配制：470 处有80%硫酸密度为：1.73，98%硫酸密度为1.84。1、取较少量水加入 98%硫酸，并不断搅拌，待温度降到室温，测定稀释后的密度，如果密度等 于1.73，就说明硫酸的浓度为 80% 了，密度偏高就将混合后的酸加入少量水中，密度偏低就再加 些98%硫酸，重复该动作直到密度等于1.

11、73。2、 以配制1000为例，80%的硫酸重量为：1000*1.73=1730g ，纯硫酸重量为：1730*801384g ， 折算成98%酸为：1384/0.98=1412g ，也就是说配制1000 80%的硫酸，98%硫酸的用量为1412g， 水为1730-1412=318g。因此称取水318g加入98%硫酸1412g，并不断搅拌待溶液冷却到室温时再加入少量水直至总重量为1730g （因为硫酸稀释后会放热，部分水会被蒸发）。3、实验步骤（1）标准曲线制作 取6支大试管，从05分别编号，按表24-1加入各试剂。表24-1蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量试剂管号012345100 g葡萄

12、糖溶液（）00.20.40.60.81.0蒸馏水（）1.00.80.60.40.20蒽酮试剂（）5.05.05.05.05.05.0匍萄糖量（g g ）020406080100将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10 ，取出冷却，在620 波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（gg ）为横坐标绘制标准曲线。（2）样品中可溶性糖的提取 称取剪碎混匀的新鲜样品 0.51.0 g （或干样粉末5100 ）， 放入大试管中，加入15 蒸馏水，在沸水浴中煮沸 30 ，取出冷却，过滤入25 容量瓶中，用 蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。 取提取液（茎0.1、叶0.5 ）于试管中，用水补

13、充至 1,加入5蒽酮，置沸水中煮沸10,冷却至 室温测定（4） 计算 可溶性糖含量.100% A为提取液稀释后的体积（1）; C为提取液的含糖量（卩）W为植物鲜重量（g）七、过氧化物酶活性的测定（）过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等 都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植 物体内代谢的变化。原理：在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在最大吸收，可用分光光度计测量470 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。（在一定的时间内，反应时间跟值成正相关性）二、实验材料

14、、试剂与仪器设备（一）实验材料 马铃薯块茎。（二）试剂1 . 100 / L磷酸缓冲液6.0 （见附录）。于烧杯中，加入愈创木酚28 g l ，于磁力搅拌器上30 %过氧化氢19 gl ，混合均匀，保存于冰箱中。2 .反应混合液：100 / L磷酸缓冲液（6.0 ） 50加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入（三）仪器设备分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 容量瓶，吸管，离心机。三、实验步骤1 .称取植物材料1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以4000 r / 离心15 ，上清液转入100 容量瓶中，残渣再用 5 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至

15、刻度，贮于低温下备用。2 .取光径1 比色杯2只，于1只中加入反应混合液 3 和磷酸缓冲液1 ，作为对照，另1只中加入 反应混合液3 和上述酶液1 （如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长470 下吸光度值，每隔1读数一次。四、结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以A 470 / g （鲜重）表示之。也可以用每 内A 470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U ）表示。过氧化物酶活性（g ）=式中： A 470 反应时间内吸光度的变化。W 植物鲜重，g。V T 提取酶液总体积，。V s 测定时取用酶液体积，。t 反应时间,超氧化物歧化酶（）活性的测定

16、【实验原理】是含金属辅基的酶，它催化以下反应:0202 2H202+02由于超氧阴离子自由基 02-寿命短，不稳定，不易直接测定活性，而采用间接的方法。目前常用的方法有3种，包括氮蓝四唑（）光化还原法，邻苯三酚自氧化法，化学发光法。本实验主要介绍光化还原法，其原理是：氮蓝四唑在蛋氨酸和核黄素存在条件下，照光后发生光化还原反应 而生成蓝色甲腙，蓝色甲腙在560处有最大光吸收。能抑制的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。抑制氯化硝基四氮唑蓝（）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可被氧化物质存在的条 件下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易在氧化而产生氧气，可将还原为蓝

17、色的贾（月+赞）后者在蓝色甲腙在 560处有最大光吸收。由于可清除氧气，因此抑制了甲腙的形成。于是光还原反应 后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低。试剂：1.50m 7.8 的磷酸缓冲液（）。含0.1m2.220m甲硫氨酸：称3.2824g甲硫氨酸,用50m 7.8的磷酸缓冲液定溶至100 （现配现用）。3.1.25m 氯化硝基四氮唑蓝（）溶液（现配）：称 0.102g,用50m 7.8的磷酸缓冲液（）溶解定容至100. 4.0.033m 核黄素：称2.52用溶解定容至200 （遮光保存）。【实验步骤】1. 酶液制备称取植物组织0.5g先加入2.5，研磨匀浆后，再加入2.5混匀，4C下1000

18、0离心15上清液即为粗酶液。取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。2. 酶活性测定取10小烧杯7只,3只测定样品,4只作为对照，试剂用量（）终浓度（比色时）50m()4.05220m0.313m1.25m0.375 g0.033m核黄素0.32.0 g酶液0.05对照以缓冲液代替酶液总体积5.0按下表加入试计：将上述试剂混匀后，1只对照烧杯至于暗处，另3只对照烧杯和样品一起置于 4000日光灯下反应20 （要求 各管受光一致，温度高时时间缩短，温度低时可适当延长）。最后在560处测定反应液的光密度。以不照光的对照烧杯作参比，分别测定其他各管的光密度。3.蛋白含量的测定步骤1的上清液经适当稀释

19、后用考马斯亮蓝250法测定蛋白含量.【实验结果及计算】活性单位是以抑制光化还原的 50%为一个酶活性单位表示。可按下式计算活性：总活性=比活力总活性/蛋白质总浓度式中：总活性以，比活力单位以 蛋白表示 为对照杯（光照）的光吸收值为样品的光吸收值为样液总体积1为测定时样品用量为样重g.过氧化物酶（）活性的测定【实验原理】植物体内的黄素氧化酶类代谢产物常包含H202，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中酶等。H202的积累可导致破坏性的氧化作用。过氧化氢酶（）、过氧化物酶（）是清除H202的重要保护酶,能将H202分解为02和H20,从而使机体免受H202的毒害作用。其活性与植物的抗逆性密切相关。

20、（）催化如下反应：的葡萄糖氧化2 H202T2 H20+ 02本实验通过测定H202的减少量来测定的活性。在H202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚。可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。【试剂药品1.50m 7.0 的磷酸缓冲液2.0.3% H202: 吸 0.5 30% H202 加入 7.0的磷酸缓冲液至503.0.2% 愈创木酚：秤0.2g愈创木酚加入【实验步骤】酶液的制备7.0的磷酸缓冲液至1001. 称取叶片0.25g ，加入5倍量的（）离心15取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。2. 活性的测定7.0的冰浴研磨15000在3的反应体系中，包括 0.3% H2021, H20 1.95,启动反应，测定波长240处的降低速度。将