科研计划书-媛媛

1、张媛媛 122011000038 科研计划书项目名称: 15d-PGJ2抑制单核/巨噬细胞株的生物活性及作用机制的探讨研究类型：联合攻关（）重点支持（）自主创新与普及 推广（）项目范围：指南项目（）招标项目（）常规项目（）青年项目（） 申 请 者：张媛媛 申请单位：基础医学院单位归属：首都医科大学通讯地址：北京市丰台区右安门外西头条10号首都医科大学邮政编码：100069单位电话子邮箱： liuyuexi. 一、 基本信息：项目信息中文题目 15d-PGJ2抑制单核/巨噬细胞株的生物活性及作用机制的探讨英文题目学科1细胞生物学学科2分子生物学申请经费XX万元起止年月

2、20121201412申请者信息姓名张媛媛性别女出生年月民族汉学位硕士在读职称职 务身份证号主要研究领域肝纤维化研究电话手机号码 电子邮箱 合作单位信息单 位 名 称代 码首都医科大学基础医学院 项目摘要（限400字）：肝纤维化是多种病因所致的慢性肝病共有的病理过程，其主要病理特征是以胶原为主的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）在肝脏内的过量沉积。肝脏肌成纤维细胞（hepatic myofibroblasts, hMF）是合成和分泌 ECM 的主要细胞，在肝纤维化发生过程中起着决定性的作用。最近，骨髓来源的肌成纤维细胞颇受关注，然而对于它们在体内的迁移机制却知之甚

3、少。鞘磷脂的代谢中间产物磷酸鞘胺醇（sphingosine 1-phosphate, S1P）作为细胞迁移的重要调节器，发挥着重要的生物学功能。本研究结合体内和体外实验，旨在证实在肝纤维化发生过程中骨髓间充质干细胞可向肝脏迁移分化为 hMF，并以 S1P 为靶分子，探讨其介导骨髓间充质干细胞向受损肝脏归巢的作用。ICR 小鼠经射线照射后通过尾静脉移植带有绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）的全骨髓细胞或骨髓间充质干细胞，4周完成骨髓重建后分别以 CCl4 和 BDL 制成肝纤维化模型。在 1 天、3 天、2 周、4 周和 6周时处死小

4、鼠，取肝组织应用免疫荧光染色的方法鉴定并统计骨髓来源的 hMF。同时，用高效液相色谱的方法测定纤维化肝组织和血清中 S1P 的含量，用 Western blot 和 real-time RT-PCR 的方法分别检测与 S1P 代谢相关酶的蛋白和 mRNA 水平，以及肝组织中 S1P 特异受体的表达变化。体外实验：应用 Boyden Chamber 培养方法检测 S1P 对骨髓间充质干细胞迁移的作用。同时，采用 S1P 受体拮抗剂预处理细胞，鉴定参与 S1P 介导骨髓间充质干细胞迁移的受体类型。1骨髓间充质干细胞在肝纤维化模型小鼠体内可迁移至肝脏，并在受损的肝组织内分化为 hMF；2纤维化肝组织

5、和血清中 S1P 的含量显著增加，而骨髓中 S1P 的含量无明显变化。此外，纤维化肝组织中与 S1P 代谢相关的鞘胺醇激酶1（sphingosine kinase 1, SphK1）mRNA 表达上调，其活性也增强，S1P 磷酸水解酶（S1P phosphatase）以及裂解酶（S1P lyase mRNA）没有明显变化；3S1P 在体外明显刺激了骨髓间充质干细胞的迁移，呈剂量依赖性，受体 S1P3参与了这一过程；4体内实验中，受体S1P3 的拮抗剂Suramin 明显抑制了骨髓细胞向受损肝脏的归巢；5转化生长因子b1（TGF-b1）在体外能诱导骨髓间充质干细胞向 hMF 分化。结论：S1P/

6、S1P3 信号介导了骨髓间充质干细胞向受损肝脏的归巢，参与了肝纤维化的发生过程，提示 S1P 可以作为肝纤维化的一个生物标记物，以 S1P/S1P3 信号为作用靶点将有望设计出新的抗纤维化药物。关键词（用分号分开，不超过5个）肝纤维化；骨髓间充质干细胞；磷酸鞘胺醇；骨髓移植；细胞迁移；细胞分化；绿色荧光蛋白文档可自由编辑打印二、项目组成员姓名性别年龄学位研究方向单位XX男25硕士在读肝纤维化研究首都医科大学XXX女23硕士在读肝纤维化研究首都医科大学三、立题依据(一)研究现状 肝纤维化是多种病因所致的慢性肝病共有的病理过程，涉及到细胞、细胞因子和细胞外基质（extracellular matr

7、ix, ECM）之间一系列复杂的变化，其主要特征是以胶原为主的细胞外基质在肝脏内的过量沉积。进一步发展可引起肝小叶结构改建、假小叶及结节形成，即肝硬化。慢性肝病的病因包括病毒性肝炎、慢性酒精中毒、慢性胆汁瘀积、化学毒物或药物、肝脏淤血、遗传和代谢疾病以及血吸虫的感染等，所有这些病因均可导致肝细胞炎症及损伤，使肝细胞呈弥漫变性、坏死，继而坏死区胶原纤维增生。大量研究证实，肝脏肌成纤维细胞（hepatic myofibroblasts, hMF）是合成和分泌细胞外基质的主要细胞，在肝纤维化发生过程中起着决定性的作用。它们在肝细胞坏死部位增殖，分泌炎症细胞因子和趋化因子，合成大量基质蛋白（如：I 型

8、胶原，III 型胶原等）和基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）等，因而导致肝纤维化1-3。近年来，关于肌成纤维细胞的来源问题成为国内外研究的热点。原因在于，探明了肌成纤维细胞的来源，对其分化进行可控性调节，就有可能从源头上解决肝纤维化这一难题，从而为这一难治性疾病的防治提供新的线索。多数学者认为肝脏肌成纤维细胞是由肝星状细胞活化而成4。在正常肝组织中，肝星状细胞约占肝脏细胞总数的 510%，位于窦周 Disse 间隙。急性或慢性肝损伤时，肝星状细胞被激活，转化成肌成纤维细胞，表达平滑肌肌动蛋白 a（smooth muscle a-actin, a-SMA）。也有学者认为肝脏肌成纤维细胞来源于汇管

9、区和中心静脉区的成纤维细胞，其研究发现在实验性导管源性肝硬变的发生过程中，这些成纤维细胞转化成表达 a-SMA 的肌成纤维细胞，是肝硬变发生过程中的决定因素5。然而，肝星状细胞和成纤维细胞均为肝组织固有细胞，由于其细胞表面没有特殊的识别标志，因此很难在体内以这样的细胞为靶点设计出有效的抗肝纤维化方案。最近大量研究表明，肝脏肌成纤维细胞有可能存在第三种来源骨髓（bone marrow, BM），并认为它们主要来源于骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）6-10。由此说明，当肝脏受损伤以后，骨髓干细胞可以迁移到受损的肝脏并分化为肌成纤

10、维细胞从而参与肝纤维化。然而，骨髓细胞是如何迁移到受损的肝组织并参与肝纤维化的发生？哪些生物活性分子在这一过程起主要作用？这些问题尚需进一步研究。很显然，阐明了这一机制将有助于我们制定新的特异的抗纤维化治疗方案。研究发现，膜磷脂的代谢产物在细胞正常的生命活动中起着举足轻重的作用，如三磷酸肌醇（IP3）、二脂酰甘油（DAG）等就是重要的第二信使。磷酸鞘胺醇（sphingosine 1-phosphate, S1P）是新近发现具有重要生理功能的另一种膜磷脂代谢产物，它在细胞增殖、存活、迁移、分化以及免疫功能的调节等方面都有着极其重要的作用11-15。S1P 是鞘磷脂的一个中间代谢产物，体内调节 S

11、1P 合成的主要相关酶有：催化鞘胺醇磷酸化生成 S1P 的鞘胺醇激酶（sphingosine kinase 1 and 2, SphK1, SphK2）；促进 S1P 降解的 S1P 磷酸酶（S1P phosphatase）和裂解酶（S1P lyase）15。研究证实，S1P 既可以作为细胞内第二信使发挥作用，又可以与细胞表面的特定受体结合而发挥重要的生物学功能11。由于 S1P 作为胞内第二信使的作用靶点目前还不清楚，因此相关报道较少；而 S1P 作为胞外配体的研究较多，它可与其相应受体结合后激活或抑制多种信号通路从而发挥不同的生物学效应。S1P 受体家族最早被命名为内皮细胞分化基因（end

12、othelial differentiation gene, EDG）受体，属于 G 蛋白偶联受体家族。现已发现这类 Edg 受体家族有 5 个成员：EDG1、EDG5、EDG3、EDG6 和 EDG8（现已分别改称为 S1P1、S1P2、S1P3、S1P4、S1P5）16。目前对于 S1P 研究比较多的一个方面是促进细胞迁移的作用17，而且有研究表明 S1P 在体外明显刺激了骨髓干细胞的迁移18。由此，我们提出了如下假说：当肝脏受损伤后，肝组织中 S1P 含量上升，从而介导骨髓细胞向受损肝脏归巢并分化为肌成纤维细胞参与纤维化。本研究拟结合体外和体内实验，应用两种经典肝纤维化模型四氯化碳（CC

13、l4）模型和胆管结扎（BDL）模型，首先证实肝脏受损以后骨髓细胞是否参与了肝纤维化的发生，继而以 S1P 为靶分子，探讨其是否参与了肝纤维化，以及它在骨髓细胞向受损肝脏迁移并分化为肌成纤维细胞过程中的作用机制，从一较新的视角探讨骨髓细胞在肝纤维化发生过程中的作用。对这一过程的深入研究将有助于我们更深入地了解肝纤维化的发生机制，从而设计出新的抗纤维化治疗方案。 图2 磁酶免化学发光分析原理图（摘自参考文献26）用磁微粒化学发光法检测癌胚抗原的优点如下：1.与单克隆抗体结合反应特异性高，重复性好；2.碱性磷酸酶显色结果稳定，不含致癌物；3.酶标记单克隆抗体特异性强，无放射污染和危害；4.磁性抗体分

14、离技术，不用离心，不用液相；5.反应灵敏、准确、检测速度快，与临床符合率较高，为临床提供了较为可靠的诊断依据18。本论文将化学发光磁酶免疫法用于肿瘤标志物的检测中。肿瘤标志物（Tmor marker，TM）作为诊断肿瘤的重要指标，体内TM含量的变化可以为临床医生提供很多信息，从而指导他们及早地发现肿瘤，更合理的为患者提供治疗措施19。但体液中肿瘤标志物的含量通常非常的低，一般的检测方法很难对其进行准确的检测。本论文通过制备磁微粒化学发光酶免疫分析试剂盒对血清中的癌胚抗原CEA进行检测，实验中制备了试剂盒的各组分，对抗体与磁微粒的配比，反应温度、反应时间进行了优化。对比了国产和进口磁微粒分别与抗

15、体连接的效果，最后用优化后的试剂盒来检测临床血清并对该试剂盒的热稳定性进行了评价。临床CEA血清检测结果不但能满足临床分析检测的需求，而且可以节省成本。实验技术路线（见图3），磁微粒化学发光法是一种很有前景的分析检测方法，此方法在肿瘤标志物检测中的应用与推广必将使肿瘤早期诊断成为可能，从而推动人类尽早攻克肿瘤20。 (二)拟解决的问题：检测磁微粒在胚癌基因和正常原胚组织中的表达并比较其不同检测胚癌基因不同手术病理分期患者原胚组织中磁微粒的表达情况主要参考文献：1 张丽明化学发光标记及发光免疫分析J基础医学与临床，1995，15（4）：234-2472 宇传华诊断医学统计学M北京:人民卫生出版社

16、，2005：13-193 Baeyens WR，Schulman SG，Calokerinos AC et alChemiluminesce-based detection：principles and analytical applications in flowing streams and in immunoassaysJJPharmBiomedAnal，1998，17(67)：9419534 林金明化学发光基础理论与应用M北京：化学工业出版社，2004:1-285 王自正现代医学标记免疫学M北京：人民军医出版社，2000：7-266 Wang J，Da X，He Y H，et alLo

17、calization of tumor by chemiluminescence probe during photosensitization actionJ，Cancer Letters2002，188：59-657 张忠英，高惠川，林永志等电化学发光免疫分析技术联合检测CYFRA21-l和癌胚抗原对肺癌的诊断意义J，福建医科大学学报，2001，35(2)：169-1718 Xue M D，Haruyama T，Kobatake E，et alElectrochemical luminescence immunosensor for fetoproteinJSens Actuators B

18、，1996，36：458-4629 林日文，吴潭梅TSH、T3、T4磁分离酶联免疫法测定1 000例结果评价J 中国保健杂志，2006，14(12)：68-7210 李宣海，巫向前，倪语星肿瘤标志物的检测与临床M北京：人民卫生出版社，1997：6916711 俞信祥，顾静欣，陆卫国等HCG-放射免疫快速测定及102例结果分析J上海医学检验杂志，1995，10(3)：16312 庄惠生，王琼娥，陈国南等测定癌胚抗原的化学发光免疫分析新方法J光谱学与光谱分析，2000，20(6)：889-89113 Hashem Akhavan-Tafti，Reddy Lekala V，Sarada Siripu

19、rapu，et alChemiluminescent detection of DNA in low-and medium-density arraysJClin Chem1998，44(9)：205514 刘冬妍，张玉英，王艳玲用电化学发光方法检测CA125对结核诊断的价值现代检验医学杂志，2002，17(3)：4515 章竹君，张书圣，张新荣偶合反应化学发光免疫分析测定人血清甲胎蛋白J.分析化学，1998，22(6)：539-54216 Sasamoto H，Maeda M，Tsuj A，et alHighly sensitive immunological assays for huma

20、n chorionic gonadotrophin and prostatic acid phospHatase using phenacyl phosphate as a chemiluminescent labelJAnal Chim Acta，1995，309：221-2217 赵利霞，林金明，屈锋微板式磁化学发光酶免疫分析法对人绒毛膜促性腺激素(HCG)的灵敏性快速测定J化学学报，2004，62(1)：71-7718Gion M,Mione R，Leon A E，Dittadi RComparison of the diagnostic accuracy of CA153 in pri

21、mary breast cancerClin Chem1999，45(5)：630-63719曾常茜，王琰，杨蜜化学发光免疫测定技术在检测肿瘤患者CEA中的应用J北华大学学报(自然科学版)，2001，2(4)：303-30520吴广平，巴静，王恩华等检测胸水中CEA、CA125、CA153及CA199对肺癌的诊断价值J中国肿瘤学杂志，2004，7(1)：35-37四、研究目标与研究内容(一)研究目标总体目标：分析磁微粒表达与胚癌基因临床病理特征的关系以及在胚癌基因发生、发展中的作用。具体目标：分别检测磁微粒在胚癌基因、正常原胚组织中的表达情况并比较其不同。检测胚癌基因不同手术病理分期患者原胚组

22、织中磁微粒的表达情况(二)研究内容本研究采用免疫组化方法检测并比较磁微粒在胚癌基因(内膜癌组)及正常原胚(正常对照组)组织中的表达，探讨胚癌基因中磁微粒的表达及意义。要研究的内容有：(1) 磁微粒在二组组织中是否均有表达，表达情况的差异有无统计学意义。(2) 不同手术病理分期胚癌基因患者磁微粒表达情况及表达情况差异有无统计学意义。五、研究方案2.1细胞株的传代培养：1)在无菌条件下用DMEM（10%FBS）培养基，5%CO2进行培养。当细胞密度至90%以上汇合时，进行消化传代。2)细胞弃去培养液，用PBS培养液冲洗贴壁细胞层2次，加入含10%FCS的DMEM 培养液，用细胞刮将细胞刮下来。3)

23、细胞计数后按一定比例传代。2.5细胞免疫荧光染色将细胞放于倒置显微镜下用不同的放大倍数进行观察，从形态学的层面对细胞进行鉴定。原理：免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光，可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。细胞准备与固定：按1×105细胞/孔的密度，将细胞接种到预先放置盖玻片的小皿中，置CO2培养箱

24、培养过夜，待细胞上贴壁生长并具有一定的密度时进行如下操作1)用 PBS 洗3×5 min；2)含 0.5% Triton X-100的 PBS，室温打孔15 min；3)用 PBS 洗3×5 min；4)用 2% BSA封闭，37，30 min；5)加一抗（anti-PPAR, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA，1:50）室温1-2 h；6)用 PBS 洗3×5 min；7)加荧光二抗（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA,1:1000），室温1 h；8)用 PBS 洗3×

25、;5 min；9)用封片剂封片；10)荧光显微镜或共聚焦显微镜观察，拍片。2.7 肝组织和血清中 S1P 水平检测：高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography, HPLC)1)取100 ml 血清或肝组织匀浆液（25 mM HCl/1M NaCl）加入250 ml MeOH和0.6 ml 浓盐酸；2)冰水中超声10 min；3)加入500 ml CHCl3/1 M NaCl (1:1，v/v)和25 ml 3 N NaOH；4)vortex，30 sec×2；10000 rpm，3 min，4；5)取上层水相至5 ml 玻璃管中；6)

26、下层有机相加入250 ml MeOH/1 M NaCl (1:1，v/v)和13 ml NaOH，vortex, 30 sec×2；10000 rpm，3 min，4，取上层水相与前合并；7)重复第6步；8)加入150 ml reaction buffer (200 mM TrisHCl, 75 mM MgCl2 in 2 M glycine buffer, pH 9.0)，50U Apase，vortex；9)加入200 ml CHCl3 到上述混合物底层，封口；10)37 水浴孵育1 h；11)加入 17 ml 浓盐酸终止反应；12)加入 500 ml CHCl3，vortex，

27、2000 rpm，5 min，4，吸取下层CHCl3相到新的玻璃管中；上层水相再加入500 ml CHCl3，vortex，2000 rpm，5 min，4，吸取下层 CHCl3 相与前合并；13)CHCl3 相加入alkaline water（500 ml）洗3次（2000 rpm,3 min, 4）；14)CHCl3 相转入新的玻璃管中，冷冻干燥；15)The dried lipid residue 加入250 ml 无水乙醇，封口后在67水浴孵浴25 min；16)加入30 ml OPA reagent 50 mg OPA, 1 ml ethanol, 100 ml 2-mercapto

28、ethanol, and 50 ml 3% (w/v) boric acid solution adjusted to pH 10.5，室温孵浴20 min；17)HPLC-analysis: 进样量：60 ml 柱温：20oC 流速：1ml/min流动相：乙腈/水90：10 激发波长（Ex）：340 nm 发射波长（Em）：455 nm2.8 鞘胺醇激酶活性(SphK activity)检测2.8.1 含鞘胺醇激酶的肝组织总蛋白提取：1)取少许肝组织，生理盐水漂洗，滤纸吸干，取肝组织块（100-200 mg），放入1.5 ml EP管，加入 500 ml Buffer A。2)冰上匀浆，4

29、sec/次，大约 10 次左右。3)冰上超声裂解（最小频率）2min。4)将匀浆液在 4 下最大转速21,000 g离心3 min，取上清液转移至新EP管中，21,000 g继续离心2 h，取上清液备用。5)取待测样品 2 ml加高压灭菌去离子水 98 ml，将样品稀释 50 倍后BCA法测定浓度（见2.12.2）。溶液配置(Buffer A): 1M Tris(PH7.4)1 ml40 mM EDTA1.25 mlGlycerol10 ml100 mM NaF7.5 ml100 mM钒酸钠0.5 ml100 mM PMSF0.5 ml1M b-磷酸甘油2 mlb-巯基乙醇3.5 mlLeup

30、eptine2 mg/mlAprotinine2 mg/ml 50 mM脱氧维生素B0.5 ml H2O 26.75 ml2.8.2 酶促反应：取 100 mg 蛋白提取物和 10 ml 1 mmol/L 鞘胺醇（溶解于 5% Triton X-100）混匀，加入5 ml -32PATP (10 mCi , 20 mmol/L, MgCl2 200 mmol/L)，37 oC 反应30 min。2.8.3 终止反应：向反应体系中分别加入 10 ml 1 mol/L HCl 和 0.4 ml 氯仿/甲醇/HCl (100:200:1, v/v) 混合物，猛烈振荡，终止反应。2.8.4 有机抽提和

31、薄层层析：各反应管加入120 ml 氯仿和120 ml 2 mol/L KCl，吹打混匀，于12,000 g 离心 5 min。此时水相和有机相分离，弃去水相，样品各取 20 ml 有机相点样于硅胶 Gel G60，于层析液（正丁醇、乙醇、乙酸和水按80201020 混匀，v/v）中展开；放射自显影，用图像分析软件分析光密度。2.9 细胞迁移实验1)骨髓间充质干细胞汇合度达到8090% 后，PBS 冲洗一次，更换无血清培养基培养24 h。2)胰蛋白酶消化、离心后，用无血清培养基悬浮细胞，以 4×104/孔的细胞密度（体积为200 ml）接种到24孔 transwell 小室中，小室下

32、层加入 700 ml 无血清培养基，同时向下层加入 S1P、H2S1P （溶解于0.4% BSA）诱导细胞的迁移， 以 0.4% BSA作为阴性对照。当观察 S1P3 受体拮抗剂 suramin 是否能抑制 S1P 诱导的骨髓间充质干细胞迁移时，在接种到 transwell 小室之前先加入 suramin 处理细胞1 h。3)37oC、5% CO2 培养4 h 后用冰冷的甲醇固定 15 min，用 PBS 冲洗 3 次，同时用棉签擦去上层贴附的细胞。4)苏木素染色30 min，PBS 冲洗 3 次。5)显微镜下观察并拍照，每孔随机选择 6 个视野，每个实验条件设置 3 个平行孔，每次实验重复

33、3 次。2.10 细胞分化实验 骨髓间充质干细胞汇合度达到 8090% 后，PBS 冲洗一次，更换无血清培养基培养 24 h，然后加入 1000 nM S1P 或 10 ng/ml TGF-b1，同时设置对照组，分别刺激细胞 6、12、24 h 后收集细胞，提取总 RNA 进行real-time RT-PCR，检测 a-SMA、I 型和 III 型胶原的 mRNA 水平。2.7 实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)2.7.1 总 RNA 的提取和定量（使用QIAGEN® RNeasy Mini Kit）：1)取 60-100 mg 肝组织加入 600 ml R

34、LT 裂解液，置于冰上匀浆；2)1ml/2ml 注射器反复抽吸使组织完全裂解，13200 rpm 离心3 min；3)取上清入另一 EP 管；4)加入 70% 乙醇，上下混匀后取 600 l 混合液加入 RNeasy mini 柱，室温下 13200 rpm 离心1 min；5)向柱内加入 350 ml RW1缓冲液，室温下 13200 rpm 离心 1 min,；6)重复第（5）步操作；7)将 mini 柱放入一新的收集管，加入500 ml RPE，13200 rpm，离心1 min，弃离出液；8)再加入500 ml RPE 液，13200 rpm,离心2 min，弃离出液；9)将 mini

35、 柱放入一新的收集管中，13200 rpm,离心1 min；10)将 mini 柱放入超净台自然晾干（15 min），然后放入新的EP管中，加入30 ml RNase-free 水。室温放置10 min, 13200 rpm离心1 min,作定量或置-80 贮存。11)RNA定量：4 ml RNA + 396 ml Tris-HCL 溶液，紫外分光光度计测定OD260和OD280 吸光值，按下列公式计算 RNA 含量：RNA 浓度（mg/ml）=（OD260×40×稀释倍数）/1000。选择OD280/OD260值为 1.9-2.1 之间的样品。2.7.2 RNA 甲醛凝胶

36、电泳1)溶液配制缓冲液的配制：10×FA胶缓冲液（母液）pH 7.0： 200 mM 3-N-morpholino propanesulfonic acid (MOPS) 50 mM sodium acetate（乙酸钠） 10 mM EDTA即：100（500）ml 10×FA胶缓冲液（母液）： 4.1860（20.930）g MOPS 0.6804（3.402）g 醋酸钠（乙酸钠） 0.3722（1.861）g EDTA加入96（480）ml 蒸馏水，用 NaOH 调 pH 到 7.0，定容，高压灭菌。1×FA 胶缓冲液（工作液）：100 ml 10 

37、5; FA 胶缓冲液20 ml 37% 甲醛880 ml 蒸馏水1.2% FA 胶制备： 琼脂糖 1.2 g l0 × FA胶缓冲液 10 ml 蒸馏水 74 ml微波加热煮沸，使完全溶解，室温放置10 min，冷却至 65 左右，于通风橱中加入EB（10mg/ml） 1 ml37% 甲醛 16 m1 混匀后灌胶。胶在使用前，需在1×FA胶缓冲液（即：电泳液）中平衡至少30min。上样缓冲液的配制： 5 × RNA 上样缓冲液： 饱和的溴酚蓝水溶液16 ml 500mM EDTA，pH8.080 ml 37%（12.3M）甲醛720 ml 100% 甘油2 ml

38、甲酰胺3084 ml l0 × FA胶缓冲液4 ml加 Rnase-free 的水到10 ml2)样品处理:5×RNA上样缓冲液 1.0 ml RNA样品 4.0 ml混匀后 65 温浴 5 min，使 RNA 变性，放于冰上降温后上样。3)电泳：80 V电泳，1 h后观察所提 RNA 的质量。2.7.3 逆转录反应（RT）（使用M-MLV逆转录试剂盒）1)在200 m l薄壁管中加入 总RNA 2.0 mg 01igo(dT)15 0.5 ml l0 mM dNTP l.0 ml H2O (10.5总RNA体积) m l 总体积 12.0 m12)在 65 加热 5 mi

39、n，立即转入冰浴中至少3-5 min;3)短暂离心后，加入:5×第一链缓冲液 4.0 m10.l M DTT 2.0 mlM-MLV l.0 mlRnaseOUT(40U/ml) l.0 ml 总体积 8.0 m14)轻轻混匀，短暂离心, 37 50 min, 70 l5 min终止反应，置冰浴5 min;（不加逆转录酶作为阴性对照）5)产物可以进行 PCR 反应或者 -20 储存。2.11.4 Real-time PCR1)所用引物序列：引物序列.Gene TypeSequence（53）TNF MCP-1TGF1IL-6PPAR18S rRNAF: GGC AGG TTC TGT

40、 CCC TTT R: CTG TGC TCA TGG TGT CTT TTC TGF: TCTGGGCCTGCTGTTCACAR: GGA CCCTTTGTATCAAGTGGCAF: TGC GCT TGC AGA GAT TAA AAR: CTG CCG TAC AAC TCC AGT GAF: CTC TGG GAA ATC GTG GAA ATGR: AAG TGC ATC ATC GTT GTT CAT ACAF: GCC CAC CAA CTT CGG AAT CR: TGC GAG TGG TCT TCC ATC ACF:GTA ACC CGT TGA ACC CCA TTR:

41、CCA TCC AAT CGG TAG TAG CGSYBR Green法反应体系：H2O8 mlPrimer-F(10 mM)0.5 mlPrimer-R(10 mM)0.5 mlcDNA1 mlPower SYBR Green master mix (2×)10 ml共计20 ml2)所用探针：procollagen a1(I): MA00801666; procollagen a 1(III): MA00802331; a-SMA: MA00725412; SphK1: MA00448841; S1P phosphatase: MA00473016; S1P lyase: MA

42、00486079探针法反应体系：TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErate UNG (2×) 10 m120×Assay-on-DemandTM Gene Expression Assay Mix 1 m1cDNA 1 m1H2O 8 m1总体积 20 m1将检测的临界点设定在 PCR 扩增过程中,荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数 (Ct) 作为模板初始浓度的间接指标,溶解曲线分析采用默认条件。结果以 18S rRNA 进行校正,用Ct 法计算相对基因表达。2.12 蛋白印迹实验(Western B

43、lot)2.12.1 肝组织总蛋白的提取6)取少许肝组织，生理盐水漂洗，滤纸吸干，取肝组织块（小于50 mg/块），放入1.5 ml Eppendorf 管，加入 200 ml 细胞裂解液。7)冰上匀浆，4 sec/次，大约 10 次左右。8)将匀浆液在 4 下16000 rpm离心10 min，取上清液备用。9)取待测样品 2 ml加高压灭菌去离子水 98 ml，将样品稀释 50 倍后测定浓度。2.12.2 蛋白浓度测定按 BCA 蛋白检测试剂盒中的方法进行。1)制备牛血清白蛋白(BSA)标准样品和待测样品。标准品浓度梯度如下：标本加去离子水（ml）母液（ml）BSA终浓度（ml/ml）A0

44、300原液2000B125375原液1500C325325原液1000D175B液 175750E325C液 325500F325E液 325250G325F液 325125H400G液 10025I400002)制备蛋白测定工作液：将试剂盒中的 A 液与 B 液按 50:1 混合。3)将蛋白标准品及样品各50 ml与BCA工作液200 ml混匀，37 水浴30 min，后置于冰中，终止反应。4)用酶标仪读取上述混合液在 560 nm 处的吸光值。5)根据标准样品所测光密度值与相应的蛋白浓度制成蛋白标准含量曲线，通过标准曲线计算待测标本的蛋白浓度。2.12.3 聚丙稀酰胺凝胶电泳配制聚丙烯酰胺

45、凝胶（5% 浓缩胶和12% 分离胶），将制备好的凝胶固定于电泳装置上。电泳槽中加入Tris甘氨酸电泳缓冲液，50 mg待测样品与上样缓冲液共25 ml混匀后，99 加热 10 min使蛋白变性。然后按顺序加待测样品及预染蛋白标准品上样，120 V恒压电泳约1 h。2.12.4 膜转印取出凝胶，剪取与胶相同大小的硝酸纤维素膜 1 张和 6 张滤纸，并用转移液预先浸透。按照 3 层滤纸-硝酸纤维素膜-凝胶-纤维素膜和三层滤纸的次序铺在电转仪的正极上。清除当中的气泡。合并转移槽。将转移槽两极插上电极，150 mA，转膜1 h。2.12.5 杂交1)取下转移后的硝酸纤维素膜，用 TBST 在摇床冲洗5

46、 min×3 次， 滤纸吸干表面。2)5% 封闭液（1.25 g 脱脂奶粉 + 25 ml TBST 配制）室温封闭1 h，以防止抗体的非特异性结合。3)封闭结束后，将硝酸纤维膜放入一抗液中（兔抗鼠抗 S1P3 抗体，1：500 稀释），摇床上 4 过夜。4)TBST 冲洗 10 min×3 次，加入二抗（辣根过氧化物酶标记抗IgG抗体，1:10000 稀释），室温孵育 1 h后，TBS-T 冲洗 10 min×3 次冲洗，进行化学发光显色。2.12.6 化学发光取 Westernblot Luminol regent中等量化学发光试剂 A 和 B 混合，置于硝酸

47、纤维素膜正面上反应5 min，吸干混合液，暗室曝光，显影和定影，冲洗胶片。标本中内参照GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶Glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase, 分子量37 kDa）的测定采用相同步骤。2.12.7 蛋白质含量分析将胶片扫描成图像文件后，用 Gel-Doc 凝胶成像系统计算单位光密度值和条带面积，将各实验点的总光密度值与内参照 GAPDH 比较，得到相对百分数。实验重复三次，最终结果以均值±标准误表示。2.13 统计学分析所有实验数据以均值±标准误表示，采用 SPSS11.5 统计软件对实验结果进行分析，两组间比较采用 tudents t 检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。P<0.05认为有显著性差异。 六、可行性分析（包括对研究基础、工作条件、政策法律法规等方面进行分析）（1） 项目的立项依据充分。本研究在前期工作中已经发现了磁微粒在其他肿瘤组织中的表达，国内外其他研究者也已经发现了磁微粒在其他肿瘤浸润性转移中的作用，这些都有利于本研究的借鉴和开展，进而分析这两个因子在肿瘤发生发展中过程中的相关性。（2） 本研究拟采用的技术方法是目前分子生物学领域很成熟的技术方法，有利于本课题的进一步开展。（3） 本研究的的负责人XX教授不仅有多年的临床一线工作经验，而且有很