第二章 种子扩大培养

1、 第二章第二章第五节第五节 种子扩大培养种子扩大培养n定义：定义：菌种的扩大培养菌种的扩大培养就是把保就是把保藏藏的菌种的菌种，即砂土管、冷冻干燥管中，即砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，子罐，逐级扩大培养逐级扩大培养后达到一定的后达到一定的数量和质量数量和质量的的纯种纯种培养过程。这些培养过程。这些纯种的培养物称为种子。纯种的培养物称为种子。 种子必须具备的条件种子必须具备的条件菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐 中能迅速生长中能迅速生长生理性

2、状稳定生理性状稳定菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要 求求无杂菌污染（不带杂菌）无杂菌污染（不带杂菌）生产能力稳定生产能力稳定 几个概念几个概念 n种子罐级数种子罐级数：种子在种子罐中需扩大培：种子在种子罐中需扩大培养的次数。养的次数。n发酵级数发酵级数：种子罐的级数加一。：种子罐的级数加一。 n接种量接种量：放罐的种子罐的培养液体积除：放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液的体积的百分数。以接种后培养液的体积的百分数。n种龄种龄：生产种子的培养时间。：生产种子的培养时间。 微生物的扩大培养微生物的扩大培养 现代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐的现

3、代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。 菌种扩大培养的目的菌种扩大培养的目的： 就是要为每次发酵罐的投料，提供相当数量的代谢旺盛的种子。就是要为每次发酵罐的投料，提供相当数量的代谢旺盛的种子。 种子扩大培养的任务：种子扩大培养的任务： 不但要得到纯而壮的培养物，而且要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。不但要得到纯而

4、壮的培养物，而且要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。 种子扩大培养的过程：种子扩大培养的过程：斜面菌种斜面菌种 一级种子培养一级种子培养 二级种子培养二级种子培养 发酵罐发酵罐 因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐利用率，数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐利用率，并且也有利于减少染菌的机会。并且也有利于减少染菌的机会。 对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢及生对于不同产品的发酵过程来说，

5、必须根据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。产的规模决定种子扩大培养的级数。一、种子扩大培养流程图一、种子扩大培养流程图 实验室种子制备阶段实验室种子制备阶段（一级种子培养）（一级种子培养）生产车间种子制备阶段生产车间种子制备阶段（二级种子培养、（二级种子培养、 三级种子培养）三级种子培养）二级发酵二级发酵 三级发酵三级发酵砂土孢子砂土孢子冷冻干燥孢子冷冻干燥孢子斜面孢子斜面孢子摇瓶液体培养摇瓶液体培养茄子瓶斜面培养茄子瓶斜面培养固体培养基培养固体培养基培养一级种子罐一级种子罐二级种子罐二级种子罐发酵罐发酵罐 种子罐级数种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种

6、子的生是指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。对于生长快长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。对于生长快的细菌，种子用量少，故种子罐数相应也少。如谷氨酸生产，种子接入种的细菌，种子用量少，故种子罐数相应也少。如谷氨酸生产，种子接入种子罐后于子罐后于32培养培养7-10h，菌浓达到，菌浓达到108-109个个/ml，即可接入发酵罐作为种，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。生长较慢的菌种，如青子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，种子接入一级种子罐霉

7、素生产菌种，种子接入一级种子罐27 培养培养40h后，再需移入装有新鲜后，再需移入装有新鲜培养基的第二级种子罐，于培养基的第二级种子罐，于27 培养培养10-24h移至发酵罐作为种子，这称移至发酵罐作为种子，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵发酵罐都采用三级发酵。 （一）实验室种子的制备（一）实验室种子的制备两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备孢子制备过程过程 在液体培养基中生产大量菌丝的在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备种子制备过程。过程。 n产孢子能力强产孢子能力

8、强的及的及孢子发芽、生长繁殖快孢子发芽、生长繁殖快的菌种：采用固体培养基培养孢子，孢子的菌种：采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌不易污染杂菌n产孢子能力不强或孢子发芽慢产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可的菌种，可以用液体培养法。以用液体培养法。1 1孢子制备孢子制备 孢子制备是种子制备的开始，是发酵孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响，不同菌种的孢子制备工艺有

9、其不同的影响，不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点。的特点。(1)放线菌孢子的制备放线菌孢子的制备琼脂斜面培养基琼脂斜面培养基： 适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等；胨和一些无机盐等； 碳源和氮源不要太丰富碳源和氮源不要太丰富 (碳源约为碳源约为1，氮源不超过，氮源不超过0.5)。碳源丰富：生理酸性环境，不利于放线菌孢子的形成；碳源丰富：生理酸性环境，不利于放线菌孢子的形成；氮源丰富：有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。氮源丰富：有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。 一般情况下，干燥和限制营养可直接或间接诱导孢一般情况下，干燥和限制

10、营养可直接或间接诱导孢子形成。子形成。 放线菌斜面的培养温度大多数为放线菌斜面的培养温度大多数为28，少数为，少数为37，培养时间为，培养时间为514天。天。 n用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。n母斜面孢子母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异，接入液体培养基有利于防止菌种变异，n子斜面孢子子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。接入液体培养基可节约菌种用量。n菌种进入种子罐有两种方法：菌种进入种子罐有两种方法：n孢子进罐法孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子罐此方法可减少

11、批与批之间的差异，具有操作方便、工罐此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成为发酵生产的一个方向。为发酵生产的一个方向。n摇瓶菌丝进罐法摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间 (2)霉菌孢子的制备霉菌孢子的制备 培养基：天然农产品如大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等；培养基：天然农产品如大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等；营养成分较适合霉菌的孢子繁殖；培养基表面积

12、较大，可获营养成分较适合霉菌的孢子繁殖；培养基表面积较大，可获得大量的孢子。得大量的孢子。 霉菌的培养一般为霉菌的培养一般为2528 ，培养时间为，培养时间为414天。天。(3)细菌培养物的制备细菌培养物的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，牛细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。培养温度：多数为培养温度：多数为37，少数为，少数为28。培养时间：培养时间：12天，产芽孢的细菌则需培养天，产芽孢的细菌则需培养5一一10天。天。 实验室种子的制备：实验室种子的制备： e.g 产黄青霉菌产黄青霉菌(P.chrys

13、ogonum) 原始菌种原始菌种 斜面试管斜面试管 获得孢子获得孢子 250ml 茄子瓶（大米或小米）茄子瓶（大米或小米） 25 28 ，414天天 成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下以下，于，于4 冰箱保存冰箱保存）。(4)斜面种子的制备斜面种子的制备 斜面种子斜面种子：在试管或扁瓶内，琼脂固化的培：在试管或扁瓶内，琼脂固化的培养基表面上生长的菌种培养物。养基表面上生长的菌种培养物。 制备流程：略制备流程：略 制备过程制备过程注意事项：注意事项：A 琼脂要完全浸没在营养液内，用量琼脂要完全浸没在营养液内，用量1.0%-2.5%B 营养液中最好不

14、含易沉淀的固形物；营养液中最好不含易沉淀的固形物；C 装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度的装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度的2/3；D 灭菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以减少冷凝水灭菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以减少冷凝水 ；F 微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入。微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入。影响斜面种子质量的因素影响斜面种子质量的因素 (1)原材料质量，水质，培养基原材料质量，水质，培养基pH (2)灭菌条件灭菌条件 (3)接种量接种量 (4)培养室温度、湿度、通风培养室温度、湿度、通风 (5)培养时间培养时间 (6)有害气体或挥发物（培养室内不要安紫外灯

15、）有害气体或挥发物（培养室内不要安紫外灯） (7) 冷藏条件冷藏条件 2.2.液体种子制备液体种子制备（1 1）好氧培养好氧培养如链霉菌等，其过程如下：如链霉菌等，其过程如下： 试管试管三角瓶三角瓶摇床摇床种子罐种子罐 （2 2）厌氧培养厌氧培养对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的制备过程如下：种子的制备过程如下：试管试管三角瓶三角瓶卡式罐卡式罐种子罐种子罐e.g.对于对于不产孢子不产孢子的赤霉素生产菌（的赤霉素生产菌（Gibberelline fujikuroi），也可用），也可用大米固体培养基大米固体培养基在茄子瓶中培养在茄子瓶中培养菌丝体菌丝

16、体，用作种子罐种子。用作种子罐种子。 产产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰，如产链霉素的灰色链霉菌（色链霉菌（Sgriseus ），产卡那霉素的卡那链霉菌），产卡那霉素的卡那链霉菌（Skanamyceticu），可以用），可以用摇瓶液体培养法摇瓶液体培养法，孢子接入含，孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得液体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体菌丝体，作为种，作为种子。子。 不产孢子的细菌不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌（Corynebacterium）、短杆菌（）、短杆菌（Brevibacterium）

17、，生产上），生产上一般采用一般采用斜面营养细胞斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得得细胞悬液细胞悬液再接种。再接种。 e.g. Glutamic acid-producer：（谷氨酸生产菌）：（谷氨酸生产菌）原始菌种（出发菌种）原始菌种（出发菌种） 固体试管斜面（固体试管斜面（32 C ，1824小时）小时） 三角瓶培养（摇床）三角瓶培养（摇床）(flask culture) 种子罐培养种子罐培养 e.g. yeast：原始菌种（出发菌种）原始菌种（出发菌种） 10ml 麦汁试管麦汁试管 250ml 三角瓶培养三角瓶培养 （25 C 27C ，3天）天

18、） （25C， 2天）天） 510 L卡氏罐卡氏罐（15 C 20 C ，35天）天）种子制备种子制备 将固体培养基上培养出的孢子或菌体转将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。菌丝或菌体的过程。 种子制备所使用的培养基和其他工艺条种子制备所使用的培养基和其他工艺条件，都要件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁殖。有利于孢子发芽和菌丝繁殖。（二）生产车间种子制备（二）生产车间种子制备 n 实验室制备的孢子或液体种子移种实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不

19、同菌种而异，但其原则为因不同菌种而异，但其原则为采用易被采用易被菌利用的成分菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。养条件。 1.摇瓶种子制备摇瓶种子制备 孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶孢子发芽和菌丝繁殖速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子摇瓶种子。摇瓶相当于。摇瓶相当于微缩了的种子

20、罐，其培养基配方和培养条件与种子罐相似。微缩了的种子罐，其培养基配方和培养条件与种子罐相似。 摇瓶种子进罐，常采用母瓶、子瓶两级培养摇瓶种子进罐，常采用母瓶、子瓶两级培养，有时母瓶种，有时母瓶种子也可以直接进罐。子也可以直接进罐。种子培养基：丰富、完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有利于种子培养基：丰富、完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓，子瓶培养基浓度菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓，子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近种子罐的培养基配方。比母瓶略高，更接近种子罐的培养基配方。种子罐的作用种子罐的作用：使有限数量的孢子：使有限数量的孢子(菌体菌体)发芽、

21、生长、并繁殖发芽、生长、并繁殖成大量的菌丝体成大量的菌丝体(菌体菌体)，满足发酵罐的需要（菌体生长和产物，满足发酵罐的需要（菌体生长和产物形成）。形成）。实验室种子进入种子罐有孢子进罐法和摇瓶菌种进实验室种子进入种子罐有孢子进罐法和摇瓶菌种进罐法。罐法。2. 种子罐种子制备种子罐种子制备 可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 孢子孢子(或摇瓶菌丝或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培养被接入到体积较小的种子罐中，经培养后形成大量的菌丝，这样的种子称为后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子一级种子； 把一级种子转入发酵罐内发酵，称为把一级种

22、子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵二级发酵。 如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更多的菌丝，这样制备的种子称为多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子二级种子； 将二级种子转入发酵罐内发酵，称为将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵三级发酵。 同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。n种子制备的目的种子制备的目的：形成一定数量和质量的菌体。：形成一定数量和质量的菌体。 孢子发芽和菌体开始繁殖时，菌体量很少，在孢子发芽和菌体开始繁殖时，菌体量很少，在小型小型罐罐内即可进行。内即可进行。

23、n发酵的目的发酵的目的：获得大量的发酵产物。：获得大量的发酵产物。 产物是在菌体大量形成并达到一定生长阶段后形成产物是在菌体大量形成并达到一定生长阶段后形成的，需要在的，需要在大型发酵罐大型发酵罐内才能进行。内才能进行。 若干发酵产物的产生菌，其不同生长阶段对营养差若干发酵产物的产生菌，其不同生长阶段对营养差异。因此，将两个目的不同、工艺要求有差异的生物学异。因此，将两个目的不同、工艺要求有差异的生物学过程放在一个大罐内进行，既影响发酵产物的产量，又过程放在一个大罐内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。会造成动力和设备的浪费。种子罐级数是指制备种子逐级扩培的次数。种子罐级数是

24、指制备种子逐级扩培的次数。n种子罐级数的确定种子罐级数的确定：（1 1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；（2 2）所采用发酵罐的容积。）所采用发酵罐的容积。n 比如：比如：n细菌细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。n 茄子瓶茄子瓶种子罐种子罐发酵罐发酵罐 n霉菌霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 n 孢子悬浮液孢子悬浮液一级种子罐（一级种子罐（27,4027,40小时孢子发芽，产小时孢子发芽，产生菌丝生菌丝 ）二级种子罐（二级种子罐（2727，10-241

25、0-24小时，菌体迅速繁殖，小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）粗壮菌丝体）发酵罐发酵罐n放线菌放线菌：生长更慢，采用四级发酵：生长更慢，采用四级发酵n酵母酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 3 3，确定种子罐级数需注意的问题，确定种子罐级数需注意的问题n（1 1）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，）种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会减少染菌机会n（2 2）种子级数太少，接种量小，发酵时间延）种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会n（3 3）虽然种子罐级数随

26、产物的品种及生产规）虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。 种子罐级数种子罐级数需考虑：尽量需考虑：尽量延长发酵罐生产产物的时延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生产间，缩短由于种子发芽、生产而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率产物而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率产物mlh。 e.g. Glutamate Glutamate fermentation 一

27、级种子扩培一级种子扩培 实验室种子实验室种子 种子罐种子罐 发酵罐发酵罐 e.g. penicillin fermentation 二级种子扩培二级种子扩培 实验室种子实验室种子 一级种子罐一级种子罐 二级种子罐二级种子罐 发酵罐发酵罐 e.g.Streptomycin fermentation 三级种子扩培三级种子扩培实验室种子实验室种子 一级种子罐一级种子罐 二级种子罐二级种子罐 三级种子罐三级种子罐 发酵罐发酵罐 (Streptomyces griseus)灰色链霉菌灰色链霉菌三、种子培养三、种子培养工业微生物培养的类型工业微生物培养的类型 静置培养法静置培养法：即将培养基盛于发酵容器中

28、，在接种后，：即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养发酵，也称为嫌气性培养不通空气进行培养发酵，也称为嫌气性培养 (anaerobic culturing)通气培养法通气培养法：生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平， 使菌使菌体迅速生长和发酵，也称为好气性体迅速生长和发酵，也称为好气性 培养培养 (aerobic culturing)。 种子扩大培养的方法：种子扩大培养的方法：1 表面培养法表面培养法（surface culturing)： 好氧静

29、置培养好氧静置培养法。针对容器内培养基物形态又分为法。针对容器内培养基物形态又分为液态表面培养液态表面培养和和固体表面培养固体表面培养。相对于容器内培养基体。相对于容器内培养基体积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养基内传递。基内传递。 这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位单位体积的表面积越大，生长速度越快体积的表面积越大，生长速度越快。 2 固体培养（发酵）法固体培养（发酵）法(solid culturing)： 固体培养又分为浅盘固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深

30、固体培养和深层固体培养，统称层固体培养，统称曲法培养曲法培养。它起源于我国酿造生产特。它起源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。 3 液体深层培养（发酵）法：液体深层培养（发酵）法：(liquid submerged culturing) 液体深层发酵法液体深层发酵法从罐底部通气从罐底部通气，进入的空气由搅拌桨叶，进入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐的底部通气搅分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐的底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩

31、散使氧溶解的表面培养法来讲，称为表面培养法来讲，称为深层培养法深层培养法。 液体曲液体曲(liquid koji)、柠檬酸、谷氨酸、肌苷酸、柠檬酸、谷氨酸、肌苷酸(inosinic acid)及其他发酵产品先后采用此法进行生产。及其他发酵产品先后采用此法进行生产。特点：容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不特点：容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、培养基中氢离子浓度等同生理时期的通气、搅拌、温度、培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。条件，选择最佳培养条件。外循环气升式发酵罐外循环气升式发酵罐 内循环内循环气气升式发酵升式发酵罐罐 小型机械搅拌发酵罐小

32、型机械搅拌发酵罐1三角皮带转轴；2轴承支架；3联轴节；4轴封；5窥镜；6取样口；7冷却水出口；8夹套；9螺旋片；10温度计接口；11轴；12搅拌器；13底轴承；14放料口；15冷水进口；16通风管；17热电偶接口；18挡板；19接压力表；20手孔；21电动机；22排气口；23取样口；24进料口；25压力表接口；26窥镜；27手孔；28补料口深层培养的几个主要控制点深层培养的几个主要控制点A 灭菌灭菌(sterilization)：发酵工业要求纯培养。因此：发酵工业要求纯培养。因此在种子培养前必须对培养基进行加热灭菌。在种子培养前必须对培养基进行加热灭菌。B 温度控制温度控制：培养基灭菌后，冷却

33、至培养温度进行：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行培养，由于随着微生物的生长和繁殖，会有热量产生、培养，由于随着微生物的生长和繁殖，会有热量产生、搅拌产热等，所以要维持温度恒定。搅拌产热等，所以要维持温度恒定。 C 通气通气(aeration)、搅拌、搅拌(agitation)： 空气进入发酵空气进入发酵罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。由罐底部进入，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。 搅拌的目的搅拌的目的：增加溶解氧；使基质混合均匀；促进：增加溶解氧；使基质混合均匀；促进热传递热传递 。（

34、培养液中的微生物均匀地分散在种子罐内，。（培养液中的微生物均匀地分散在种子罐内，并使加入的酸和碱均匀分散等）。并使加入的酸和碱均匀分散等）。 n4.载体培养法载体培养法n 以天然或人工合成的多孔材料代替麸以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物的载体，皮之类的固态基质作为微生物的载体，营养成分可严格控制，可反复使用。营养成分可严格控制，可反复使用。n要求：耐蒸汽加热或药物灭菌要求：耐蒸汽加热或药物灭菌n四、种子质量控制四、种子质量控制（一）（一）影响孢子质量的因素及控制影响孢子质量的因素及控制1、培养基、培养基2、培养温度和湿度、培养温度和湿度3、培养时间和冷藏时间、培养时间

35、和冷藏时间4、接种量接种量1.培养基培养基n培养基培养基原材料质量：如四环素、土霉素生产中配制孢子培原材料质量：如四环素、土霉素生产中配制孢子培养基的麸皮（养基的麸皮（wheat branwheat bran）、霉菌用的大（小）米、琼脂）、霉菌用的大（小）米、琼脂的牌号的不同、蛋白胨加工原料不同等均影响种子的质量。的牌号的不同、蛋白胨加工原料不同等均影响种子的质量。n原料原料质量的波动，起主要作用的是其中的质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量无机盐含量的不同的不同，如微量元素，如微量元素MgMg2+2+、Ca Ca 2+2+ 、BaBa2+2+能刺激孢子的形成。能刺激孢子的形成。磷含量磷

36、含量太多或太少也会影响孢子的质量。太多或太少也会影响孢子的质量。n 水质水质的影响的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。造成水质波动，影响种子质量。n 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。定。解决措施解决措施 斜面培养基所用的主要原材料，糖、氮、斜面培养基所用的主要原材料，糖、氮、磷含量需经过磷含量需经过化学分析及摇瓶发酵试验合格化学分析及摇瓶发酵试验合格后后才能使

37、用；才能使用； 严格严格控制灭菌后的培养基质量控制灭菌后的培养基质量； 斜面培养基使用前，需在适当温度下放置斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定的时间，使斜面无冷凝水呈现，一定的时间，使斜面无冷凝水呈现，水分适中水分适中有利于孢子生长有利于孢子生长。 配制孢子培养基还应该考虑配制孢子培养基还应该考虑不同代谢类型不同代谢类型的菌落对多种氨基酸的选择的菌落对多种氨基酸的选择。在制备固体培养基时有两条经验：在制备固体培养基时有两条经验：供供生产用生产用的孢子培养基或作为制备砂土的孢子培养基或作为制备砂土孢子或传代所用的培养基要用比较孢子或传代所用的培养基要用比较单一单一的氮源的氮源，以便保持正常

38、菌落类型的优势；，以便保持正常菌落类型的优势；作为作为选种或分离用选种或分离用的平板培养基，则需的平板培养基，则需采用采用较复杂的有机氮源较复杂的有机氮源，目的是便于选，目的是便于选择特殊代谢的菌落。择特殊代谢的菌落。2. 培养温度和湿度培养温度和湿度 要获得要获得高质量的孢子，其最适温度区间很狭窄高质量的孢子，其最适温度区间很狭窄。制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量影响很大。制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量影响很大。n如土霉素生产菌种如土霉素生产菌种龟裂霉菌龟裂霉菌的孢子，在北方的孢子，在北方干燥干燥地区孢地区孢子斜面长的快，在子斜面长的快，在含少量水分含少量水分的试管斜面培养基中的试

39、管斜面培养基中下部下部孢子孢子长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地区，斜面孢长的好，而上部孢子稀少；气温高，湿度大的地区，斜面孢子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。子长的慢，试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。n 空气中相对湿度高时，培养基内的水分蒸发少，相对湿空气中相对湿度高时，培养基内的水分蒸发少，相对湿度低时，培养基内的水分蒸发多。度低时，培养基内的水分蒸发多。 在一定条件下培养斜面孢子时，在在一定条件下培养斜面孢子时，在北方北方相对湿度控制在相对湿度控制在40404545，在，在南方南方相对湿度控制在相对湿度控制在3535一一4242，所得孢子，所得孢子质量较好。质量较好。

40、n一般来说，一般来说，真菌真菌对湿度要求对湿度要求偏高偏高，而，而放线菌放线菌对湿度要求对湿度要求偏低偏低。 在培养箱培养时，如果相对湿度偏低，可放在培养箱培养时，如果相对湿度偏低，可放入盛水的平皿，提高墙养箱内的相对湿度。为了入盛水的平皿，提高墙养箱内的相对湿度。为了保证新鲜空气的交换，培养箱每天宜开启几次，保证新鲜空气的交换，培养箱每天宜开启几次，以利于孢子生长，现代化的培养箱以利于孢子生长，现代化的培养箱恒温、恒湿，恒温、恒湿，并可换气并可换气，不用人工控制，不用人工控制 最适培养温度和湿度是相对的，例如相对湿最适培养温度和湿度是相对的，例如相对湿度、培养基组分不同，对微度、培养基组分不

41、同，对微 生物的最适温度会有生物的最适温度会有影响。培养温度、培养基组分不同也会影响到微影响。培养温度、培养基组分不同也会影响到微生物培养的最适相对湿度。生物培养的最适相对湿度。3. 培养时间和冷藏时间培养时间和冷藏时间n 孢子的培养工艺一般选择在孢子的培养工艺一般选择在孢子成熟阶段时终止孢子成熟阶段时终止培养培养，此时显微镜下可见到成串孢子或游离的分散，此时显微镜下可见到成串孢子或游离的分散孢子。孢子。n孢子过于年轻经不起冷藏；过于衰老会导致生产能孢子过于年轻经不起冷藏；过于衰老会导致生产能力下降；孢子培养时间应控制在力下降；孢子培养时间应控制在孢子量多、孢子成孢子量多、孢子成熟、发酵产量正

42、常熟、发酵产量正常的阶段终止培养。的阶段终止培养。n冷藏时间：冷藏时间：宜短不宜长宜短不宜长。n如土霉素菌种孢子斜面培养如土霉素菌种孢子斜面培养4 4天左右，即于天左右，即于44冰箱冰箱保存，发现冷藏保存，发现冷藏7-87-8天菌体自溶，而培养天菌体自溶，而培养5 5天以后冷天以后冷藏，藏，2020天未发现自溶。天未发现自溶。n链霉素生产菌，斜面孢子在链霉素生产菌，斜面孢子在6 6 冷藏两个月后冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低的发酵单位比冷藏一个月降低8%8%。4.接种量 接种量的大小影响到一定量培养基中孢子的个体数量接种量的大小影响到一定量培养基中孢子的个体数量的多少，进而影响菌体的生

43、长状态。的多少，进而影响菌体的生长状态。 凡接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落者为凡接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落者为正常接种正常接种。传代用传代用斜面孢子：菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代。斜面孢子：菌落分布较稀，适于挑选单个菌落进行传代。接种接种摇瓶或进罐用摇瓶或进罐用：要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要：要求菌落密度适中或稍密，孢子数达到要求。求。3cm3cm* *20cm20cm试管斜面，丝状菌孢子试管斜面，丝状菌孢子10107 7。 接入种子罐的孢子接种量对发酵生产影响（如青霉素）：接入种子罐的孢子接种量对发酵生产影响（如青霉素）：过少，进罐后长出的球状体过大

44、，影响通气；过多，进罐后过少，进罐后长出的球状体过大，影响通气；过多，进罐后不能维持很好的球状体不能维持很好的球状体n 获得高质量孢子，需对菌种质量加获得高质量孢子，需对菌种质量加以控制，定期分离复壮。制备好的斜面以控制，定期分离复壮。制备好的斜面孢子，经摇瓶发酵试验合格后用于发酵孢子，经摇瓶发酵试验合格后用于发酵生产。生产。n 种子质量受孢子质量、培养基、培种子质量受孢子质量、培养基、培养条件、种龄、接种量等因素影响。养条件、种龄、接种量等因素影响。n 摇瓶种子质量以外观颜色、效价、摇瓶种子质量以外观颜色、效价、菌丝浓度或黏度及糖氮代谢、菌丝浓度或黏度及糖氮代谢、pHpH变化等变化等为制备，

45、符合要求方可进罐。为制备，符合要求方可进罐。 （二）（二） 影响种子质量的因素影响种子质量的因素 1. 培养基培养基原材料质量：原材料质量： 种子培养基原材料质量的控制类似于孢子培养基原材料质种子培养基原材料质量的控制类似于孢子培养基原材料质量的控制。量的控制。原料质量的波动，起主要作用的是其中的原料质量的波动，起主要作用的是其中的无机盐含量的不无机盐含量的不同同。P含量的多少也影响种子的质量。含量的多少也影响种子的质量。氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，加入其他的营养物氨基酸发酵中，淀粉水解糖制备后，加入其他的营养物（麸皮水解液、豆饼水解液、玉米浆），也对种子质量多少有（麸皮水解液、豆饼水解液

46、、玉米浆），也对种子质量多少有些影响。些影响。 种子培养基的营养成分应种子培养基的营养成分应适合种子培养适合种子培养的需要，的需要，一般选择有利孢子发芽和菌丝生长的培养基，营养一般选择有利孢子发芽和菌丝生长的培养基，营养成分丰富完全，使菌丝粗壮并具有较强活力。成分丰富完全，使菌丝粗壮并具有较强活力。一般一般情况：培养基糖分要少，氮源要多，无机盐所占的情况：培养基糖分要少，氮源要多，无机盐所占的比例要大。比例要大。 种子罐和发酵罐培养基成分趋于一致也有好处，种子罐和发酵罐培养基成分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各成分的数量根据目的各自确定。种子很快适应，但各成分的数量根据目的各自确定。 总之

47、，各成分选择得当，才能发挥菌种的特征，总之，各成分选择得当，才能发挥菌种的特征，提高产量。提高产量。 种子培养基的种子培养基的pHpH值要比较稳定值要比较稳定，以适合菌的生，以适合菌的生长和发育。长和发育。pHpH变化会引起各种酶活力的改变，对菌变化会引起各种酶活力的改变，对菌丝形态和代谢途径影响很大。丝形态和代谢途径影响很大。2. 培养条件：培养条件：（1 1）选择最适温度）选择最适温度（2 2）通气搅拌通气搅拌：各级种子罐或同级种子罐的各：各级种子罐或同级种子罐的各个不同时期的需氧量不同，区别控制。前期需个不同时期的需氧量不同，区别控制。前期需氧少；后期需氧多。氧少；后期需氧多。Eg:Eg

48、:青霉素种子制备，通气量充足可提高种子质青霉素种子制备，通气量充足可提高种子质量。量。土霉素发酵，一级种子罐通气量少有利发酵。土霉素发酵，一级种子罐通气量少有利发酵。（3 3）补料工艺：种子罐培养一定时间，补入一）补料工艺：种子罐培养一定时间，补入一定量种子培养液定量种子培养液3. 种龄种龄种龄种龄(seed age)(seed age)指种子罐中培养的种子开始移入下一指种子罐中培养的种子开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。级种子罐或发酵罐时的培养时间。 适宜时间适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的：以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长对数生长期期，且培养液中，且培养液中菌体量还未达到最高

49、峰菌体量还未达到最高峰时，较为适宜。时，较为适宜。 过老过老：生产能力下降，菌体自溶。：生产能力下降，菌体自溶。 过于年轻过于年轻：前期生长缓慢，发酵周期延长，产物形：前期生长缓慢，发酵周期延长，产物形成时间推迟，甚至造成异常发酵。成时间推迟，甚至造成异常发酵。 嗜碱性芽孢杆菌（嗜碱性芽孢杆菌（Bacillus alkalophilusBacillus alkalophilus) )生产碱性蛋生产碱性蛋白酶（白酶（alkaline proteinase/proteasealkaline proteinase/protease） ，培养，培养1212小时接小时接种，酶活最高。种，酶活最高。4.

50、接种量接种量 (seed volume)指移入的种子的体积和接种后培养液的体积比指移入的种子的体积和接种后培养液的体积比。 Antibiotic： 7%7.5% Glu： 1%接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁殖速度。采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使采用较大接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物形成提前。产物形成提前。 原因：原因：1、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于、种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于对基对基 质的利用质的利用 、生产菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。、生产

51、菌迅速占据了整个培养环境，减少染菌机会。 但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液黏度增加，溶氧但过多，易使菌体（菌丝体）生长过快，培养液黏度增加，溶氧降低，产物合成受影响。降低，产物合成受影响。 e.g. 嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶：嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶： 接种接种1%，酶活最高；，酶活最高；1.5%4%影响不大；大于影响不大；大于4%，酶产量明显下降。，酶产量明显下降。 制霉菌素生产中，制霉菌素生产中，1%比比10%效果好，效果好，0.1%与与1%效果相当。效果相当。 发酵生产的趋势：采取大接种量及丰富培养基。发酵生产的趋势：采取大接种量及丰富培养基。 如谷氨酸：如谷氨酸： 大

52、接种量大接种量20% ，高生物素，高青霉素的强制，高生物素，高青霉素的强制发酵工艺。发酵工艺。 有的采用双种法增大接种量有的采用双种法增大接种量：两只种子罐：两只种子罐 一只发酵罐一只发酵罐 如卡那霉素：双种比单种的发酵单位（如卡那霉素：双种比单种的发酵单位（fermentation titer unit）提高）提高8%，到达产量，到达产量 高高 峰的峰的 时间提前。时间提前。 倒种法倒种法：将培养适宜的发酵液倒出适量给另一个发酵罐作为：将培养适宜的发酵液倒出适量给另一个发酵罐作为种子。种子。 如如 链霉素：倒种法比单种法的发酵单位提高链霉素：倒种法比单种法的发酵单位提高12%。通常接种量，细

53、菌通常接种量，细菌1-5%1-5%，酵母菌，酵母菌5-10%5-10%，霉菌，霉菌7-15%7-15%，有时有时20-25%20-25% 四四. 种子质量的控制措施种子质量的控制措施 种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力的生产能力 必须保证生产菌种的稳定性必须保证生产菌种的稳定性 提供种子培养的适宜环境条件，保证无杂菌侵入提供种子培养的适宜环境条件，保证无杂菌侵入 1. 菌种稳定性的检查菌种稳定性的检查： 少量菌种少量菌种无菌生理盐水无菌生理盐水递增稀释递增稀释平板划线培养。平板划线培养。 挑出挑出形态整齐，孢子丰满形态整齐，孢

54、子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力。产能力。 2. 无菌检查：无菌检查： 显微镜观察、种子液进行无菌检验、生化分析。显微镜观察、种子液进行无菌检验、生化分析。 种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、异常现象及镜检是否有杂菌。异常现象及镜检是否有杂菌。五五. 种子质量的判断种子质量的判断： 考察种子在发酵罐中所表现出来的生产能力考察种子在发酵罐中所表现出来的生产能力。感官判断：看颜色、闻气味感官判断：看颜色、闻气味 理化指标测定：理化指标测定： 1、pH值值 2、培养基灭菌后的糖、氨基氮、培养基灭菌后

55、的糖、氨基氮 3、菌体形态、浓度、菌体形态、浓度 4、产物量、产物量 5、残糖浓度、残糖浓度 6、酶活力、酶活力 （如土霉素生产，淀粉酶的活（如土霉素生产，淀粉酶的活力与发酵单位有一定的关系）。力与发酵单位有一定的关系）。六六 种子质量标准种子质量标准 不同产品、不同菌种以及不同工艺条件的种子质量有不同产品、不同菌种以及不同工艺条件的种子质量有所不同。判断种子质量的优劣需要有丰富的实践经验。所不同。判断种子质量的优劣需要有丰富的实践经验。发酵工业生产上常用的种子质量标准：发酵工业生产上常用的种子质量标准： (1)(1)细胞或菌体细胞或菌体种子培养的目的种子培养的目的：获得健壮和足够数量的菌体。

56、：获得健壮和足够数量的菌体。种子质量的重要指标：菌体形态、菌体浓度以及培养液的外种子质量的重要指标：菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观。观。菌体形态菌体形态可通过可通过显微镜观察显微镜观察来确定，以单细胞菌体为种子的来确定，以单细胞菌体为种子的质量要求是菌体健壮、菌形一致均匀整齐，有的还要求有质量要求是菌体健壮、菌形一致均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态。一定的排列或形态。以霉菌、放线菌为种子的质量要求是以霉菌、放线菌为种子的质量要求是菌丝粗壮菌丝粗壮，对某些染料，对某些染料着色力强、生产旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。着色力强、生产旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况良好。菌体的生长量菌体

57、的生长量也是种子质量的重要指标，生产上常用离心沉也是种子质量的重要指标，生产上常用离心沉淀法、光密度法和细胞计数法等进行测定。种子液外观如淀法、光密度法和细胞计数法等进行测定。种子液外观如颜色、黏度等也可作为种子质量的粗略指标。颜色、黏度等也可作为种子质量的粗略指标。(2)2)生化指标生化指标 种子液的糖、氮、磷含量的变化和种子液的糖、氮、磷含量的变化和pHpH值变化是菌体值变化是菌体生长繁殖、物质代谢的反映，不少产品的种子液质量是生长繁殖、物质代谢的反映，不少产品的种子液质量是以这些物质的利用情况且变化为指标的。以这些物质的利用情况且变化为指标的。(3)(3)产物生成量产物生成量 种子液中产物的生成量是多种发酵产品发酵中考察种子液中产物的生成量是多种发酵产品发酵中考察种子质量的重要指标，因为种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少种子液中产物生成量的多少是种子生产能力和成熟程度的反映是种子生产能力和成熟程度的反映。 (4)(4)酶活力酶活力 测定种子液中某种酶的活力，作为种子质量的标准，测定种子液中某种酶的活力，作为种子质量的标准，是一种较新的方法。是一种较新的方法。 如：土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素如：土霉素生产的种子液中的淀粉酶活力与土霉素发酵单位有一定的关系，因此种子液淀粉酶活力可作为发酵单位有一定的关系，因此