细胞生物学3细胞生物学研究方法02ppt课件

1、基基因因敲敲除除基基因因敲敲除除表表示示图图1 1基基因因敲敲除除表表示示图图2 2基基因因敲敲除除原原理理 Knockout Mice 未未来来的的生生物物技技术术Caenorhabditis elegansDrosophila melanogasterArabidopsis thalianaC. elegansZebrafish免疫胶体金技术 根本原理：根本原理： 氯金酸氯金酸(HAuCl4)在复原剂作用下，可聚合成在复原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，构成带负电的疏水胶状溶一定大小的金颗粒，构成带负电的疏水胶状溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体形状，故液。由于静电作用而成为稳定的胶体

2、形状，故称胶体金。称胶体金。 胶体金标志：本质上是蛋白质等高分子被吸附胶体金标志：本质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒外表的过程。到胶体金颗粒外表的过程。 吸附机理：因胶体金颗粒外表负电荷，吸附机理：因胶体金颗粒外表负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而构与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而构成结实结合。用复原法可以方便地从氯成结实结合。用复原法可以方便地从氯金酸值被各种不同颜色的胶体金颗粒。金酸值被各种不同颜色的胶体金颗粒。 运用：胶体金粒子对蛋白质有很强的吸运用：胶体金粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌蛋白、免疫附功能，可以与葡萄球菌蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、

3、球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血洁白蛋白多肽聚合物等结合，激素、牛血洁白蛋白多肽聚合物等结合，因此在根底研讨和临床实验中成为非常因此在根底研讨和临床实验中成为非常有用的工具。有用的工具。免疫胶体金标定免疫胶体金标定(Immunogold labeling) 利用了胶体金颗粒具有高电子密度的特利用了胶体金颗粒具有高电子密度的特性，在蛋白质与金粒子结合处，在显微性，在蛋白质与金粒子结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。因此，可以察看镜下可见黑褐色颗粒。因此，可以察看蛋白质的分布区域。蛋白质的分布区域。 在体外模拟体内的生理环境，培育从机体中取出在体外模拟体内的生理环境，培育从机体中取出的细

4、胞，并使之生存和生长的技术为细胞培育技的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培育技术。培育中的细胞不受体内复杂环境的影响，人术。培育中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改动培育条件为改动培育条件( (如物理、化学、生物等外界要素如物理、化学、生物等外界要素的变化的变化) )即可进一步察看细胞在单要素或多要素的即可进一步察看细胞在单要素或多要素的影响下的生理功能变化。影响下的生理功能变化。细胞培育细胞培育人的细胞培育人的细胞培育 细胞系细胞系: : 原代培育物经初次传代胜利后即为细胞系，有原代培育物经初次传代胜利后即为细胞系，有无限的传代才干。无限的传代才干。细胞株细胞株: : 经过原代培育或经过

5、细胞克隆与选择而建立的、经过原代培育或经过细胞克隆与选择而建立的、具有特异的性质或标志的细胞系，但是它们具有有限的具有特异的性质或标志的细胞系，但是它们具有有限的传代才干。传代才干。原代培育：是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立原代培育：是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立刻进展培育。因此，较为严厉地说是指胜利传代之前的刻进展培育。因此，较为严厉地说是指胜利传代之前的培育，此时的细胞坚持原有细胞的根本性质培育，此时的细胞坚持原有细胞的根本性质 植物组织培育植物组织培育 植物原生质体培育植物原生质体培育 植物组织培育植物组织培育 外植体外植体愈伤组织愈伤组织新植株新植株 来源于细胞，而不具有

6、完好的细胞构造，但包含了进展正常生物学反响所需来源于细胞，而不具有完好的细胞构造，但包含了进展正常生物学反响所需的物质的物质(如供能系统和酶反响体系等如供能系统和酶反响体系等)组成的体系即为非细胞体系组成的体系即为非细胞体系 近年来非细胞体系在研讨近年来非细胞体系在研讨DNA复制、复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输机制以反细胞核装配机制以反细胞核装配(包括染色质装配、核膜装配及核骨架的装配包括染色质装配、核膜装配及核骨架的装配)等。等。概念概念 流式细胞术流式细胞术Flow CytometryFlow Cytometry，FCMFCM 利用流式

7、细胞仪对处在快速、直线、流动形状中的单细胞或生利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动形状中的单细胞或生物颗粒进展多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的物颗粒进展多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。现代细胞分析技术。 流式细胞仪流式细胞仪Flow Cytometer)Flow Cytometer) 集激光技术、电子物理技术、光电丈量技术、电子计算机技集激光技术、电子物理技术、光电丈量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。技仪器。 原理：原理： 将待测细胞染色后制成

8、单细胞悬液。用一定压力将待测样将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就可以包鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就可以包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行陈列，依次经过检测区域。被下单行陈列，依次经过检测区域。Fluorescence Activated Cell Sorting488 nm laser+-Charged Pla

9、tesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector细细胞胞分分选选细细胞胞标标志志染染色色体体分分选选染染色色体体标标志志FACSAria科研型流式细胞仪检测范围细胞大小细胞粒度细胞外表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞构造特异性抗原细胞外表/胞浆/核细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能流式细胞仪的任务原理流式细胞仪的任务原理 光学系统光学系统 激光光源激光光源 光搜集系统光搜集系统 液流系统液流系统 流动室流动室 液流驱动系统液流驱动系统 电子系统电子系统 光电转

10、换光电转换 数据处置系数据处置系统统 细胞分选系统细胞分选系统 细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交细胞工程技术是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有方案地改动或发明细胞遗传先的设计，有方案地改动或发明细胞遗传性的技术。包括体外大量培育和繁衍细胞，性的技术。包括体外大量培育和繁衍细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内容包括：细胞交融、细胞生物反响器、要内容包括：细胞交融、细胞生物反响器、染色体转移、细胞器移植、

11、基因转移、细染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培育。胞及组织培育。细胞工程细胞工程在自发或人工诱导下，在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞两个不同基因型的细胞或原生质体交融构成一或原生质体交融构成一个杂种细胞。根本过程个杂种细胞。根本过程包括细胞交融构成异核包括细胞交融构成异核体体(heterokaryon)、异核、异核体经过细胞有丝分裂进体经过细胞有丝分裂进展核交融、最终构成单展核交融、最终构成单核的杂种细胞。核的杂种细胞。 细胞交融细胞交融 聚乙二醇聚乙二醇PEG法细胞交融过程法细胞交融过程显微镜下细胞交融过程显微镜下细胞交融过程BHK-21细胞用核骨架蛋白抗体进展免疫胶体金

12、标志的结果细胞用核骨架蛋白抗体进展免疫胶体金标志的结果IF：中间纤维；：中间纤维；g:金颗粒；金颗粒；N:核区核区外周血血细胞扫描电镜标本的制备外周血血细胞扫描电镜标本的制备取血取血-PBS洗三次洗三次-滴片滴片(有有Formvar膜膜)-冷的冷的1%戊二醛戊二醛4度固定度固定2小时小时-PBS-1%四氧化锇，四氧化锇，30分分-PBS-50、70、90%丙酮各一次，丙酮各一次，100%两次两次-50、70、90%醋酸异戊酯丙酮溶液各一次，醋酸异戊酯丙酮溶液各一次，100%醋酸异戊酯两次醋酸异戊酯两次-临界点枯燥临界点枯燥-喷碳、喷碳、金金察看察看人类血细胞人类血细胞SEM照片照片 GFP是从

13、一种生活在北太平洋冰冷水域的水母体内发现是从一种生活在北太平洋冰冷水域的水母体内发现的。在蛋白质编号的。在蛋白质编号lema中可以看到中可以看到GFP发色团的骨架在发色团的骨架在左边。蛋白质链构成一个圆柱形罐头蓝色，子链的左边。蛋白质链构成一个圆柱形罐头蓝色，子链的一部分直接从中间穿过绿色，发色团刚好在罐头盒一部分直接从中间穿过绿色，发色团刚好在罐头盒的中间，它被维护起来以免受周围环境的影响的中间，它被维护起来以免受周围环境的影响 GFP的的纯溶液在典型的室光下呈黄色，但是当被拿到户外的阳纯溶液在典型的室光下呈黄色，但是当被拿到户外的阳光下时，它会发出鲜绿的颜色。这种蛋白质从阳光中吸光下时，它

14、会发出鲜绿的颜色。这种蛋白质从阳光中吸收紫外光，然后以能量较低的绿光方式发射出来。收紫外光，然后以能量较低的绿光方式发射出来。绿色荧光蛋白的运用绿色荧光蛋白的运用 绿色荧光蛋白是当代科学和医学领域最重绿色荧光蛋白是当代科学和医学领域最重要的工具之一，它从显微程度上照亮了生要的工具之一，它从显微程度上照亮了生命命 。随着病毒在宿主体内不断分散，他就可以经过跟踪发出的绿随着病毒在宿主体内不断分散，他就可以经过跟踪发出的绿光来察看病毒的分散途径，或者他把它接合到一种蛋白质上光来察看病毒的分散途径，或者他把它接合到一种蛋白质上并经过显微镜察看它在细胞内部的挪动并经过显微镜察看它在细胞内部的挪动科学运用

15、绿色荧光蛋白跟踪大脑神经细科学运用绿色荧光蛋白跟踪大脑神经细胞的发育过程。胞的发育过程。绿色荧光蛋白的发现下村修 1962年首先从水母年首先从水母中分别绿色荧光蛋中分别绿色荧光蛋白的科学家，他发白的科学家，他发现这种蛋白在紫外现这种蛋白在紫外线光中呈现亮色。线光中呈现亮色。 1992年，道格拉斯年，道格拉斯普瑞金拿到了绿色普瑞金拿到了绿色荧光蛋白的基因。荧光蛋白的基因。 绿色荧光蛋白的推行马丁-查尔菲 1993年，马丁年，马丁查尔查尔菲胜利地经过基因菲胜利地经过基因重组的方法使得除重组的方法使得除水母以外的其他生水母以外的其他生物物(如大肠杆菌等如大肠杆菌等)也能产生绿色荧光也能产生绿色荧光蛋

16、白，证明了绿色蛋白，证明了绿色荧光蛋白与活体生荧光蛋白与活体生物的相容性。物的相容性。绿色荧光蛋白的改造钱永健 进展了大刀阔斧的化学进展了大刀阔斧的化学改造，不但大大加强了改造，不但大大加强了它的发光效率，还开展它的发光效率，还开展出了红色、蓝色、黄色出了红色、蓝色、黄色荧光蛋白，使得荧光蛋荧光蛋白，使得荧光蛋白真正成为了一个琳琅白真正成为了一个琳琅满目的工具箱，供生物满目的工具箱，供生物学家们选用。学家们选用。绿色荧光蛋白质在科学研讨和艺术领域发扬绿色荧光蛋白质在科学研讨和艺术领域发扬作用的美丽而令人诧异的例子。作用的美丽而令人诧异的例子。 3 3位诺贝尔奖得主第一次分别出的荧光基因，就是从

17、上面照片中的这位诺贝尔奖得主第一次分别出的荧光基因，就是从上面照片中的这种水晶水母体内获得的。种水晶水母体内获得的。 水晶水母水晶水母 图片中的小老鼠是图片中的小老鼠是2019年年7月在大阪大学降生的，它们是第一种可以月在大阪大学降生的，它们是第一种可以在夜里发光的哺乳动物。研讨人员可利用荧光老鼠研讨胎儿发育。在夜里发光的哺乳动物。研讨人员可利用荧光老鼠研讨胎儿发育。 会发光的老鼠会发光的老鼠 杰夫杰夫利希曼利希曼(Jeff Lichtman)之手，展现了大脑内的衔接，图片之手，展现了大脑内的衔接，图片中美丽的中美丽的“彩虹就是神经系统网络。彩虹就是神经系统网络。脑内衔接脑内衔接 这两只荧光猪

18、诞生于中国黑龙江省哈尔滨东北农业大学的实验室。这两只荧光猪诞生于中国黑龙江省哈尔滨东北农业大学的实验室。它们的发光身手并不是转基因技术的直接产物，而是从其经过基因它们的发光身手并不是转基因技术的直接产物，而是从其经过基因改造的母亲那里遗传而来。改造的母亲那里遗传而来。两只荧光猪 发红光的猫发红光的猫左侧的猫由韩国研讨人员左侧的猫由韩国研讨人员2019年晚些时候打造，可以在紫外线下年晚些时候打造，可以在紫外线下发出红光。某些情况下，这些荧光蛋白基因可用作一种分子开关，发出红光。某些情况下，这些荧光蛋白基因可用作一种分子开关，触发其它细胞活动触发其它细胞活动 GFP宾尼兔宾尼兔 荧光兔荧光兔“阿尔

19、巴阿尔巴(Alba)。阿尔巴是在转基因技术协助下。阿尔巴是在转基因技术协助下拥有这种荧光基因的。拥有这种荧光基因的。的问世在世界上引发的问世在世界上引发不小争议。不小争议。 蝌蚪也发光蝌蚪也发光 荧光鱼荧光鱼 在约克镇科技公司将荧光鱼引入市场后不久，荧光蛋白便在约克镇科技公司将荧光鱼引入市场后不久，荧光蛋白便迅速在商业上得到运用。迅速在商业上得到运用。 绿色荧光蛋白质可以协助科学家了解细胞机制如绿色荧光蛋白质可以协助科学家了解细胞机制如何任务。利用转基因技术，一切细胞和动物都可何任务。利用转基因技术，一切细胞和动物都可以产生荧光蛋白质。以产生荧光蛋白质。 康涅狄格学院化学家、康涅狄格学院化学家、作者马克作者马克齐齐默默(Mark Zimmer)将绿色荧光蛋白质称之为将绿色荧光蛋白质称之为“21世纪的显微镜。经过让基因携带绿色荧光蛋白世纪的显微镜。经过让基因携带绿色荧光蛋白质质与瘤转移或大脑功能有关的基因与瘤转移或大脑功能有关的基因科学科学家只需经过寻觅荧光便可知道基因何时以及为什家只需经过寻觅荧光便可知道基因何时以及为什么么“开启。开启。 细胞构造、蛋白质如受体、抗原、抗体、酶、细胞细胞构造、蛋白质如受体、抗原、抗体、酶、