精减4重组-13硕ppt课件

1、第四章 DNA重组DNA重组DNA recombinationDNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，即核苷酸序列的交换、重排(rearrangement)和转移景象，称为DNA重组。重组产物称为重组体DNA。DNA重组的广泛性广泛存在于各类生物真核生物基因组间重组多发生在减数分裂时同源染色体之间的交换。细菌及噬菌体来自不同亲代两组DNA之间可经过多种方式进展遗传重组。DNA重组的生物学意义迅速添加群体的遗传多样性经过优化组合积累有意义的遗传信息参与许多重要的生物学过程 为DNA损伤或复制妨碍提供修复机制-重组修复 某些生物的基因表达受DNA重组调理DNA重组在相应序列之间准确发生，在重组

2、染色体上既不多加也不丧失任何碱基。重组可分为三种类型，其共同点是在两个DNA双链之间发生物理性物质交换。不同类型发生的机制不同。DNA重组的特点DNA重组机制一、同源重组(homologous recombination)二、位点特异性专注性重组(site-specific recombination)三、转座重组(transposition recombination)一、同源重组(homologous recombination)普通性重组(general recombination)是在两个DNA分子的同源序列间直接进展交换的一种重组方式。真核生物中，同源重组发生在减数分裂时期细菌的转化

3、、接合、转导一、同源重组1 Holliday模型 Robin Holliday于1964年提出2 大肠杆菌同源重组的分子根底1 Holliday模型Branch migration异源双链区分支迁移Holliday 衔接重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本，称为片段重组体。重组体含有一段异源双链区，其两侧来自不同亲本，称为拼接重组体。Holliday模型构成小结1 重组始于双链断裂与再衔接两条同源序列先整齐陈列两个配对双链DNA的同源链中相应位点发生断裂2 经过分支迁移产生异源双链重组结合点可以沿双链挪动3 构成Holliday中间体4 Holliday中间体切开并修复，切口方向决议重

4、组结果 片段重组体前后两个切口在同一条链上拼接重组体前后两个切口在不同链上DNA在分支点构成带有一些单链十字形Holliday中间体PotterDressler噬菌体同源重组双链之间进展衔接所需求的同源区域最短是多少？经过质粒及噬菌体把短的同源序列引入细菌的实验阐明，假好像源区小于75bp那么重组频率降低。2 大肠杆菌同源重组的分子根底在细菌中识别重组位点重组仅涉及DNA分子的限定区域而不是完好的染色体重组的普经过程是一样的：1两条序列先平行陈列，然后两条序列的其中一条单链 均发生断裂2断裂分子的一个单链与其同源双链相互作用3配对区域延伸-分支迁移4内切核酸酶消化同源双链2 大肠杆菌重组的分子

5、根底每一步都需求酶的催化重组Recombination有关的酶RecA蛋白与RecBCD系统RuvA 、RuvB和 RuvC蛋白RecA蛋白及其功能在E.coli中，RecA蛋白参与重组是最关键的步骤1 诱发SOS反响 作为共蛋白酶(co-protease)促进LexA蛋白的水解；是SOS反响最初发动的因子2 促进DNA单链的同化 单链同化即指单链与同源双链分子发生链交换，从而产生重组过程中的DNA配对、Holliday中间体构成、分支迁移等步骤。 严重的DNA损伤产生大量单链缺口 LexA阻遏蛋白裂解，阻遏作用解除 激活RecA蛋白需求单链DNA和ATP存在 一系列基因表达包括修复基因 DN

6、A SOS修复易错修复，突变添加RecA蛋白诱发SOS反响 E. coli的SOS反响 重组修复损伤ABCD序列一样重组RecA蛋白介导的DNA链交换模型单链同化RecA蛋白与单链DNA结合复合物与同源双链DNA结合入侵单链与双链中的互补链配对，同源链被置换RecA蛋白与单链DNA的结合具有协同性RecBCD系统及其功能1 任何部位的单链DNA都能借助RecA蛋白与同源双链DNA进展链交换。2 单链DNA可由多种途径产生。3 RecBCD酶是产生参与重组的DNA单链的主要途径，产生3单链末端。该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码。RecBCD系统及其功能具有三种酶的活性1 依赖

7、于ATP的核酸外切酶活性2 可被ATP加强的核酸内切酶活性3 ATP依赖的解螺旋酶活性产生3单链DNA序列序列及其功能是一段特殊的碱基序列，其一致序列是 5-GCTGGTGG它的存在能显著提高重组的频率能在重组过程中调理RecBCD的酶活性作为其从3-5外切酶活性转变为5-3外切酶活性的信号RuvA 、RuvB和 RuvC蛋白RuvA蛋白识别Holliday衔接，协助RuvB蛋白催化分支的迁移。以一种特别的方式构成四聚体，呈四重对称。RuvB蛋白是一种解链酶，催化重组中分支的迁移，是一种环状六聚体蛋白。单独结合DNA的效率并不高，需求RuvA的协助。RuvC蛋白是一种特殊的核酸内切酶，在重组中

8、促进Holliday衔接的分别，又称拆分酶，是一种二聚体蛋白。其作器具有一定的序列特异性，其作用的一致序列为5-(A/T)TT (G/C)-3识别衔接分支迁移衔接分别产生3单链二、位点专注性重组(site-specific recombination)指发生在DNA特异性位点上的重组参与重组的特异性位点需求专门的蛋白质识别和结合二、特异位点重组位点专注性重组噬菌体在E.coli细胞中以两种方式存在：裂解形状与溶原形状前噬菌体两种类型间的转换经过位点特异性重组实现为了进入溶原形状，游离DNA必需整合到宿主DNA中(整合反响)；为了从溶原形状进入裂解周期，前噬菌体DNA必需从染色体DNA上切除下来

9、(切除反响) 。 一DNA经过位点特异性重组机制整合和切除1 重组反响在附着位点(attachment site)发生2 与催化有关的酶类一DNA经过位点特异性重组机制整合和切除1 重组反响在附着位点(attachment site)发生 整合和切除过程是在细菌和噬菌体DNA上被称为附着位点的特殊位置上，经过重组作用而实现。一DNA经过位点特异性重组机制整合和切除1 重组反响在附着位点(attachment site)发生在细菌遗传学中，细菌染色体上的这一附着位点称为att。假设这一座位发生突变，那么会抑制的整合。细菌上的附着位点att称为attB(Bacteria)，噬菌体上的称为attP(

10、Phage)attP长度为255bpattB长度为30bp两者含有共同的中心序列15bpO区POPBOB一DNA经过位点特异性重组机制整合和切除1 重组反响在附着位点(attachment site)发生2 与催化重组有关的酶类一DNA经过位点特异性重组机制整合和切除2 催化重组的酶类 整合反响：整合酶Integrase,Int、整合宿主因子Integration Host Factor,IHF 切除反响：整合酶Int、整合宿主因子IHF、噬菌体基因xis产物切除反应整合反应xis噬菌体BB环形噬菌体DNA经过attP位点和attB位点的交互重组将噬菌体DNA变成整合的线形前噬菌体DNA整合i

11、ntegrationattP(255bp)attB(30bp)attO(15bp)二位点特异性重组结果依赖于重组 位点的位置和方向12211212212结果发生倒位结果发生切除切除的环形片段重组位点反方向位于同一DNA分子上重组位点同方向位于同一DNA分子上1位点特异性重组结果小结1 当重组位点反方向位于同一DNA分子上时， 重组结果：发生倒位；2 当重组位点同方向位于同一DNA分子上时， 重组结果：发生切除；3 当重组位点位于不同DNA分子上时， 重组结果：发生整合。三细菌的特异位点重组沙门菌的H抗原H1鞭毛蛋白H2鞭毛蛋白单菌落的沙门菌中经常出现少数呈另一H抗原的细菌细胞鞭毛相转变沙门菌的

12、H片段倒位遗传学分析阐明，这种抗原相位改动是由一段995bp的DNA，称为H片段发生倒位所决议的。hin编码特异的重组酶倒位酶hix为14bp的反向反复序列重组位点Promoterhin能否仍表达？H2、rH1呢？H1呢？沙门菌H片段倒位决议鞭毛相转变沙门菌的H片段倒位遗传学分析阐明，这种抗原相位改动是由一段995bp的DNA，称为H片段发生倒位所决议的。rH1阻遏蛋白与启动子结合阻止H1表达PH片段995bpPH片段995bp为14bp的反向反复序列hixhin编码特异的重组酶倒位酶沙门氏菌的H片段倒位rH1 倒位后，启动子序列与H2、rH1取向相反，H2、 rH1不表达,解除了对H1的抑制

13、，H1表达PPH1鞭毛素H片段995bphin能否仍表达？三、转座重组(transposition recombination)指DNA上的核苷酸序列从一个位置转移到另外一个位置的景象。发生转位的DNA片段称为转座元件、可移位遗传元件( mobile genetic element, MGE)、腾跃基因 (jump gene)转座元件的种类 原核生物转座元件的种类 IS插入序列 TnA family Composite transposon Transposable phage 复制型转座元件 (replicating transposable element)长度较小，普通7002000bp

14、之间两端通常含有1040bp长的IR(inverted repeats)内部普通只需一个基因，编码产物为转座酶缺乏抗生素或其他毒性抗性基因(一)插入序列 insertion sequence， IS l 700 2000 base pair bpGATCGTC -GACGATCCTAGCAG-CTGCTAG GATCGTC -GACGATC Stem-loop 5 GATCGTC 3 CTAGCAG IS的构造 一个构造基因反向反复序列IS的转座机制 当IS转座时，宿主靶部位双链交错切开，经修复后IS两侧构成短的正向反复。基因的表达及其产物的活性?ATGTAAATGTAA(二)转座子(Tran

15、sposon，Tn / TnpA family) l两侧含有3540bp的IRl 较长，2.5 kb 20 kb l内部通常含有不止一个构造基因：转座酶基因、调理基因、抗生素抗性基因(resistance gene) l Tn1 (AmpR) Tn2 (AmpR) Tn3 (AmpR) Tn4 (AmpR StrR) Tn5 (KanR) Tn6 (kanR) Tn7 (StrR TmpR) Tn9 (CamR) Tn10 (TetR) 多个构造基因反向反复序列(三)复合元件/复合转座子 composite element / composite tansposon IS插入到一段带有抗生素抗

16、性基因或其它毒性抗性基因等构造基因的两端，构成复合转座子。IStranspositionmutation ISIS IS L IS R臂 中心区 臂插入结果？ 复合转座子一旦构成，转座功能受较多因子调控 构造特点 IR IR IR IRIRIR IS10L Tn10 (9.3 kb) IS10R IR IR IR IRDRDR IS1L Tn9(2.5 kb) IS1R构造基因两端IS序列方向相反构造基因两端IS序列方向一样两种转座子的稳定性？ 稳定性发生切除DR型 (Instable)IR型 (Stable)InversionB AA BBA发生倒位思索题：转座子Tn9和Tn10，哪一种较稳

17、定？为什么？转座重组产生的效应1. 是基因突变和重排的重要缘由：转座元件的存在，会添加宿主基因组DNA的量，同时引起宿主染色体DNA重组，呵斥染色体断裂、反复、缺失、倒位及易位等。2. 影响临近基因的表达，改动宿主表型：转座元件也可经过干扰宿主基因与其调控元件之间的关系或转座元件本身的作用而从而改动宿主表型。转座重组产生的效应转座元件插入特定基因内部后，很能够导致基因失活，这是转座作用最直接的效应。当转座元件自发插入细菌的启动子时，即可阻止它所控制基因的转录和翻译。由于转座元件带有终止子，其插入将影响支配子中其后基因的表达。转座重组的生物学意义人、小鼠和水稻的基因组大约有40%的序列由转座子衍

18、生而来。低等真核生物和细菌内转座子相应比例较小，约1%-5%。转座子在从低等生物到高等生物的基因和基因组进化过程中曾发扬过非常重要的作用。1. RecA蛋白是怎样调理SOS反响的？2. 什么叫DNA重组？归纳总结三种DNA重组的机制。3. 什么是Holliday中间体？它是如何构成的？RecA和RecBCD系统、Ruv系统是如何发扬作用的？4. 在位点特异性重组中，假设重组位点反向位于同一条DNA上，那么重组后的结果会怎样？假设同方向位于一条DNA上呢？假设重组位点位于不同DNA分子上，重组结果如何？可图示阐明5. 什么是卡序列？它在同源重组中如何发扬作用？复习题6. 在不同的转座子类型中，Tn10与Tn9哪一种转座子较稳定？为什么？7. 以DNA重组为例，说说生物大分子是如何相互作用来影响生命景象的