双缩脲法测定多肽的含量

1、蛋白水解液中多肽含量的测定方法&W1,任国谱宋俊梅I(1山东轻工业学院食品与生物工程学院，山东济南，250100：2湖南亚华乳业博上后工作站，湖南长沙，410116)摘要用10WW)的三氧乙酸沉淀蛋白水解液中的大分子蛋白股.经离心过遞后在上清液中加入双缩腺试剂.于540nm下测定其OD值，继而在Gly-Gly-Tyr-Arg匹肚标准曲线上査岀样品中的多駄含址：关铤词：双缩眠反应：三氯乙霰：多肽含童DetemiinationofContentofPeptidesinProleinHydrolysatesLUWeilfRENGuo-pu2SONGJun-mei1(1.CollegeofFoodan

2、dBioengineering,ShandongInstituteofLightIndustryJinan2501(X).China;HunanYalwaCorp.Ltd.&EastChinaNormalUniversity,Changsha4101!6.China)Abstract：Macromoleculeprotrininproteinhydrolysatewasdepositedbyusing10%trichloroaceucacid.Aftercentrifugalizationandhitration,biuretreagentwasaddedtotheclearsolution.

3、TheODvaluewasmensuratedunder540nm.ThenthecontentofpeptidesofthesamplewasobtainedtluoygJioonuascedon(hestandardcurveofGly-Gly-Tyr-Arg(etrapeptideKeywords：biuretreaction:trichloroaceticacid：contentofpeptides中因分类号：Q51文献标识母A文章编号：1002-6630(2005X)7-0169-03蛋白庶龙人休必不可少的肯养素Z但不同蛋口质由F梵氨基酸组成和空间结的不同.在人体内的消化吸收率也大不

4、相同凶。将爱白质水解为多肽可以大大提高其消化吸收率.近代研宪表明.彊白质在体内消化后并不完全以氨站酸的形式吸收，而大都是以算肚的形式吸收仏因此.水解蛋白质生产多肪产品正成为当今研究的热门课题之一。在水解蛋白质的过程中,控制蛋白质的水解程度，尽可能少的产生融廡酸，尽可能多的得到II标产物釣减是水解的根本II的，这就箜求建立-嘟唯快速测定水解液中多肽含吊册話效方法。对徴门质水解程度的渕定有名种方法.三氯乙酸法是其中常用的一种,它是利用三氮乙酸沉淀水解液中的大分子蛋白质.继而以微试凯氏定氮法测定上消液中可溶性氮的含爪，然斤城去水解Z酬样胡溶液可潞性忍的含就再与样品中的总比.从而确定梵水解程麼。此法中

5、徴毎凯氏定氮法测丘的是水解液中川溶性总氮的含呈.若改用双缩腺法(叭便可测定其中含二个(包括二个)以上呱铤的多肽的含fftSe本文利川10%的三眾乙酸沉淀样品水解液中的人分子蛋白质，经离心过滤后，衽上淸液中加入双缩I拯试剂，丁54()nm测定其OD伯，继而AGly-Gly-Tyr-Arg皿肽标恋曲线上查出样品中的多肚仟弗:从而建龙了收摘日期：2004-0602作者简介：鲁伟(1979)男碩士研究生研究方向为攸生物醃技术.1702005.bL26.No.7食品科学分析检验种快速测疋蛋门水餡液屮多狀介吊的右效方法。1材料与方法11林料主要试剂Gly-Gly-Tyr-ArgSigma公司。CuSOf5

6、H：O；NaOH：氨水:三氯乙酸.分析纯。胰蛋白艇，杭州三叶生物化工厂2000U/g,(4)ProiainexNovozyiin?,1.5AU/g主耍仪器和设备紫外可见分光光度计.UV.9100型.北京珊利分析仪器公司。低速离心机LD52A型.北京医用离心机厂超级恒温水浴锅.BO220型.上海实验仪器厂有眼公诃。电子分析天平.AL204型:PH计,DELTA320型.METTLERTOLEDO公司.方法%肚含最的测定程殍:取25ml样品溶液加入2.5ml10%(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液.于漩涡泡合仪上混合均匀，mlOmin.然后在4000r/min下离心I5min.将上消液全部转移到

7、50ml容量瓶中.并用5%的TCA定容至刻度.拥匀.然后取6.0ml上述涪液丙另一试管中,加入双编眠试剂4.0m1(样液:双缩IK试剂=3:2.V/V).干淡涡混合仪上混合均匀.静罢lOmin.2000r/min离心lOmin.取上清液J540nm下测定OD值,对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度C(mg/ml),进而可求得样品中多fit含fib2结果与讨论标准曲线的制作取I个10ml的容丘瓶.用5%的TCA依次配制0.0、0.2x0.40.6.0.81.0.1.2.1.4、1.6和1.8mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液,然后分别取6.0ml标准港液，加入4.0ml双缩麻

8、试剂,于漩涡混合仪上泡合均匀lOmin2000r/min心lOmin.取上消液540nm下测定OD做以第一管做空白对照).以肽的浓度为横坐标X(mg/ml),ODffi为纵也标Y制作标准曲线(图I).得到回归方y=0.368lx+0.0013,R2=U沉淀反应的温度和时何对测崔结果的影响称取30.00g全脂奶粉,洛干200ml蒸懾水中.加入jy$i0.6000g(E/S=2%rW/W),于沿度389,pH85(以30%NaOH溶液维持pH)的条件下进行水解水解30min后，立即将水解液于90C灭酶处理lOmin.然后f-GN-Tyr-Afj改境血的址Gh图1GlyGlyTyrA咚四肚标准曲连F

9、ig.1StatxhrdcurveofGly-Gly-Tw-Arg冷却至室温,冷裁保存备用。准确凰取50.伽1水解液.f250ml容量瓶中定容,2.2.1反应温度的彫响取六支试管,于每一支试管中均加入40ml上述溶液.再加入4.0ml10%的TCA。将15号试管分别于60.70.80.90和HMTC加热处理I5mim0号试管不进行加热处理.來逞下放涿I5min雉而按标准程中测定OD值.平行测定一次，实輪结果见茨I。*1反应温皮対测定结工的彭响TabicIInfluenceofreactiontemperatureonOD反应浪瞭C)607080901C0S3OD-fi0.4500.4490.4

10、460.4400.445Q442由上表可以看出,虽然经过不同富度处理,但各组所测得的ODfft大体一致.也就是说.反应温度对测定结果的影响不是很明显，故不进行加热处理.而让其任空温下反应。反磁时间的形响取六支试骨，分别加入上述溶液4,0ml.10%的TCA溶液4.0ml于振荡器上混合均匀,分别于室温下放賈0、30、60.90、120和150min继而按标准程净测定OD値.平行测定一次.结果见农2.2反滋时问对测定结奧的彩响Tabk2Influenceofreacuoaumeondeurmineresults反应时(帥迢)030608120150OD0.4430.4420.4420.4420.4

11、410.441由上表可以看出,反应时何对测定结果几乎没有影哨这就是说TCA能迅速使蛋口质沉淀下來.反臧速度很快。故在瀝合均匀后即可进行下面的实验,而无需等待0回收率实验配制4.0mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肚水落液，按标准祝仔测定其屮餌胧实毅葩复&次结果见农3标来妣的回攻李Tabic3Yieldofstandaidpeptide攔定Siififipgfml)CD收车(冬)Glv-Gly-Tyr-Ai?3.98士0.034.099.5士0.75GlyGyTyrArg4全脂坍轻3.750.054.093.81.3分析檢验食品科学2005.Vol.26.No.7171与理论似几乎完全

12、吻令回收率为99.5%0.75%,用10%的全脂奶粉水洛液配制4.0mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肚溶液，按标准程序测定其中多肽含比实觀重复六次.结果见表3.回收率为93.8%13%.全脂奶粉中的矿物质彭响体系的OD诜这在后埃试险中将有所涉及。梢密度测试配制40mpml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽水溶液,按相同程序进行6轮平行测定.以检脸测定程序的精巒度，结果见农翟4Table4Precisionexperiment&Xc4氐Xu比Sa13.954.00-0.050.00250.0012523.953.950.000.0000034.004.100.100.01000.0

13、0544.053.950.100.01000.00553.954.00-0.050.00250.0012S64003.950.050.0025000125Z47.850.050X)2750.0137S注：In和尬为平行5?为方差。精密度SEES】严为0.0479(n为测定轮数),标准備差g(G/x)X100(x为测定平均值为1.2%,平均ffl7y3.99mg/ml应用硏充251全脂妬粉.夫豆蛋白粉和大切拔样中的初比含量W10%If全脂奶粉，10%的腕脂奶粉.10%的大豆分离蛋白.10%的脱脂大豆蛋门粉和2.()mg/ml的大豆狀样按标准程斤测定OD值，结果见农5。*5全腊删大豆龙白松和大豆肪

14、佯中的多咬含丘Table5Peptidescotiteniofwholeniilkpouder.soybeanproteinpowderandsoybeanpeptidesRI&尘脂大亘分职廃大豆W馳高蛍日證日粉odS0.060-0.0600.0800.04S0.446由表5可以看出.奶粉溶液能使体系的OD值偏低1.6和1.8mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Aig四肽标准溶液，然后分別取6.0ml标准溶液，加入4.01111双缩腺试剂，混合均匀，静置10miib2000r/min离心lOmiib取上清液于540IU11F测定0D值(以第一管做空白对照)。以肽的浓度为横坐标X(mg.iul)

15、,0D值为纵坐标Y,制作标准曲线。2多肽含量的测定多肽含量的测定程序：取2.51111样品溶液，加入2.5111110%(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液，丁漩涡混合仪上混合均匀，静置10mm然后在4000i/miu下离心15miib将上清液全部转移到50ml容量瓶中,并用5%的TCA定容至刻度,摇匀。然后取6.0ml上述溶液置另-试管屮，加入双缩腺试剂4.0ml(样液:双缩腺试剂=3:2,V/V),于漩涡混合仪上混合均匀，静置lOmiib2000i7min离心lOmim取上清液于540nm下测定OD值，对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度C(mg/ml),进而可求得样品中多肽含量。所需试剂：大豆蛋白、木瓜蛋白幽、三氯乙酸、Glv-Gly-Tyr-Aig四肽标准溶液、氢氧化钠、硫酸铜双缩腮配制方法：先将双缩淼试剂A加入组织样液，振荡均匀(必须营造碱性环境)，再加入双缩脉试剂B,振荡均匀。双缩服试剂A的成分是氮純化钠的质虽分数为0.1g/niL的水港液；双缩服试剂B